梁 佳， 馬依努·吾斯曼， 方志剛,*

(1.喀什大學(xué)生命與地理科學(xué)學(xué)院，新疆 喀什 844000；2.新疆帕米爾高原生物資源與生態(tài)重點實驗室，新疆 喀什 844000)

全球干旱和半干旱地區(qū)面積占總土地面積的35%，我國干旱、半干旱區(qū)面積占土地總面積的近50%[1-2]。水分是影響干旱區(qū)植物生長、產(chǎn)量及品質(zhì)形成的首要因素[3-4]，環(huán)境中水分缺乏即干旱脅迫首先影響植物種子萌發(fā)及幼苗生長[5]。干旱脅迫達到一定閾值時，會顯著抑制種子萌發(fā)和幼苗生長;嚴重的情況下，導(dǎo)致作物大幅減產(chǎn)，甚至發(fā)生植株死亡的現(xiàn)象[6]。種子引發(fā)是一項控制種子緩慢吸水并逐步回干的處理技術(shù)，它對許多植物前期的生長有重要作用，可促進種子萌發(fā)、提高幼苗抗逆性[7]。用外源生長物質(zhì)(植物激素和植物生長調(diào)節(jié)劑)引發(fā)種子是一項種子引發(fā)技術(shù)，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，如在干旱環(huán)境中經(jīng)褪黑素(melatonin，MT)引發(fā)的棉花(GossypiumhirsutumL.)種子和水楊酸(salicylic acid，SA)引發(fā)的小冠花(Coronillavaria)種子均可不同程度地提高其發(fā)芽率[8-9]。采取種子引發(fā)技術(shù)，促進干旱環(huán)境中的作物種子萌發(fā)，對旱區(qū)作物幼苗建成、抗逆性提高及產(chǎn)量形成十分重要。

甜高粱(SorghumbicolorL.)，一年生C4植物，抗旱性較強，作青貯飼料平均產(chǎn)量可達82.5 t·hm-2[10]，也可為造紙及制備生物乙醇提供原料，其開發(fā)潛力巨大[11]。盡管已有研究表明，外源生長物質(zhì)引發(fā)可調(diào)節(jié)甜高粱種子的萌發(fā)效應(yīng)，如經(jīng)亞精胺(spermidine，Spd)引發(fā)可以增強甜高粱幼苗的抗旱性[12]。但大多數(shù)研究僅停留在單一外源生長物質(zhì)引發(fā)對甜高粱種子萌發(fā)的影響，缺乏評價多種外源生長物質(zhì)引發(fā)對甜高粱種子萌發(fā)期抗旱效應(yīng)的比較。本研究以甜高粱品種‘大力士’為材料，探究干旱條件下外源生長物質(zhì)[褪黑素(MT)、水楊酸(SA)、5-氨基乙酰丙酸鹽酸鹽(5-aminolevulinic acid hydrochloride，5-ALA)、α-萘乙酸(1-naphthalene acetic acid，NAA)、赤霉素(gibberellin，GA3)、24-表油菜素內(nèi)酯(epibrassinolide，EBR)和胺鮮酯(diethyl aminoethyl hexanoate，DA-6)]引發(fā)處理種子后的萌發(fā)效應(yīng)，篩選促進甜高粱種子萌發(fā)最佳的外源生長物質(zhì)及其濃度配比，以期為旱區(qū)種植甜高粱提供可行操作方法、為促進種子萌發(fā)提供可選擇的外源生長物質(zhì)，同時為上述外源生長物質(zhì)緩解甜高粱干旱脅迫的生理機制提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

選用甜高粱品種‘大力士’為材料。褪黑素(MT)、水楊酸(SA)、5-氨基乙酰丙酸鹽酸鹽(5-ALA)、α-萘乙酸(NAA)、赤霉素(GA3)和24-表油菜素內(nèi)酯(EBR)，購自北京索萊寶科技有限公司；胺鮮酯(DA-6)，購自上海麥克林生化科技有限公司；聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 試驗方法

7種生長物質(zhì)分別設(shè)置5個濃度梯度：0，0.125，0.25，0.5 和1.0 mmol·L-1。干旱脅迫用PEG模擬，根據(jù)前期預(yù)試驗結(jié)果，設(shè)定濃度為10%。選大小一致的甜高粱種子，用5% NaClO消毒20 min，去離子水洗凈后，吸水紙吸干水分。種子分別用上述外源生長物質(zhì)浸種引發(fā)2 h(20℃黑暗)后，用蒸餾水洗凈，水分回干后，記錄種子原始質(zhì)量。將處理好的種子分為兩組，一組均勻置于鋪有兩層濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)(直徑9 cm)，每皿25粒種子，每處理3次重復(fù)，向培養(yǎng)皿中加入8 mL10% PEG溶液；另有一組用蒸餾水引發(fā)2 h后，向其培養(yǎng)皿中加入8 mL蒸餾水作為對照。所有培養(yǎng)皿置于暗處，分別于 0，4，8，12和24 h記錄吸水量。待種子萌發(fā)后，將其置于植物培養(yǎng)室中繼續(xù)培養(yǎng)(光周期12 h/12 h，光照強度300 μmol·m-2·s-1，晝夜溫度32/25℃)，每天查看處理液，保持培養(yǎng)皿濕潤。第3天開始每天統(tǒng)計種子萌發(fā)數(shù)量，第7天測量其根長、芽長、鮮重及干重。

1.3 種子萌發(fā)相關(guān)指標測定

種子吸水量、發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)參考朱廣龍等[13]的計算方法。為消除其它環(huán)境因子對試驗產(chǎn)生的誤差，并評價7種生長物質(zhì)調(diào)節(jié)甜高粱種子萌發(fā)的抗旱效應(yīng)，試驗數(shù)據(jù)均采用標準化處理即指標相對值(處理指標值/對照指標值)進行統(tǒng)計分析。相對吸水量(relative water absorption，RWA)、相對發(fā)芽率(relative germination rate，RGR)、相對發(fā)芽勢(relative germination potential，RGP)、相對發(fā)芽指數(shù)(relative germination index，RGI)、相對活力指數(shù)(relative vitality index，RVI)采用Amooaghaie等[14]和Li等[15]方法計算。根據(jù)Fang等[16]方法計算相對根長(relative root length，RRL)、相對芽長(relative bud length，RBL)、相對鮮重(relative fresh weight，RFW)和相對干重(relative dry weight，RDW)。

1.4 不同生長物質(zhì)引發(fā)條件下甜高粱芽苗期抗旱性的綜合評價

參考Fang等[16]和段利萍等[17]的方法，用模糊數(shù)學(xué)中隸屬函數(shù)法建立綜合評價體系，分析種子在萌發(fā)期應(yīng)對干旱脅迫的能力。對同一外源生長物質(zhì)而言，其不同濃度引發(fā)處理種子后，用某一指標相對值的均值反映甜高粱種子萌發(fā)的抗旱效應(yīng)。通過建立綜合評價體系，系統(tǒng)地評價外源生長物質(zhì)引發(fā)處理種子后甜高粱在萌發(fā)期的抗旱能力。評價體系中有關(guān)隸屬函數(shù)及權(quán)重等的計算方法如下：

(1)

(2)

(3)

(4)

(5)

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 9.0繪圖；采用SPSS 20.0進行方差分析；聚類分析判定外源生長物質(zhì)引發(fā)條件下，甜高粱芽苗期抗旱效果的分類。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生長物質(zhì)引發(fā)對干旱脅迫下甜高粱種子吸水量的影響

如圖1所示，外源生長物質(zhì)及其濃度極顯著影響干旱脅迫下種子吸水量(P<0.01)。隨生長物質(zhì)濃度升高，MT，SA和EBR引發(fā)的甜高粱種子RWA先升高后降低。低濃度的5-ALA引發(fā)導(dǎo)致種子的RWA達峰值。NAA引發(fā)后，種子RWA變化不明顯。GA3引發(fā)種子后，其RWA隨濃度升高逐漸減小。相反，DA-6引發(fā)導(dǎo)致種子的RWA逐漸增加。不同引發(fā)處理中，當EBR濃度為0.125 mmol·L-1時，RWA最大。

圖1 不同濃度外源生長物質(zhì)對干旱脅迫下甜高粱種子相對吸水量的影響Fig.1 Effects of different concentrations of exogenous growth substances on relative water absorption of sweet sorghum seeds under drought stress注：**表示P<0.01。F1，F(xiàn)2，F(xiàn)3分別代表生長物質(zhì)、引發(fā)濃度和生長物質(zhì)與濃度交互作用的統(tǒng)計量值。下同Note:**Indicates P<0.01. F1,F2,F3 represents the statistical value of growth substance,priming concentration interaction between growth substance and concentration,respectively. The same as below

2.2 不同生長物質(zhì)引發(fā)對干旱脅迫下甜高粱種子萌發(fā)的影響

圖2表明，生長物質(zhì)、濃度及其交互作用均極顯著影響種子相對發(fā)芽率、相對發(fā)芽勢、相對發(fā)芽指數(shù)及相對活力指數(shù)(P<0.01)。干旱脅迫下，同一外源生長物質(zhì)引發(fā)后，隨其濃度增加，種子相對發(fā)芽率、相對發(fā)芽勢、相對發(fā)芽指數(shù)及相對活力指數(shù)總體均出現(xiàn)先升高后降低的趨勢，但其峰值取決于外源生長物質(zhì)濃度。如低濃度條件下，DA-6引發(fā)種子后，其相對發(fā)芽率和相對發(fā)芽指數(shù)最大(圖2A，C)。0.5 mmol·L-1的MT引發(fā)種子后，種子相對發(fā)芽勢和相對活力指數(shù)最大(圖2B，D)。種子經(jīng)0.25～0.5 mmol·L-1的5-ALA引發(fā)后，各項指標均為最小值。NAA濃度為0.125和1 mmol·L-1時，種子的相對發(fā)芽率、相對發(fā)芽指數(shù)及相對活力指數(shù)均為最小值(圖2B～D)。

圖2 不同濃度外源生長物質(zhì)對干旱脅迫下甜高粱種子相對發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)及相對活力指數(shù)的影響Fig.2 Effects of different concentrations of exogenous growth substances on relative germination rate,germination potential,germination index and relative vigor index of sweet sorghum seeds under drought stress

2.3 不同生長物質(zhì)引發(fā)對干旱脅迫下甜高粱幼苗生長的影響

圖3表明，生長物質(zhì)、濃度及二者交互作用均極顯著影響干旱脅迫下甜高粱幼苗生長(P<0.01)。隨生長物質(zhì)濃度增加，MT引發(fā)的幼苗各項指標均先增加后降低(圖3A～D)；經(jīng)NAA和DA-6引發(fā)的種子，幼苗相對干重亦出現(xiàn)相同的趨勢(圖3D)。然而，用0.25～1.0 mmol·L-1的NAA引發(fā)種子則顯著抑制了幼苗根長(圖3A)。0.125和0.25 mmol·L-1的5-ALA引發(fā)種子后，幼苗相對芽長與干旱脅迫相比無明顯變化(圖3B)。同樣，種子經(jīng)上述兩個濃度的5-ALA，NAA和GA3引發(fā)后，幼苗相對鮮重亦無明顯變化(圖3C)。用0.125 mmol·L-1的SA引發(fā)種子，幼苗相對根長、相對鮮重及相對干重均最大(圖3A，C和D)。但經(jīng)0.25～1.0 mmol·L-1NAA引發(fā)種子，幼苗相對根長及相對芽長均最小(圖3A～B)。MT濃度為0.25和0.5 mmol·L-1時，幼苗相對根長、相對芽長和相對鮮重值均最大(圖3A，C)。

2.4 不同生長物質(zhì)引發(fā)下甜高粱種子萌發(fā)期抗旱效應(yīng)

D值代表生長物質(zhì)及濃度配比下甜高粱種子萌發(fā)的抗旱效應(yīng)。由表1可知，相對吸水量(RWA)、相對活力指數(shù)(RVI)、相對根長(RRL)和相對芽長(RBL)的權(quán)重系數(shù)之和超過50%。MT(0.5 mmol·L-1)引發(fā)處理的綜合得分值最高，各處理綜合得分大小順序如下：MT(0.5)>SA(0.125)>MT(0.25)>GA3(0.125>EBR(0.125)>MT(1.0)>DA-6(0.125)>EBR(0.25)>SA(0.25)>MT(0.125)>GA3(0.25)>SA(0.5)>GA3(0.5)>SA(1.0)>5-ALA(0.125)>EBR(0.5)>DA-6(0.5)>EBR(1.0)>5-ALA(1.0)>DA-6(0.25)>5-ALA(0.25)>NAA(0.5)>5-ALA(0.5)>10%PEG>NAA(0.25)>GA3(1.0)>NAA(0.125)>DA-6(1.0)>NAA(1.0)(括號中數(shù)字后省略了濃度單位mmol·L-1，下同)。

圖3 不同濃度外源生長物質(zhì)對干旱脅迫下甜高粱幼苗相對根長、芽長、鮮重及干重的影響Fig.3 Effects of different concentrations of exogenous growth substances on relative root length,shoot length,fresh weight and dry weight of sweet sorghum seedlings under drought stress

表1 干旱脅迫下不同濃度生長物質(zhì)處理甜高粱的各測定指標的隸屬函數(shù)值Table 1 Subordinate function values of determination indexes of sweet sorghum treated with different concentrations of growth substances under drought stress

續(xù)表1

2.5 不同濃度生長物質(zhì)對緩解甜高粱干旱脅迫的聚類分析

基于綜合得分D值的聚類分析見圖4，當歐氏距離為5時，29個引發(fā)處理可分為5類。第1類引發(fā)處理是MT(0.5)，D值為0.926。0.561≤D≤0.725為第2類，有MT(0.25)和SA(0.125)兩個引發(fā)處理。0.464≤D≤0.619為第3類，包括5-ALA(0.125)，EBR(0.5)，DA-6(0.5)，SA(1.0)，GA3(0.5)，SA(0.5)，MT(1.0)，EBR(0.125)，MT(0.125)，GA3(0.25)，EBR(0.25)，DA-6(0.125)，SA(0.25)和GA3(0.125) 共14個引發(fā)處理。0.286≤D≤0.416為第4類，有10%PEG，NAA(0.5)，NAA(0.125)，DA-6(1.0)，NAA(0.25)，GA3(1.0)，5-ALA(0.5)，5-ALA(1.0)，EBR(1.0)，5-ALA(0.25)和DA-6(0.25) 共11個引發(fā)處理。D值為0.102為第5類，僅有NAA(1.0)1個引發(fā)處理。

圖4 基于綜合評價D值的聚類分析譜系圖Fig.4 Cluster analysis pedigree based on D value of comprehensive evaluation注：圖中數(shù)字1～29表示引發(fā)處理的綜合得分D值排名Note:The numbers 1～29 in the figure indicate the D-value ranking of the comprehensive score of priming treatments

3 討論

3.1 外源生長物質(zhì)引發(fā)對干旱脅迫下甜高粱種子吸水量、萌發(fā)能力及幼苗生長的影響

種子吸水萌發(fā)及幼苗建成是植物順利完成生活史的關(guān)鍵時期，容易受到環(huán)境因子及化學(xué)信號調(diào)控[18]。環(huán)境中水分虧缺即干旱脅迫可導(dǎo)致種子萌發(fā)、幼苗生長受到抑制[19]，其外部形態(tài)指標主要包括發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、幼苗根長及干物質(zhì)質(zhì)量等[20]。采用PEG模擬干旱脅迫，并結(jié)合種子引發(fā)技術(shù)，探討種子在干旱脅迫下的萌發(fā)效應(yīng)，具有周期短、便于操作，適合大量材料開展的優(yōu)勢，具有一定的科學(xué)性[21]。本試驗中，10% PEG處理下，甜高粱種子發(fā)芽率約為對照的87%(圖1～3)，同樣用10% PEG模擬干旱脅迫處理的玉米(ZeamaysL.)種子發(fā)芽率約為對照的74%[22]，表明甜高粱可能更適宜在旱區(qū)種植。

許多研究表明，種子發(fā)芽及苗期的形態(tài)學(xué)指標(吸水量、發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)及根長)既可用于表征植物抗旱性，也可用于評價外源生長物質(zhì)對植物抗旱能力的調(diào)節(jié)作用[23]。在旱區(qū)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，用植物激素及生長調(diào)節(jié)劑引發(fā)種子，可通過調(diào)節(jié)種子萌發(fā)效應(yīng)和幼苗群體建成以應(yīng)對干旱環(huán)境[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，在相同濃度條件下，不同生長物質(zhì)引發(fā)處理后，種子萌發(fā)的單項指標存在較大差異。例如，當SA引發(fā)濃度為0.125 mmol·L-1時，甜高粱種子根長約為對照的88%，用同等濃度的DA-6引發(fā)處理的根長約為對照41%(圖3A)；MT為0.5 mmol·L-1引發(fā)處理種子后，甜高粱芽長達到峰值，約為對照的91%，而NAA引發(fā)處理芽長為最小值，僅為對照44%(圖3B)，這與干旱脅迫條件下，赤霉素(GA3)、吲哚乙酸(indole-3-acetic acid)、6-芐基氨基嘌呤(6-BA)引發(fā)處理玉米(ZeamaysL.)種子的研究結(jié)果相似[25]，均表現(xiàn)出外源生長物質(zhì)對種子萌發(fā)及幼苗生長的濃度效應(yīng)。另一方面，用同一生長物質(zhì)，其不同濃度引發(fā)處理對種子萌發(fā)的影響也存在差異。本研究中，甜高粱種子隨MT濃度增加，所有指標表現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(圖1-3)；經(jīng)0.125 mmol·L-1的GA3引發(fā)處理，甜高粱種子吸水量約為對照的87%，當GA3濃度為1.0 mmol·L-1時，種子吸水量約為對照的51%(圖1)，在水楊酸(SA)引發(fā)處理小冠花(Coronillavaria)種子萌發(fā)期抗旱脅迫的研究中，也得到類似的結(jié)果[20]。此外，本試驗還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)EBR處理后，甜高粱種子的相對發(fā)芽指數(shù)及相對根長與干旱脅迫處理相比均無明顯變化，但相對活力指數(shù)較10% PEG處理明顯提高，這有可能和種子的引發(fā)時間有關(guān)。齒緣吊鐘花(Enkianthusserrulatus)種子經(jīng)赤霉素(GA3)引發(fā)6 h和24 h，其種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢也出現(xiàn)明顯差異[26]。上述研究結(jié)果說明生長物質(zhì)對種子萌發(fā)還存在時間效應(yīng)。綜合來看，外源生長物質(zhì)引發(fā)對植物萌發(fā)既有正向作用的調(diào)節(jié)，也有負向作用調(diào)節(jié)，只有適宜的生長物質(zhì)及濃度配比，才可有效的提高植物抗旱脅迫能力[27]。

3.2 評價甜高粱種子萌發(fā)期抗旱效應(yīng)的方法

本試驗條件下，甜高粱種子在相同濃度下，經(jīng)不同外源生長物質(zhì)引發(fā)處理，其萌發(fā)及幼苗生長均表現(xiàn)出較大差異。此外，對同一萌發(fā)指標而言，不同生長物質(zhì)間亦存在較大差異。因此，用單個指標確定某一種外源生長物質(zhì)提高甜高粱在芽苗期的抗旱性具有片面性。相反，用隸屬函數(shù)建立的綜合評價體系可以同時評價多個指標，減少單個參數(shù)帶來的誤差[28-29]?；诖?，本研究根據(jù)綜合評價體系，用綜合得分值量化了不同生長物質(zhì)及濃度配比引發(fā)種子后甜高粱在芽苗期應(yīng)對干旱脅迫的效應(yīng)。試驗結(jié)果表明相對吸水量(RWA)、相對活力指數(shù)(RVI)、相對根長(RRL)和相對芽長(RBL)的權(quán)重之和超過50%，說明上述4個指標在本試驗的評價體系中占主導(dǎo)地位。胡丁雪等采用綜合評價法，認為相對發(fā)芽率、相對根長、相對鮮重和相對發(fā)芽勢可作為評價甘藍型油菜(BrassicanapusL)在萌發(fā)期耐鹽脅迫的主要指標[30]。該結(jié)果與本試驗不同，這可能與試驗處理、指標數(shù)量及種子遺傳特性等有關(guān)。

3.3 外源生長物質(zhì)引發(fā)對甜高粱萌發(fā)期抗旱效應(yīng)的影響

利用聚類分析對本研究的29個處理進行分類，第4類引發(fā)處理綜合得分值為0.102～0.416，其中包括得分0.320的干旱脅迫處理，這類處理對提高種子萌發(fā)抗旱效果不大。第1，2類MT(0.5 mmol·L-1)和MT(0.25 mmol·L-1)，SA(0.125 mmol·L-1)引發(fā)甜高粱種子，可提高干旱脅迫下種子萌發(fā)和幼苗生長能力，其中MT(0.5 mmol·L-1)引發(fā)效果最優(yōu)，具體表現(xiàn)為種子萌發(fā)率沒有受抑制，種子相對發(fā)芽勢、相對發(fā)芽指數(shù)、相對活力指數(shù)均為最大值(圖2B-D)。結(jié)合旱區(qū)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)水分不足這一現(xiàn)狀，本試驗推薦0.5 mmol·L-1的MT引發(fā)甜高粱種子，有助于提高甜高粱在芽苗期的抗旱能力及幼苗群體形態(tài)建成。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，外源生長物質(zhì)及其濃度均極顯著影響干旱脅迫下甜高粱種子萌發(fā)及幼苗生長。適宜濃度的生長物質(zhì)引發(fā)種子可提高甜高粱在芽苗期的抗旱效應(yīng)。利用隸屬函數(shù)建立綜合評價體系，確定了甜高粱種子經(jīng)外源生長物質(zhì)引發(fā)后，其萌發(fā)期的抗旱效應(yīng)。其中MT，SA，GA3，EBR和DA-6在適當濃度引發(fā)種子后，均能有效促進種子萌發(fā)和幼苗生長，而MT(0.5 mmol·L-1)引發(fā)種子后的效果最佳。本試驗得到的評價體系，為篩選促進植物種子萌發(fā)的外源生長物質(zhì)提供了是一種快速、有效的方法。