吳建波， 王小丹

(中國科學院申扎高寒草原與濕地生態(tài)系統(tǒng)觀測試驗站； 山地表生過程與生態(tài)調控重點實驗室，中國科學院、水利部成都山地災害與環(huán)境研究所， 四川 成都 610041)

氮元素作為高寒草地生態(tài)系統(tǒng)主要限制營養(yǎng)元素之一，其含量增加勢必影響土壤物質循環(huán)過程，尤其是已經適應氮限制的土壤物質循環(huán)過程[1]。從資源分配理論上來說，土壤氮含量增加會提高碳和磷相關土壤酶活性[2-3]，然而，高寒草地生態(tài)系統(tǒng)氮添加對碳水解酶和磷酸酶活性影響呈降低、提高或無影響，結論并不一致[4-8]。這可能是由于氮添加不僅影響土壤氮含量，還改變土壤pH、提高地上和地下生物量、增加植物組織氮含量、改變高寒草原植物群落組成和微生物數量與群落組成[9-15]。因此，土壤酶活性可能受到土壤氮有效性、土壤酸化以及植物和微生物群落的相互影響。

土壤氮含量增加會引起土壤酸化，改變酶分子構象直接影響酶活性[8,16-20]；土壤氮含量增加提高水解酶的活性，通過改變酶的底物直接降低氧化酶活性[21]；土壤氮含量增加直接影響地上和地下生物量以及植物組織氮含量，間接影響土壤酶活性[8,22]；土壤氮含量增加會引起植物和微生物磷限制，植物和微生物通過增加磷水解酶活性緩解磷限制[23-25]。土壤酶活性在氮添加后發(fā)生變化進而影響土壤養(yǎng)分循環(huán)過程[8,11,20,23-25]。因此，研究土壤酶活性對氮增加的響應及其影響土壤酶活性主要因素，對預測土壤養(yǎng)分循環(huán)以及土壤養(yǎng)分釋放具有重要意義。本研究擬通過對高寒草原通過添加氮素模擬氮沉降，從土壤-微生物-植物系統(tǒng)分析土壤酶活性在氮添加后變化趨勢及其與環(huán)境因子相互關系，以期揭示土壤酶變化趨勢及其主要影響因子，為高寒草原土壤物質循環(huán)過程適應氣候變化提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地點

氮添加試驗在西藏自治區(qū)那曲市申扎縣中國科學院高寒草地與濕地生態(tài)系統(tǒng)觀測試驗站開展(30°57′ N,88°42′ E,海拔4 675 m)。該區(qū)域氣候屬于高原亞寒帶干旱季風性氣候，年降水量大約為298. 6 mm，降雨主要發(fā)生在5～9月，降水量的季節(jié)和年際變化非常大。申扎縣年均太陽輻射為2 915.5 h，年均溫為0.4℃，最暖月均溫為6～12℃。無霜期短，植物生長期大約120天。年平均風速為3.8 m·s-1，冬季多大風，8級以上大風達104.3天[26]。土壤類型為高山草原土，土壤含沙量接近77%，土壤pH約為8.2。試驗場地自2013年開始圍封，試驗草地圍封前屬于中度退化。植物群落以紫花針茅(Stipapurpurea)和青藏苔草(Carexmoorcroftii)為優(yōu)勢種，昆侖蒿(Artemisiananschanica)和弱小火絨草(Leontopodiumnanum)為伴生種，植被覆蓋度大概在30%左右。

1.2 試驗設計

試驗于2013年6月開始，采用拉丁方區(qū)組設計，模擬氮沉降量添加氮(N)的量為0 g·m-2(CK)，2 g·m-2(N2)，5 g·m-2(N5)和 10 g·m-2(N10)，共4個處理，每個處理設6個重復，樣地共劃分24個面積均為4 m×4 m的固定樣地，樣地之間設有l(wèi) m寬的緩沖隔離帶(圖1)。用硝酸銨作為模擬氮沉降的氮源，將硝酸銨分兩次在每年的6月和7月添加，將相應質量的硝酸銨溶解在1 L水中，然后噴灑每個樣地內。在CK樣地內噴灑1 L水。

圖1 試驗景觀圖Fig.1 The aerial map of experiment

1.3 采樣

在2017年8月中旬，在每個樣地內選取1 m×1 m的樣方，用剪刀采集地上部植物，并收集凋落物；然后在1 m×1 m的樣方內中間選取0.5 m × 0.5 m的樣方，用直徑6 cm土鉆，采用對角線法采集0～20 cm的土壤，用孔徑2 mm土壤篩將采集土壤中的植物根系挑出，然后將土壤混勻，取1份放入保溫箱內，帶回實驗室放入冰箱，4℃保存，進行土壤理化性質、微生物特征和土壤酶活性分析。將地上部帶回實驗室，將其放入烘箱105℃，殺青20 min。將洗凈的根系、凋落物和殺青后的地上部放入烘箱內，70℃烘干48 h，然后用電子天平稱重(0.01 g)。

1.4 分析測試方法

土壤pH值采用玻璃電極法按土水比1∶2.5測定[27]；土壤有機質含量采用重鉻酸鉀滴定法測定[27]；可溶性有機碳含量利用超純水浸提-有機碳分析儀(Multi N/C 3100,Analytik,Germany)測定[28]。全氮含量采用半微量凱氏定氮法測定[27]；全磷含量采用高氯酸-硫酸-鉬銻抗法比色法測定[26]；有效磷含量采用碳酸氫鈉-鉬銻抗法比色法測定[27]；銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和可溶性總氮含量采用連續(xù)流動分析儀(AA3)直接測定[29]；土壤可溶性有機氮含量用可溶性總氮減去硝態(tài)氮和銨態(tài)氮[14]；根系纖維素和根系木質素含量采用范式纖維素法測定[30]。纖維素酶、蔗糖酶、過氧化氫酶、多酚氧化酶、脲酶和中性磷酸酶活性采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒，依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，經過溫育并徹底洗滌，用底物顯色后，用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度(OD值)，計算樣品濃度[31]。微生物碳和微生物氮含量采用氯仿熏蒸法測定[32]。細菌和真菌數量采用實時熒光定量PCR方法測定[33]。

1.5 統(tǒng)計分析

土壤酶活性對不同氮添加水平的響應采用單因素方差分析(Duncan’s post-hoc檢驗，P<0.05)；土壤酶活性與植物特征、土壤特征和微生物特征相關性采用Pearson相關性分析(雙尾)。單因素方差分析和相關性分析采用軟件SPSS 21.0(SPSS,Inc.,Chicago,USA)分析。為了消除數據的不穩(wěn)定性和異方差性，將植物特征、土壤特征、微生物特征和酶活性數據進行自然對數ln(x+1)轉換，然后采用軟件Canoco 5.0 (Microcomputer Power,Ithaca,NY,USA)進行冗余分析。

2 結果與分析

2.1 土壤酶活性對氮添加的響應

氮添加顯著影響了高寒草原土壤酶活性(表1)。蔗糖酶、纖維素酶、多酚氧化酶和過氧化氫酶活性隨著氮添加濃度增加而顯著降低，纖維素酶活性從3 611.64 U·g-1顯著降到2 152.89 U·g-1(P<0.05)；蔗糖酶活性從3.17 U·g-1顯著降到1.87 U·g-1(P<0.05)，多酚氧化酶活性從21 013.98 U·g-1顯著降到13 903 U·g-1(P<0.05)，過氧化氫酶活性從3.26 U·g-1顯著降到1.84 U·g-1(P<0.05)。但是脲酶和中性磷酸酶活性隨著氮添加濃度增加而顯著增加，脲酶活性從350.92 U·g-1顯著增加到536.23 U·g-1(P<0.05)，中性磷酸酶活性從0.42 U·g-1顯著增加到0.66 U·g-1(P<0.05)。

表1 氮添加對土壤酶活性的影響Table 1 Changing of soil enzyme activitity under different amount of nitrogen addition

2.2 植物特征對氮添加的響應

氮添加顯著影響了高寒草原植物群落特征(表2)。根系生物量和凋落物量隨著氮添加濃度增加而顯著增加，根系生物量從28.18 g·m-2顯著增加到46.36 g·m-2(P<0.05)；凋落物量從0.33 g·m-2顯著增加到6.61 g·m-2(P<0.05)。根系纖維素含量不受氮添加的影響。根系木質素含量隨著氮添加濃度增加而顯著降低，從61.68 %顯著降低到37.48%(P<0.05)。

表2 氮添加對植物特征的影響Table 2 Changes in plant property under different amount of nitrogen addition

2.3 土壤特征對氮添加的響應

氮添加顯著影響了部分土壤特征(表3)。土壤pH、土壤有機質含量、土壤總氮含量和有效磷含量未顯著受到氮添加的影響?？扇苄杂袡C碳含量、硝態(tài)氮含量、銨態(tài)氮含量和可溶性有機氮含量隨著氮添加量的增加逐漸增加?？扇苄杂袡C碳含量從13.93 mg·kg-1逐漸增加到17.87 mg·kg-1(P<0.05)。硝態(tài)氮含量從9.16 mg·kg-1逐漸增加到26.56 mg·kg-1(P<0.05)。銨態(tài)氮含量從0.63 mg·kg-1逐漸增加到2.37 mg·kg-1(P<0.05)。可溶性有機氮含量從3.93 mg·kg-1逐漸增加到9.77 mg·kg-1(P<0.05)。總磷含量氮添加后顯著降低，從0.43 g·kg-1逐漸降到0.41 g·kg-1(P<0.05)。

2.4 土壤酶活性與土壤理化特征相關性分析

Pearson相關性分析結果表明蔗糖酶、纖維素酶、多酚氧化酶和過氧化氫酶活性與土壤可溶性有機碳含量呈現(xiàn)顯著的負相關關系(表4，分別為：R2=—0.995，P<0.01；R2=—0.984，P<0.05；R2=—0.988，P<0.05；R2=—0.999，P<0.01)；蔗糖酶、纖維素酶、多酚氧化酶和過氧化氫酶活性與可溶性有機氮含量呈顯著負相關關系(表4，分別為：R2=—0.969，P<0.05；R2=—0.966，P<0.05；R2=—0.952，P<0.05；R2=—0.987，P<0.05)；蔗糖酶和多酚氧化酶與銨態(tài)氮含量呈顯著負相關關系(表4，分別為：R2=—0.952，P<0.05；R2=—0.970，P<0.05)。脲酶和中性磷酸酶活性與土壤可溶性有機碳含量呈顯著正相關關系(表4，分別為：R2=0.973，P<0.05；R2=0.980，P<0.05)；脲酶和中性磷酸酶活性與銨態(tài)氮含量呈顯著正相關關系(表4，分別為：R2=0.980，P<0.05；R2=0.975，P<0.05)。

表3 土壤特征對不同氮添加水平的響應Table 3 Changes in soil property under different amount of nitrogen addition

表4 土壤特征與土壤酶活性Pearson相關性分析Table 4 Correlationship between soil properties and soil enzyme activity by Pearson analysis

2.5 土壤酶活性與植物特征相關性分析

Pearson相關性分析結果表明蔗糖酶、纖維素酶、多酚氧化酶和過氧化氫酶活性與凋落物量呈顯著負相關關系(表5，分別為：R2=-0.975，P<0.05；R2=-0.982，P<0.05；R2=-0.970，P<0.05；R2=-0.994,P<0.01)；纖維素酶、多酚氧化酶和過氧化氫酶活性與根系木質素含量呈顯著正相關關系(表5，分別為：R2=0.964，P<0.05；R2=0.957，P<0.05；R2=0.963，P<0.05)；脲酶和磷酸酶與凋落物量呈顯著正相關關系(表5，分別為：R2=0.981，P<0.05；R2=0.981，P<0.05)。

表5 植物特征與土壤酶活性Pearson相關性分析Table 5 Correlationship between plant properties and soil enzyme activity by Pearson analysis

2.6 土壤酶活性與微生物特征相關性分析

Pearson相關分析結果表明蔗糖酶、纖維素酶、多酚氧化酶和過氧化氫酶活性與微生物碳含量呈顯著的負相關關系(表6，分別為：R2=-0.969，P<0.05；R2=-0.996，P<0.05；R2=-0.987，P<0.05；R2=-0.983，P<0.01)。脲酶和磷酸酶活性與微生物碳含量呈顯著的正相關關系(表6，分別為：R2=0.990，P<0.01；R2=0.992，P<0.01)。

表6 微生物特征與土壤酶活性Pearson相關性分析Table 6 Correlationship between soil microbial properties and soil enzyme activity by Pearson analysis

2.7 土壤酶活性冗余分析

冗余分析(RDA)結果表明：第一和二排序軸累計解釋率分別為98.75%和0.72%(圖2)，RDA前2個排序軸保留了土壤酶活性數據總方差的99.47%，即各環(huán)境要素中植物特征3個因子(根系木質素含量、根系纖維素含量和凋落物量)解釋了土壤酶活性特征的99.47%。根系木質素含量對蔗糖酶、纖維素酶、多酚氧化酶和過氧化氫酶活性影響較大，而凋落物量和根系纖維素含量對脲酶和中性磷酸酶活性影響較大(圖2)。

圖2 土壤酶活性與土壤、微生物和植物特征冗余分析(RDA)Fig.2 Redundancy analysis between soil enzyme activity and soil,plant and microbial properties

3 討論

3.1 氮添加對高寒草原土壤酶活性的影響

氮添加顯著影響了高寒草原土壤酶活性。蔗糖酶和纖維素酶活性在氮添加后顯著降低(P<0.05，表1)，這與在高寒草甸研究結果相一致[4-5]。從相關性分析可以看出蔗糖酶和纖維素酶與微生物碳和可溶性有機碳呈顯著負相關關系(表4，6)，這可能是由于氮添加增加植物根部生長，增加根系分泌物，微生物會優(yōu)先利用相對易分解的底物，從而減少了土壤有機質的分解[34-38]。過氧化氫酶和多酚氧化酶活性在氮添加顯著降低(P<0.05，表1)，這與草地生態(tài)系統(tǒng)研究結果相一致[2,39]。氧化酶對木質素降解、腐殖化、碳礦化和溶解有機碳輸出具有重要作用[40]，相關性分析表明氧化酶活性與根系木質素含量呈顯著的正相關關系，氮添加會降低了根系木質素含量(P<0.05，表2)，另外氮添加增加了根系生物量和凋落物量，進入土壤的都是新鮮的植物殘體，為酚氧化酶所利用形成腐殖質的底物較少[41]，從而降低了氧化酶活性[42-43]。土壤脲酶活性在氮添加顯著提高(P<0.05，表1)，這與Jian等meta分析結果一致[24]。相關性分析結果表明脲酶活性與銨態(tài)氮的濃度呈正相關關系。脲酶主要來自植物根系的分泌物[44]，而氮添加促進了植株根系的生長，導致根系分泌物增加，增強脲酶活性。另外，微生物喜好低分子量的有機氮，也會增加脲酶活性[44,46]。磷酸酶活性在氮添加顯著提高(P<0.05，表1)，這與范珍珍等meta分析結果相一致[25]。相關性分析結果表明磷酸酶活性與微生物碳、可溶性有機碳和銨態(tài)氮含量呈顯著的正相關關系，從資源分配理論來說，由于氮添加增加了植物和微生物磷的限制[47-49]，植物和微生物提高磷酸酶活性緩解磷限制[11,23,50]，增加土壤中可利用的有效態(tài)磷[4,23,39,51]。

3.2 影響高寒草原土壤酶活性的主要驅動機制

通過對土壤酶活性與植物、微生物和土壤特征冗余分析，結果表明土壤酶活性主要受到植物特征(凋落物量、根系纖維素含量和根系木質素含量)的影響。許多研究表明氮添加導致土壤pH降低，直接或間接影響土壤酶活性[8,16-20,52]。但在本研究中，土壤pH沒有顯著受到氮添加的影響(表3)，Pearson分析結果也表明土壤pH與土壤酶活性不存在顯著相關關系。因此，在氮添加后，土壤pH不是影響土壤酶活性的主要因素。

氮添加增加土壤中可利用氮素(銨態(tài)氮)含量(表3)，緩解了氮素對高寒草原植物生長的限制，根系生物量的提高會增加根系分泌物進入土壤中[34-38]，同時顯著增加凋落物量，降低了根系木質素含量(P<0.05，表2)，這會改變微生物對碳源的利用，優(yōu)先利用易分解的碳源和氮源[8,45-46,53-54]，導致纖維素酶、蔗糖酶和氧化酶活性降低[35-36,55]。根據資源分配理論，由于氮添加增加了植物和微生物的磷限制，磷缺乏會刺激植物磷饑餓反應增加磷的吸收，促進根系分泌物(包括有機酸、激素和化感物質等[56-58])增加，進而引起植物調節(jié)根系微生物組成，增加磷酸酶活性，例如通過與叢枝菌根真菌及其共生內生菌協(xié)作來滿足磷的營養(yǎng)吸收[59-60]。

4 結論

在高寒草原生態(tài)系統(tǒng)中，氮添加5年后對土壤pH不存在顯著影響，但是緩解了植物生長氮限制。氮添加增加根系生物量、凋落物量和降低了根系木質素含量，增加土壤中易分解的碳資源含量，這導致與碳相關的水解酶活性(蔗糖酶、纖維素酶活性、多酚氧化酶和過氧化氫酶)下降。根據資源分配理論，氮添加增強了植物和微生物生長的磷限制，導致磷酸酶活性增加。綜上所述，氮沉降引起的植物特征變化是導致土壤酶活性變異的主要因素。