李 波， 李晨陽， 李 紅， 楊 曌

(1.齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院， 抗性基因工程與寒地生物多樣性保護(hù)黑龍江省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院， 黑龍江 齊齊哈爾161005)

低溫冷害嚴(yán)重影響了牧草的生長發(fā)育，制約了牧草的種植地域分布，是影響牧草越冬的關(guān)鍵因素之一[1]。利用分子育種技術(shù)提高作物的抗低溫能力是近年來的研究熱點(diǎn)，但植物對低溫的抗性是一個復(fù)雜的數(shù)量性狀，單一的基因無法完全提高植物抗低溫能力[2]。植物在逆境條件下產(chǎn)生復(fù)雜的生理生化響應(yīng)來抵御低溫脅迫[3]。我國北方地區(qū)冬季寒冷，年平均氣溫偏低，導(dǎo)致牧草在春末返青晚，影響牧草在秋季的利用價值，提高牧草的抗低溫能力是解決牧草在我國北方地區(qū)利用價值是一大難題。

紫花苜蓿(MedicagoSativaL.)作為多年生草本植物，因其具有適應(yīng)性廣、產(chǎn)量高、抗寒、耐鹽堿、固氮能力強(qiáng)等特點(diǎn)，在我國北方廣泛種植，是全球范圍內(nèi)極具栽培價值的牧草之一[4]。近年來，紫花苜蓿抗寒能力的研究多集中在對低溫脅迫下各生理指標(biāo)變化及其抗寒能力綜合評價。鄧雪柯等人[5]對苜蓿在低溫脅迫下的生理生化特性變化研究發(fā)現(xiàn)，在4℃處理下葉片的超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)活性呈先升高后下降趨勢，脯氨酸(Proline，Pro)含量隨冷處理時間增加呈增加趨勢，在高于—3℃低溫脅迫時，葉片的電導(dǎo)率呈緩慢增加趨勢，該紫花苜蓿可以耐受—3℃的低溫；陶雅等人[6]通過對3個紫花苜蓿品種抗寒生理適應(yīng)性研究發(fā)現(xiàn)，苜蓿根內(nèi)可溶性糖(Soluble sugar，SS)、全氮、游離Pro和游離氨基酸含量會在秋冬季一直保持較高水平，春季返青時下降，苜蓿根內(nèi)丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量在秋季升高，在晚秋隨氣溫下降而降低，‘阿爾岡金’抗寒性最強(qiáng)，‘金皇后’次之，‘甘農(nóng)3號’最差；秘一先等人[7]發(fā)現(xiàn)俄羅斯雜花苜蓿和3個紫花苜蓿抗寒品系溫度閾值上限可溶性糖和可溶性蛋白為0℃，脯氨酸和丙二醛為4℃，SOD、過氧化氫酶(Catalase，CAT)、抗壞血酸過氧化物酶(Aseorbate peroxidase，APX)及谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase，GPX) 活性低溫處理下的變化差異不顯著。關(guān)于苜蓿對低溫脅迫的響應(yīng)已被廣泛關(guān)注，但在控制溫度進(jìn)程和全面分析低溫對苜蓿的生理代謝作用方面仍有待完善。本研究對‘龍苜807’苜蓿幼苗短期低溫脅迫的機(jī)理進(jìn)行了初步的研究，篩選抗低溫作用敏感指標(biāo)，旨為苜蓿低溫脅迫的生理響應(yīng)奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用‘龍苜807’苜蓿種子(MedicagoSativa‘Longmu No.807’)由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院提供，其籽粒千粒重為2.0 g，種子發(fā)芽率為98%。

1.2 幼苗的培養(yǎng)

2019年5月15日，使用育苗缽(高度 13 cm、下口徑14 cm、上口徑16 cm)對供試材料進(jìn)行土培種植，培養(yǎng)基質(zhì)為黑土∶針葉土=5∶1，均勻播入 30 粒種子后覆蓋1 cm厚的培養(yǎng)基質(zhì)，將地膜覆蓋在營養(yǎng)缽上，保持種子萌發(fā)時需要的水分，待幼苗培養(yǎng)至三葉一心期后，每個營養(yǎng)缽中留 10 株幼苗，幼苗培養(yǎng)在25℃植物培養(yǎng)室內(nèi)，期間每 2 d補(bǔ)水一次，待幼苗培養(yǎng)至45 d，高度長至 10～15 cm時即可用于低溫脅迫處理。

1.3 低溫脅迫處理

對培養(yǎng)45 d的幼苗進(jìn)行間苗處理，每個營養(yǎng)缽中保留10株長勢均勻的苜蓿幼苗，并進(jìn)行低溫脅迫處理，處理溫度為0℃，—2℃，—3℃，—4℃和—5℃，每個溫度處理2 h，共處理3批，取混合葉片，每個處理3次重復(fù)，以25℃未處理的幼苗為對照(CK)，采集各處理的苜蓿幼苗葉片，置于—80℃冰箱中備用。

1.4 苜蓿幼苗葉片各指標(biāo)的測定方法

1.5 數(shù)據(jù)的處理與分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行顯著性分析、相關(guān)性分析和主成分分析。對測得數(shù)據(jù)用模糊數(shù)學(xué)隸屬度公式進(jìn)行轉(zhuǎn)換，隸屬函數(shù)公式為：U(Xij)=(Xij—Xmin)/(Xmax—Xmin)，反隸屬度的計(jì)算：U′(Xij)=1— (Xij—Xmin)/(Xmax—Xmin)，公式中，U(Xij),U′(Xij) 為第i個脅迫濃度的j項(xiàng)指標(biāo)的隸屬度，Xmin,Xmax分別為j項(xiàng)指標(biāo)的最小值和最大值。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對苜蓿幼苗葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

SS，SP和Pro具有調(diào)節(jié)植物的滲透平衡的作用，植物通過增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累從而緩解逆境脅迫對植物的傷害。隨著溫度的降低，SS，SP和Pro含量呈先升高后降低的變化趨勢，3種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)在-3℃均達(dá)到最大值(圖1a,b,c)，說明苜蓿幼苗可通過積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)應(yīng)對低溫的傷害。在0℃，-2℃，-3℃，-4℃和-5℃低溫脅迫下，SS含量分別較CK增加了53.37%，63.41%，91.94%，21.14%和9.51%；Pro含量分別較CK增加了121.19%，157.99%，227.16%，118.97%和92.96%；SP含量分別較CK增加了141.13%，150.90%，188.35%，146.19%和114.53%，方差分析顯示，除—5℃處理組SS外，低溫脅迫組的SS，SP和Pro含量與CK比較均差異顯著(P<0.05)。

2.2 低溫脅迫對苜蓿幼苗葉片膜透性的影響

MDA和RC是衡量膜損傷程度的重要指標(biāo)。隨著溫度的降低，葉片中MDA含量和RC呈逐漸升高的變化趨勢，在—5℃處理組達(dá)到最大值(圖2a,b)，表明隨著溫度的降低膜損傷程度也隨之增加。在0，-2℃，-3℃，-4℃和-5℃低溫脅迫下，MDA含量分別較CK增加了27.59%，47.00%，68.70%，76.50%和109.28%；RC分別較CK增加了67.30%，69.26%，71.96%，85.44%和90.63%(P<0.05)。

圖1 低溫脅迫下苜蓿葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的變化Fig.1 Changes of osmoregulatory substance content in alfalfa leaves under low temperature stress注：不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著，下同Note:Different lowercase letters indicate significant difference at the 0.05 level,the same as below

圖2 低溫脅迫下苜蓿葉片膜透性的變化Fig.2 Changes of membrane permeability of alfalfa under low temperature stress

2.3 低溫脅迫對苜蓿幼苗葉片活性氧積累的影響

圖3 低溫脅迫下苜蓿幼苗葉片膜氧化物質(zhì)的變化Fig.3 Changes of membrane oxides of alfalfa under low temperature stress

2.4 低溫脅迫對苜蓿幼苗葉片抗氧化酶活性的影響

植物細(xì)胞中清除活性氧的抗氧化酶系統(tǒng)的活性增加可減輕逆境中對植物細(xì)胞的傷害。隨著溫度的降低，POD和SOD呈先升高后降低的變化趨勢，在—3℃處理組達(dá)最大值，CAT和APX活性呈逐漸上升的變化趨勢，在—5℃處理組達(dá)最大值(圖4)，說明低溫脅迫處理對4種保護(hù)酶產(chǎn)生不同的影響。在0℃，-2℃，-3℃，-4℃和-5℃低溫脅迫下，POD活性分別比CK增加了88.65%，105.41%，184.86%，143.78%和66.22%；SOD活性分別較CK增加了88.50%，89.30%，102.94%，89.30%和75.94%；CAT活性分別比對照組增加了132.67%，170.30%，241.58%，272.28%和329.70%；APX活性分別較CK增加了58.00%，146.67%，148.00%，197.33%和264.00%(P< 0.05)。

圖4 低溫脅迫下苜蓿幼苗葉片抗氧化酶活性的變化Fig.4 Changes of antioxidant enzyme activities in alfalfa leaves under low temperature stress

2.5 低溫脅迫對苜蓿幼苗葉片代謝物質(zhì)含量的影響

隨著溫度的降低，GSH含量和PAL活性呈逐漸上升的變化趨勢，在-5℃處理組GSH含量和PAL活性達(dá)到最大值(圖5c,d)，可見低溫脅迫影響了植物組織中木質(zhì)素等和抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)代謝過程。在0℃，-2℃，-3℃，-4℃和-5℃低溫脅迫下，低溫處理組的GSH含量分別比CK增加了84.74%，111.21%，114.52%，124.45%和181.99%；PAL活性分別比CK增加了 65.86%，79.77%，85.31%，93.63%和106.71%(P< 0.05)。

圖5 低溫脅迫下苜蓿幼苗葉片代謝物質(zhì)含量的變化Fig.5 Changes of metabolite content in alfalfa leaves under low temperature stress

2.6 低溫脅迫下各生理生化指標(biāo)主成分分析

主成分的特征值和貢獻(xiàn)率是選擇主成分的重要依據(jù)，由表1可知，在測定的16個生理生化指標(biāo)中，前2個主成分反映了總信息量的96.353%，特征值總和達(dá)到15.416，表明這兩個主成分基本上能反映苜蓿抗寒能力。

表2 各指標(biāo)主成分分析矩陣和特征向量Table 2 Principal component analysis matrix and eigenvector of indicators

2.7 低溫脅迫下各生理生化指標(biāo)隸屬函數(shù)分析

選擇主成分1中PAL，GSH，CAT和RC和主成分2中SS，Pro，SP和POD，應(yīng)用隸屬函數(shù)對不同低溫脅迫下‘龍牧807’苜蓿幼苗葉片這8項(xiàng)生理生化指標(biāo)進(jìn)行綜合分析。由表3可知，隸屬函數(shù)值最大的是-3℃處理組，隸屬函數(shù)值最小的是-5℃處理組。隸屬函數(shù)綜合評價值越大，表明苜蓿幼苗對滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累越多、抗氧化酶活性越高及對膜損傷越小。依據(jù)低溫脅迫下‘龍牧807’苜蓿幼苗葉片生理生化的變化可知，該苜蓿能夠耐受的最低溫度為-3℃。

表3 低溫脅迫下各指標(biāo)隸屬函數(shù)值Table 3 Values of membership function of each index under low temperature stress

3 討論

SS，SP和Pro是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，與植物的耐寒性密切相關(guān)[10]。大量研究表明，低溫脅迫下，編碼Hsp家族熱激蛋白的基因能夠誘導(dǎo)可溶性蛋白的變化，參與植物響應(yīng)低溫脅迫的代謝過程[11]。SS等糖類物質(zhì)可為物質(zhì)的生物合成提供能量，而Pro積累會降低細(xì)胞滲透勢，保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)[12]。本研究中，溫度的降低，SP含量的增加會促進(jìn)下游物質(zhì)的合成及碳水化合物的代謝平衡，SS和Pro也能夠迅速對外界環(huán)境作出冷應(yīng)激反應(yīng)帶來的損傷，這與李文馨等[13]人研究低溫脅迫下鹿蹄草(Pyrola.callianthaH.Andres)生理響中Pro，SP和SS含量隨脅迫時間增加呈現(xiàn)出明顯的相關(guān)性的變化結(jié)果一致。

當(dāng)逆境脅迫加重時，如果光合碳同化被阻斷，多余的激發(fā)能量將被轉(zhuǎn)移到氧氣中產(chǎn)生活性氧(ROS)。ROS的積累會使細(xì)胞膜系統(tǒng)的膜脂受到過氧化損傷，最終使膜透性和離子透性增加，大量積累的ROS，加重膜質(zhì)過氧化導(dǎo)致MDA大量積累[14]。本研究中，隨著低溫脅迫程度的加重，RC和MDA含量逐漸升高，表明溫度越低，膜損傷程度越重，研究結(jié)果與鄧仁菊等人[15]研究低溫脅迫下火龍果的半致死溫度和抗寒性分析及張艷俠等[16]人研究5個石榴品種的抗寒性評價的研究結(jié)果一致。

植物在抵抗逆境脅迫中，GLO作為光呼吸代謝的關(guān)鍵酶參與調(diào)控光合作用，而低溫可破壞葉綠體的結(jié)構(gòu)從而促進(jìn)Chl降解，葉綠體內(nèi)ROS增加了對光合結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞作用[21]。研究發(fā)現(xiàn)，隨著溫度的降低，導(dǎo)致苜蓿葉片Chl降解和GLO活性降低，說明低溫可以影響苜蓿葉片的光合作用，還可使苜蓿葉片的GLO活性降低，導(dǎo)致光呼吸速率下降，不同溫度處理表現(xiàn)為溫度越低，對光合作用和光呼吸代謝脅迫能力越強(qiáng)。研究結(jié)果與山溪等人[22]和雋加香等人[23]對低溫脅迫下結(jié)球甘藍(lán)和番茄的光合色素和呼吸代謝的變化一致。

4 結(jié)論

隨著低溫脅迫強(qiáng)度的增加，‘龍牧807’苜蓿幼苗葉片中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、抗氧化酶活性、膜質(zhì)透性、膜氧化物質(zhì)和代謝物質(zhì)發(fā)生不同的變化，SS，SP，Pro，RC，POD，CAT，GSH和PAL有較大載荷值的8項(xiàng)指標(biāo)隸屬函數(shù)分析表明，‘龍牧807’苜蓿苗期能耐受最低溫度為—3℃。