郭曉燁 李艷華 韓丹翔

(1.中國科學院水生生物研究所, 武漢 430072; 2.中國科學院大學, 北京 100049)

類囊體膜是光合作用的發(fā)生場所, 為光合作用相關(guān)的蛋白復合物提供了一個連續(xù)的封閉膜系統(tǒng),使兩個橫向分離的光系統(tǒng)之間移動的電子傳輸元件得以擴散[1]。蛋白質(zhì)與脂質(zhì)作為類囊體膜及光合系統(tǒng)的主要組成成分, 對維持類囊體膜的結(jié)構(gòu)與功能非常重要, 分別約占類囊體膜質(zhì)量的60%和40%[2]。到目前為止, 大部分的光合作用相關(guān)的蛋白質(zhì)已經(jīng)被很好地解析, 而對脂質(zhì)的生理學功能的研究還非常有限。類囊體膜的脂質(zhì)組成在高等植物和各種藻類中都具有高度相似性[3], 主要為單半乳糖甘油二脂 (Monogalactosyldiacylglycerol, MGDG)、雙半乳糖甘油二脂(Digalactosyldiacylglycerol, DGDG)、磷脂酰甘油 (Phosphatidyl glycerol, PG) 和硫代異鼠李糖甘油二酯 (Sulfoquinovosyl diacylglycerol,SQDG)[4]。已有的研究表明, 脂質(zhì)具有多種重要功能, 包括與光合蛋白復合物和色素相互作用從而影響光合作用和光保護等生物學過程, 在穩(wěn)定雙層膜中起重要作用, 與生物適應變化的環(huán)境條件的能力有關(guān)等[5—7]。

為了更好地研究光合作用生物脂質(zhì)組分的功能, 需要對其進行更加準確、系統(tǒng)的定性及定量分析。目前常用的脂質(zhì)的分析方法主要有薄層色譜法(Thin-layer chromatography, TLC)、氣相色譜(Gas chromatography, GC)和液相色譜(Liquid Chromatography, LC)等[8,9]。傳統(tǒng)的方法有耗時長、樣品需求量大等缺點。例如, 薄層色譜法雖能有效分離不同的脂質(zhì)組分, 但由于多步驟操作中樣品的損失和硅膠等雜質(zhì)的引入會影響后續(xù)的進一步分析。氣相色譜則需要對脂肪酸組分進行甲酯化, 因此只能測定脂肪酸的含量, 而不能對甘油酯分子進行直接的分析。液相色譜具有分離效率高, 檢測靈敏度高等優(yōu)點, 能在降低對樣品成分影響的前提下有效地分離出多種細微差別的脂質(zhì)。基于油脂的多樣性, 除分離技術(shù)外, 質(zhì)譜(Mass Spectrometry, MS)、核磁共振(Nuclear magnetic resonance, NMR)和其他光譜方法是現(xiàn)今最有效的脂質(zhì)鑒定方法[10—12]。Welt等[13,14]利用電噴霧離子化串聯(lián)質(zhì)譜法(Electrospray Ionization Spray-Tandem Mass Spectrometry,ESI-MS/MS)實現(xiàn)了對植物油脂粗提物中脂質(zhì)分子的定性分析, 該項技術(shù)具有僅需少量的測量樣品且前處理步驟少等優(yōu)勢。許多報道表明, 在ESI條件下大部分甘油磷酯和糖脂可以通過粗脂提取物直接分析, 這種方法被稱為“鳥槍法脂質(zhì)組學”, 它是基于在三重四極桿上直接進行的單個脂質(zhì)分子的特征碎片離子掃描和中性丟失模式掃描, 該方法具有較高的通量[13—15]。Shui等[16]研究中表明在ESIMS中各甘油酯離子的響應在生物學濃度范圍內(nèi)是線性的, 因此可通過在樣品內(nèi)添加內(nèi)標樣品進行半定量分析。超高效液相色譜(Ultra Performance Liquid Chromatography, UPLC)與質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)用后, 更是成為定量分析比較復雜樣品中油脂成分的有效工具。

集胞藻Synechocystissp.PCC 6803作為成熟的模式藍藻, 已被廣泛地應用在對脂質(zhì)代謝的研究中[17]。為了實現(xiàn)對脂質(zhì)進行定量分析, 本研究以Synechocystissp.PCC 6803為研究對象, 建立了基于超高效液相色譜耦合串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-ESIMS/MS)的脂質(zhì)定性及定量分析方法, 為進一步研究藍藻中甘油酯的生理功能奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 藻的培養(yǎng)和收獲

Synechocystissp.PCC 6803藻種由本實驗室保藏。在BG11[17]固體培養(yǎng)基的平板中挑單藻落轉(zhuǎn)移至三角瓶中培養(yǎng), 采用液體 BG11培養(yǎng)基(pH 7.0)擴培兩次后, 以起始濃度為 2×106cells/mL轉(zhuǎn)接至容積為 750 mL 的柱狀光反應器, 于20 μmol/(m2·s)光照強度, 1.5%(v/v)CO2通氣量, 30℃條件下連續(xù)培養(yǎng)。

高光及低光條件下培養(yǎng): 將對數(shù)期的藻細胞設起始濃度為 5×107cells/mL, 轉(zhuǎn)接至容積為 750 mL的光反應柱, 采用BG11培養(yǎng)基, 分別于低光100 μmol/(m2·s)和高光300 μmol/(m2·s) 光照強度, 1.5%(v/v)CO2通氣量, 在30℃條件下連續(xù)培養(yǎng), 于0、2h和12h取樣。

藻細胞的收獲: 以5000×g離心10min 收集藻細胞, 用0.2 mol/L 磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffer,PB), 即10.8 g/L NaH2PO4和43.7 g/L Na2HPO4·7H2O混合溶液, 洗滌3次, 收集并冷凍干燥, 于-80℃保存。

1.2 總脂提取

總脂提取方法參照文獻[18]并有改進, 稱取5 mg凍干藻粉, 加入 6 mL甲醇∶氯仿∶甲酸(20∶10∶1,v∶v∶v), 室溫下在旋渦振蕩器上充分振蕩1h, 再加入3 mL的1 mol/L氯化鉀和0.2 mol/L磷酸混合溶液去除蛋白雜質(zhì), 充分振蕩。在4℃下以1000×g的離心力離心5min, 取下層有機相, 氮吹去除有機溶劑并于-20℃保存。

1.3 鳥槍質(zhì)譜法定性分析

提取的油脂溶解于2 mL含有10 mmol/L乙酸銨的甲醇∶氯仿(1∶1,v∶v)溶液中, 以10 μL/min流速進入Xevo TQ-S三重四極桿質(zhì)譜儀(美國Waters公司)的ESI源。ESI-MS/MS實驗(母離子和中性丟失掃描)以正極和負極兩種離子模式, 正極用于檢測MGDG和DGDG[19,20], 負極用于檢測PG和SQDG[21],掃描速度為200 Da/s。高純氮氣作為霧化和干燥氣體, 流速為600 L/h, 去溶劑溫度為300℃。毛細管電壓和錐孔電壓分別為3000 V和40 V(正離子模式),2500 V和30 V(負離子模式)。碰撞氣體為高純氬氣, 碰撞能量根據(jù)化合物的不同設為5—50 V, 掃描范圍100—1100 Da。

1.4 液相色譜-質(zhì)譜定量分析

色譜條件參考Li等[22]的方法。ACQUITY超高效液相色譜儀(美國Waters公司)與Xevo TQ-S聯(lián)用,經(jīng)BEH C18 色譜柱(2.1 mm×50 mm, 1.7 μm; 美國Waters公司)分離, 采用多反應監(jiān)測(Multiple reaction monitoring, MRM)掃描模式分析。

正離子模式下的流動相為A: 甲醇∶乙腈∶超純水(19∶19∶2,v∶v∶v)+10 mmol/L醋酸銨+ 0.1%甲酸;B: 異丙醇+10 mmol/L 醋酸銨+0.1% 甲酸。梯度洗脫程序設為: 0, 10% B; 1min, 10% B; 6min, 25% B;10min, 60% B; 10.1min, 10% B; 13min, 10% B。

負離子模式下的流動相為A: 甲醇∶超純水 (85∶15,v∶v)+10 mmol/L醋酸銨; B: 異丙醇+10 mmol/L醋酸銨。梯度洗脫程序設為: 0, 20% B; 1min,20% B; 8min, 40% B; 9min, 80% B; 11min, 80% B;11.1min, 20% B; 14min, 20% B。

流速為0.2 mL/min, 每個樣品的進樣量為1 μL。

1.5 化學試劑和標準樣品

甲醇(Methanol, 質(zhì)譜級)和乙腈(Acetonitrile, 質(zhì)譜級)購自德國Merck公司, 異丙醇(Isopropanol, 質(zhì)譜級)購自美國 Fisher公司, 三氯甲烷(Chloroform,色譜級)、甲酸(Formic acid, 質(zhì)譜級)和乙酸銨(NH4Ac,質(zhì)譜級)購自美國Sigma公司; 實驗用水為Milli-Q超純水。色譜級試劑用于油脂提取, 質(zhì)譜級試劑用于超高效液相色譜耦合串聯(lián)質(zhì)譜法對脂質(zhì)組學分析。

2種內(nèi)標 MGDG 18∶0/18∶0和DGDG 18∶0/18∶0購自美國Matreya公司, PG 17∶0/20∶4 購自美國Avanti Polar Lipids公司。標樣MGDG 16∶3/18∶3、DGDG 18∶3/18∶3和PG 16∶0/18∶1購自Avanti Polar Lipids,SQDG 16∶0/18∶3購自英國Indofine Chemical公司。

1.6 數(shù)據(jù)處理

每組實驗數(shù)據(jù)設3個平行, 結(jié)果用平均值±標準偏差表示。數(shù)據(jù)采集和處理采用Waters Micromass MassLynx v 4.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng), 使用Microsoft Excel進一步分析處理。

脂肪酸鏈表示方式為:w∶x/w∶x,w為碳原子總數(shù),x為每條脂肪酸鏈所含雙鍵數(shù)。指代的脂肪酸鏈無先后順序, 測量結(jié)果不能判斷脂肪酸鏈在sn-1或sn-2位上。

2 結(jié)果

2.1 建立基于質(zhì)譜的脂質(zhì)定性分析方法

Synechocystissp.PCC 6803各脂質(zhì)組分根據(jù)質(zhì)譜產(chǎn)生的特征碎片用以定性分析。甘油酯的碎片機理的研究是根據(jù)分析各甘油酯標準樣品的質(zhì)譜圖, 來確定最合適的特征碎片粒子和優(yōu)化質(zhì)譜儀分析參數(shù)。MGDG和DGDG采用ESI-MS/MS正極離子模式分析, PG和SQDG采用ESI-MS/MS負極離子模式。

以ESI-MS/MS正極離子模式下MGDG 18∶0/18∶0為例, 根據(jù)子離子質(zhì)譜圖(圖1A)分析MGDG的?；M成。由于正極模式下流動相含醋酸銨, 母離子為m/z804.16 [M+NH4]+, 碎片離子m/z607.38[M+NH4-197]+,m/z625.2 [M+NH4-179]+, 分別為中性丟失m/z197的碎片(C6H12O-H+NH4)和m/z179(C6H12O-H-H2O+NH4), 所丟失的碎片是MGDG所特有的單半乳糖基衍生片段。除MGDG 18∶0/18∶0外, 在所有已知標準樣品的質(zhì)譜圖中都具有相同的碎片離子。由于質(zhì)譜分析中檢測得中性丟失模式m/z197比m/z179更靈敏, 能同時檢測到更多種類的MGDG, 因此MGDG以中性丟失m/z197為定性分析的特征碎片, 用于后續(xù)不同?；M成的MGDG的鑒定。碎片離子m/z341.16 [RXCO+74]+(X=1, 2)是中性丟失的sn-1或sn-2位上的酰基,根據(jù)荷質(zhì)比可推算?；鶠镃18∶0, 元素組成為C18H36O2-OH+74。因此根據(jù)丟失MGDG所特有的單半乳糖基衍生片段m/z197和m/z179的碎片離子可以斷定化合物為MGDG, 根據(jù)另2個經(jīng)中性丟失產(chǎn)生的碎片離子的荷質(zhì)比可以推算?；奶紨?shù)和雙鍵數(shù), 對MGDG進行定性分析。

圖1 糖脂和磷脂的子離子掃描質(zhì)譜圖Fig.1 The product-ion scanning mass spectra of glycolipids and phospholipid

DGDG的碎片結(jié)構(gòu)和MGDG非常接近, 根據(jù)子離子質(zhì)譜圖定性方法參考MGDG。以DGDG 18∶0/18∶0為例, 在ESI-MS/MS正極離子模式下質(zhì)譜圖如圖1B所示。母離子為m/z966.44 [M+NH4]+,碎片離子:m/z607.31 [M+NH4-359]+和m/z625.37 [M+NH4-341]+, 分別為中性丟失m/z359(C12H22O11-H+NH4)和m/z341(C12H22O11-H-H2O +NH4), 所丟失的碎片是DGDG所特有的雙半乳糖基衍生片段。由于質(zhì)譜分析中檢測得中性丟失模式m/z341比m/z359更靈敏, 能同時檢測到更多種類的DGDG, DGDG以中性丟失m/z341為定性分析的特征碎片用于后續(xù)不同脂肪酸組成的DGDG的鑒定。碎片離子m/z341.18 [RXCO+74]+(X=1, 2), 所丟失的片段是sn-1或sn-2位上的?；? 且根據(jù)荷質(zhì)比可推算?；鶠镃 18∶0, 元素組成為C18H36O2-OH+74。因此, 根據(jù)中性丟失DGDG所特有的雙半乳糖基衍生片段m/z359和m/z341的碎片離子可以斷定化合物為DGDG, 根據(jù)另兩個經(jīng)中性丟失產(chǎn)生的碎片離子的荷質(zhì)比可以推算?；奶紨?shù)和雙鍵數(shù), 對DGDG進行定性分析。

對于PG的定性分析以17∶0/20∶4為例。圖1C為PG 17∶0/20∶4的子離子質(zhì)譜圖, 母離子為m/z783.08[M-H]-。產(chǎn)生兩個羧酸陰離子碎片[RXCOO]-(X=1,2),m/z268.97和 302.91。根據(jù)荷質(zhì)比可推算酰基分別為C 17∶0和C 20∶4, 元素組成為C17H34O2-H和C20H32O2-H。碎片離子m/z478.89和m/z512.85是[M-H-RXCO2H]-(X=1, 2),m/z496.91和m/z530.99是[M-H-RX’CH=C=O]-(X=1, 2), 分別為丟失sn-1和sn-2位的脂肪酸鏈后的游離酸和烯酮。m/z404.82和m/z439.02的碎片(表示為[M-H-RXCO2H-74]-(X=1,2)), 由丟失?；土姿峄鶊F頭部產(chǎn)生。表示特征極性磷酸基團頭部的離子為m/z226.96([C6H12O7P]-)和m/z152.71([C3H6O5P]-), 由甘油磷酸酯或甘油磷酸脫水形成。由于m/z152.71片段同樣可以作為其他磷脂(Phosphatidic acid, PA; Phosphatidylserine,PS; Phosphatidylinositol, PI和Phosphatidyl-ethanolamine, PE等)的特征離子, 因此選用m/z227為PG的特征片段來定性分析。

SQDG 的分析鑒定以SQDG 16∶0/18∶3為例, 在ESI-MS/MS負極離子模式下質(zhì)譜圖如圖1D所示,母離子為m/z815.43 [M-H]-。產(chǎn)生兩個m/z255.32和m/z277.19的碎片羧酸陰離子[RXCOO]-(X=1, 2),根據(jù)荷質(zhì)比可推算酰基分別為C 16∶0和C 18∶3, 元素組成為C16H32O2-H和C18H30O2-H。碎片離子m/z537 [M-H-RXCO2H]-(X=1, 2), 和m/z559 [M-HRXCO2H]-(X=1, 2), 分別為母離子中性丟失sn-1和sn-2位的?；?。離子m/z225([C6H9O7S]-)是磺基-6-脫氧葡糖基頭部, 作為SQDG所獨有的特征片段可用以SQDG鑒定。

根據(jù)以上討論所得4種甘油酯MGDG、DGDG、PG和SQDG各自的特征碎片, 確立了相應質(zhì)譜分析參數(shù)如表1所示, 后續(xù)實驗都以下表參數(shù)進行分析。

2.2 鳥槍質(zhì)譜法分析鑒定Synechocystis sp.PCC 6803脂質(zhì)組分

Synechocystissp.PCC 6803油脂粗提樣品直接進入ESI源通過鳥槍質(zhì)譜法檢測分析膜脂組分,先通過中性丟失(或母離子掃描)模式找到MGDG、DGDG(或PG和SQDG)的種類, 再通過子離子掃描鑒定其脂肪酸組成。根據(jù)確立的4種極性甘油酯MGDG、DGDG、PG和SQDG的質(zhì)譜分析參數(shù)設置LC-MS測定Synechocystissp.PCC 6803所含的4種甘油酯, 對所得的質(zhì)譜圖分析后得到四種甘油酯的主要脂肪酸組成種類如表2所示, 共鑒定有21種MGDG、21種DGDG、7種PG和12種SQDG。

表1 質(zhì)譜分析參數(shù)Tab.1 Mass spectrometry analysis parameters

表2 Synechocystis sp.PCC 6803脂質(zhì)的主要脂肪酸組成種類Tab.2 Major acyl species of membrane lipid molecular species in Synechocystis sp.PCC 6803

2.3 定量分析Synechocystis sp.PCC 6803脂質(zhì)組分

通過超高效液相色譜耦合串聯(lián)質(zhì)譜法的正極模式, 能在BEH C18色譜柱內(nèi)有效分離Synechocystissp.PCC 6803油脂粗提樣品中所含的不同脂肪酸組成的MGDG和DGDG, 負極模式有效分離不同脂肪酸組成的PG和SQDG(圖2)。不同甘油酯采用的對應質(zhì)譜分析掃描模式為: MGDG([M+NH4]+→ [M+NH4-197]+)、DGDG([M+NH4]+→ [M+NH4-341]+)、PG([M-H]-→m/z227)和SQDG([M-H]-→m/z225)。根據(jù)已知濃度的混合標準樣品建立標準曲線表2, 配制梯度濃度的外標分別為MGDG 16∶3/18∶3、DGDG 18∶3/18∶3、PG 16∶0/18∶1和SQDG 16∶0/18∶3, 定量的內(nèi)標MGDG 18∶0/18∶0(0.5 μmol/L)、DGDG 18∶0/18∶0(0.5 μmol/L)和PG 17∶0/20∶4(0.5 μmol/L), 在相應的質(zhì)譜分析參數(shù)模式下測定各標準樣品的峰面積。以樣品的峰面積Ax與內(nèi)標的峰面積Ai比值Ax/Ai為橫坐標, 以標準外標混合物濃度(ppm)為縱坐標, 得到標準曲線如表3, 4種脂質(zhì)都呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系, 因此Synechocystissp.PCC 6803所含4種甘油酯MGDG、DGDG、PG和SQDG均可采用對比內(nèi)標相對值的方法進行半定量分析。

選取生長對數(shù)期的Synechocystissp.PCC 6803藻細胞進行脂質(zhì)組分定量分析, 結(jié)果表明4種甘油酯MGDG、DGDG、PG和SQDG的濃度分別為(93.4±4.1)、(41.6±2.7)、(9.7±0.4)和(63.9±5.8) nmol/g。其中MGDG 18∶2/16∶0和MGDG 18∶3/16∶0是MGDG含量最多的兩種, 分別占總含量的46.4%和37.1%。DGDG 18∶2/16∶0和DGDG 18∶4/16∶0是DGDG含量最多的兩種, 分別占總含量的45.0%和15.9%。PG 18∶2/16∶0和PG 18∶3/16∶0是PG含量最多的兩種, 分別占總含量的31.2%和38.8%。SQDG 18∶2/16∶0和SQDG 18∶3/16∶0是SQDG含量最多的兩種, 分別占總含量的31.0%和24.9%。C18∶2/16∶0?；M成的甘油酯在4種甘油酯中都有30%以上的占比, 可見在Synechocystissp.PCC 6803中脂肪酸鏈多以18∶2/16∶0形式存在。

2.4 在不同光強條件下Synechocystis sp.PCC 6803脂質(zhì)組分變化情況

將常規(guī)培養(yǎng)的Synechocystissp.PCC 6803藻細胞轉(zhuǎn)入100 μmol/(m2·s)光照強度下培養(yǎng)(圖3), 外界光照強度的變化使各脂質(zhì)組分發(fā)生了不同程度的改變, 其中MGDG沒有顯著性的變化, DGDG和PG的總含量隨著光照時間的增加而逐漸累加,SQDG的總含量呈現(xiàn)截然不同的減少趨勢。而轉(zhuǎn)入更高光強300 μmol/(m2·s)條件下培養(yǎng)的藻細胞中各脂質(zhì)組分和100 μmol/(m2·s)光強相比, 保持了原來的總體變化趨勢基礎上都有所加強, 如DGDG在12h增長量由10.50%(P＜0.05)增加至26.95%(P＜0.001), SQDG在12h減少量由21.96%(P＜0.01)增加至33.18%(P＜0.001)。而MGDG和PG是在第2小時短時間內(nèi)有更為顯著地積累, 增長量分別達34.64%(P＜0.01)和68.49%(P＜0.05)。隨著光照強度的增加,Synechocystissp.PCC 6803藻細胞總體而言積累了更多的半乳糖脂MGDG、DGDG和磷脂PG, 其中MGDG和PG是先增加后略減少, DGDG隨時間不斷積累, 相較而言SQDG始終在減少。

圖2 MRM檢測模式下Synechocystis sp.PCC 6803 油脂的色譜圖Fig.2 Chromatography of the Synechocystis sp.PCC 6803 lipids detected by MRM

從分子水平上看(圖4和圖5), 高飽和種類脂肪酸構(gòu)成的MGDG如MGDG 16∶0/18∶1、MGDG 16∶0/17∶0、MGDG 16∶0/18∶0 和MGDG 16∶0/16∶0等第2小時顯著增長, 而高不飽和脂肪酸構(gòu)成的MGDG如MGDG 16∶0/18∶4在第12 小時大量積累。各種類DGDG在2h和12h的時間點上普遍呈現(xiàn)逐漸增加的增長趨勢。PG和MGDG非常類似, 各種類PG的變化趨勢受脂肪酸鏈飽和程度的差異影響,呈現(xiàn)以高飽和度脂肪酸組成的PG如PG 16∶0/18∶1、PG 16∶0/16∶0和PG 16∶0/16∶1先增加, 高不飽和度脂肪酸組成的PG如PG 16∶0/16∶3和PG 16∶0/18∶3后增加的趨勢。SQDG中除SQDG 16∶0/18∶0在第2小時有顯著增加外, 其他種類都呈現(xiàn)減少的趨勢。在兩種光強培養(yǎng)模式對比下, 以上各分子種類的甘油酯變化趨勢都隨著光照強度的增加而更為顯著, 是Synechocystissp.PCC 6803藻細胞針對外界光照的變化而做出的適應性轉(zhuǎn)變。

3 討論

3.1 超高效液相色譜耦合串聯(lián)質(zhì)譜法定性分析脂質(zhì)組學

圖3 Synechocystis sp.PCC 6803 在低光及高光條件下(A、B、C和D)各甘油酯總含量的變化(*P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001)Fig.3 Total contents of the various glycerolipids of Synechocystis sp.PCC 6803 grown under low light and high light condition (A, B, C,D) (*P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001)

表3 脂質(zhì)標準樣品的標準曲線Tab.3 The standard curve of the lipid standards

圖4 Synechocystis sp.PCC 6803 在低光強(A)和高光強(B)條件下各種MGDG和DGDG分子的含量倍數(shù)變化Fig.4 Fold-changes of MGDG and DGDG contents in the Synechocystis sp.PCC 6803 cells grown under low light (A) and high light (B)conditions

圖5 Synechocystis sp.PCC 6803 在低光強(A)和高光強(B)條件下各種PG和SQDG分子含量的倍數(shù)變化情況Fig.5 Fold-changes of PG and SQDG contents of the PG and SQDG molecules of the Synechocystis sp.PCC 6803 cells under low light(A) and high light (B) condition

本文建立了超高效液相色譜耦合串聯(lián)質(zhì)譜法,對Synechocystis sp.PCC 6803進行了脂質(zhì)組學分析。結(jié)果表明, 該方法能有效地分析鑒定極性甘油酯MGDG、DGDG、PG和SQDG, 包括油脂組成類型及其所含?；N類。該方法具有樣品需求量小且前處理少, 檢測精度、準度和穩(wěn)定度高等特點,能在13—15min內(nèi)快速分析鑒定全細胞脂質(zhì)組分等優(yōu)點。糖脂MGDG、DGDG和SQDG中的優(yōu)勢種主要為十八碳三烯酸(C18∶3)和十六碳烯酸(C16∶0)或十六碳烯酸(C16∶1)等偶數(shù)脂肪酸鏈[23]。經(jīng)GCMS鑒定, 在包括Synechocystissp.PCC 6803在內(nèi)的多種藍藻中有C17∶1和C17∶0等奇數(shù)脂肪酸鏈的存在, 但不能判斷所在的甘油酯種類[24]。文獻報道HPLCESI/MS首次應用于Synechococcussp.PCC7002脂質(zhì)組學分析中, 并在SQDG中發(fā)現(xiàn)了含有17個碳原子的脂肪酸鏈C17[25]。但相較而言, 運用本文中所建立的方法能夠在分子水平上有效分離并監(jiān)測到更多甘油酯種類。本研究在MGDG和DGDG中發(fā)現(xiàn)了經(jīng)酯化的脂肪酸鏈C17∶0、C17∶1、C17∶2 和C17∶3, 說明藍藻所含甘油酯中存在奇數(shù)脂肪酸鏈并不是特例。在念珠藻中通過同位素標記法證實了藻類可以合成奇數(shù)的脂肪酸鏈, 甲硫氨酸甲基特異性添加到十八碳烯酸的雙鍵中, 在雙鍵上插入一個亞甲基基團后進行脫羧和開環(huán), 得到等量的7-和8-甲基十七烷的混合物[26]。

3.2 Synechocystis sp.PCC 6803各脂質(zhì)組分全定量分析

本研究所建立的定量法的線性關(guān)系良好, 準確地定量了脂質(zhì)總含量和各不同?；M成的甘油酯含量。早期的研究表明光合作用生物細胞的脂質(zhì)成分都主要由3種甘油糖脂和1種磷脂組成。采用TLC分離定量方法得到藍藻中各組分約占46.2%MGDG、17.9% DGDG、25% SQDG和10.3% PG[27],運用本文中建立的脂質(zhì)組學分析方法測得結(jié)果為44.8% MGDG、19.9% DGDG、30.6% SQDG和4.7% PG, 與文獻中報道的各甘油酯占比接近, 驗證了該定量法對Synechocystissp.PCC 6803有效可行。該方法能有效應用于深入研究光合作用相關(guān)甘油酯各組分的動態(tài)變化情況。傳統(tǒng)的經(jīng)TLC分離和GC-MS鑒定僅能揭示C16∶0約占總脂肪酸含量的83.0%—86.4%, 是最豐富的脂肪酸種類[28]。在本研究中, 憑借超高效液相色譜耦合串聯(lián)質(zhì)譜法進行定量分析, 進一步發(fā)現(xiàn)了18∶2/16∶0在Synechocystissp.PCC 6803的4種光合甘油酯中所占比例最高, 是豐度最高的分子。

3.3 高光適應過程中Synechocystis sp.PCC 6803各脂質(zhì)組分變化情況

在從低光強到高光強適應過程中,Synechocystissp.PCC 6803所含各甘油酯除SQDG外都呈現(xiàn)增長的趨勢。在衣藻細胞的脂質(zhì)組學分析中, 4種甘油酯受光照的刺激下都起始于一個相對較高的濃度然后逐漸減少直到10h后幾乎保持不變, 其中MGDG和SQDG在光的開始階段0.25h內(nèi)急劇增加,而PG和DGDG持續(xù)增加至2h[29]。因此, 無論是真核生物還是原核生物, 都需要在光照增強時增加所有膜脂的合成水平, 以擴大膜面積促進細胞增殖或誘導光合作用。在更高的光強下持續(xù)一段時間之后MGDG、PG和SQDG的總含量的減少, 推測可能和高光強條件下光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)和光系統(tǒng)Ⅰ(PSⅠ)的下調(diào)有關(guān)[30,31]。4種甘油酯對光強變化(從低光到高光)表現(xiàn)出不同的變化趨勢, 這可能是由于它們在光合膜中的分布不均勻和功能作用不同造成的[29,32]。

已有的研究表明, 甘油酯中除頭部基團外[33],其特定的酰基組成同樣可以影響膜的流動性和光合作用元件的擴散[34]。深入了解各甘油酯在分子水平上的流動方向, 有助于更好地理解光合作用生物如何適應復雜的環(huán)境變化。不同?；M成的各甘油酯含量比總脂含量更加多樣化和多變。C18∶1和C16∶0是最主要的從頭合成的脂肪酸并被整合進極性甘油酯,Dictyopteris membranacea中發(fā)現(xiàn)PG是從頭合成脂肪酸的主要受體[35], 而后逐步去飽和化為C18∶3和C16∶3[36]。因此, 在第2小時開始顯著增加的PG 18∶1/16∶0很可能是通過酯化從頭合成脂肪酸所合成。同樣, 高飽和度?；M成的MGDG也可能涉及固定從頭合成的脂肪酸。而在高光適應2—12h過程中, 脂質(zhì)普遍由高飽和度?；M成向高不飽和度?；M成轉(zhuǎn)變的趨勢, 可能是細胞為適應高光的脅迫條件而提高脂肪酸的不飽和度, 增加細胞流動性Zakar等[37]對Synechocystissp.PCC 6803的研究中也有類似推論, 脂質(zhì)的不飽和度和葉黃素都參與提供適當結(jié)構(gòu)的膜環(huán)境, 以保護藻細胞免受光和溫度的脅迫。另外MGDG組成的改變可能通過?；溦T導改變甘油酯的形狀, 從而介導MGDG在整合于雙層膜內(nèi)和游離于膜外等不同的組合形態(tài)之間轉(zhuǎn)換, 維持光合作用蛋白元件的有序排列以發(fā)揮其功能[38,39]。

本研究為探索微藻的脂質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與其生理功能之間的關(guān)系提供了一種有效手段, 高光適應過程中脂質(zhì)含量和代謝動態(tài)變化的背后生物學機制還有待進一步研究。