張世勇 劉洪巖 王 江 邵俊杰 王明華 *鐘立強 陳校輝 * 邊文冀

(1.江蘇省淡水水產研究所, 南京 210017; 2.江蘇省農業(yè)種質資源保護與利用平臺, 南京 210014;3.揚州大學動物科學與技術學院, 揚州 225009)

斑點叉尾鮰(Ictalures punctatus)亦稱美洲鯰、溝鯰，屬于鯰形目，鮰科，原產于美國，是北美地區(qū)重要的水產經濟物種[1]。因其具有肉質細嫩，營養(yǎng)豐富，出肉率高，沒有肌間刺等優(yōu)點，深受廣大消費者歡迎。自20世紀80年代引入我國以來，得到了快速發(fā)展，我國斑點叉尾鮰養(yǎng)殖區(qū)域已遍布全國27個省(市、自治區(qū))[2]。我國斑點叉尾鮰產量約占世界總產量一半以上，已成為世界上最重要的斑點叉尾鮰生產、出口和消費國家[3]。隨著我國斑點叉尾鮰養(yǎng)殖規(guī)模的擴大及美國對華種質供應限制力度的加大，我國養(yǎng)殖斑點叉尾鮰出現了明顯的生長減慢、規(guī)格不齊和病害頻發(fā)等種質衰退的現象，嚴重影響了斑點叉尾鮰的產品品質、產量和養(yǎng)殖效益[4]。因此，開展斑點叉尾鮰品種改良工作，培育經濟性狀好和抗逆性強的斑點叉尾鮰新品種已成為當前斑點叉尾鮰產業(yè)可持續(xù)發(fā)展亟待解決的重要問題。

在魚類家系遺傳育種研究中，準確的系譜信息對于遺傳力和育種值的計算，及育種方案的制定具有至關重要的作用[5]。在傳統(tǒng)的選育過程中，不同家系主要通過物理隔離的方式分開養(yǎng)殖，等到子代個體長到較大規(guī)格時再采用注射熒光染料或電子標記等方式進行家系身份識別[6]。對不同家系采取水泥池和網箱隔離養(yǎng)殖的方式，不僅管理難度大，更為關鍵的是不同家系之間在環(huán)境因子上會存在差異，不同的環(huán)境因素會使育種相關的遺傳參數估計產生偏差，不能準確反映選育效果[7]。

微衛(wèi)星(Simple Sequence Repeats, SSR)和SNP(Single Nucleotide Polymorphism)等分子標記的出現使得混養(yǎng)水產動物親子關系的鑒定成為可能[8]。而且, 微衛(wèi)星標記具有多態(tài)性高、穩(wěn)定性強、特異性高和共顯性遺傳等優(yōu)點, 相較于SNP標記僅需少量多態(tài)性位點即可達到家系親緣關系鑒定的目的[9], 以微衛(wèi)星分型為基礎的親子鑒定技術是目前水產動物系譜確認中應用最廣泛、結果最可靠的手段之一。眾多研究表明微衛(wèi)星標記在確認水產動物父母本和分析家系關系方面具有重要的應用價值[10—15]。因此, 開發(fā)出一套基于微衛(wèi)星分子標記的快速、準確且經濟的斑點叉尾鮰家系親緣鑒定體系對其育種工作的開展具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

2008年使用1997—2004年從美國引進德克薩斯(1997)群體、阿肯色(1999)群體、密西西比(2001)群體、阿肯色(2003)群體和阿肯色(2004)群體共405尾斑點叉尾鮰建立育種基礎群體, 利用基礎群體進行G0代家系構建。2011年6月選用G0代親本構建50個G1代家系。2015年6月選用G1代選育群體作為親本構建100個G2代家系。剪取用于繁殖親本的尾鰭鰭條, 儲存在95%的酒精內, -20℃保存。斑點叉尾鮰交配產卵后, 每個家系卵塊獨立孵化,待魚苗孵出15d后, 從21個家系(其中全同胞家系13個, 半同胞家系8個)隨機選取500尾魚苗于面積為0.1 hm2的池塘中混合養(yǎng)殖。在養(yǎng)殖12個月后, 隨機選取333尾G2代斑點叉尾鮰個體, 剪取小塊尾鰭組織, 95%酒精保存, -20℃保存。

1.2 基因組DNA提取

剪取每個待測斑點叉尾鮰親本和子代尾鰭樣品約25 mg, 用液氮研磨成粉末, 轉移到1.5 mL 離心管中。先后加入450 μL STE DNA抽提緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0; 1 mmol/L EDTA, pH 8.0)、35 μL SDS (10%), 最后加入15 μL蛋白酶K(0.2%)顛倒混勻。加入RnaseA 1 μL, 置于水浴鍋55℃溫浴1h。加入等體積 (約700 μL) Tris飽和酚,在DNA混合儀上振蕩混勻, 4℃下12000 r/min離心10min, 結束后使用移液槍將上清液轉移入另一個干凈的離心管中。在上清液中加入等體積酚仿醇混合物 (酚∶氯仿∶異戊醇比例為25∶24∶1), 置于DNA混合儀上振蕩混勻15min。在上清液中加入等體積氯仿約500 μL, 置于DNA混合儀上振蕩混勻15min。在上清液中加入-20℃預冷的無水乙醇1 mL沉淀DNA, 離心機12000 r/min離心5min后棄上清液。先加入70%乙醇洗滌兩次, 再加入無水乙醇洗滌一次, 干燥后加入200 μL TE, 溶解充分。使用NanoDrop ND-1000分光光度儀(美國Nanodrop公司)檢測基因組DNA濃度和質量, 并將各DNA樣品稀釋成100 ng/μL的工作液。

1.3 多態(tài)性微衛(wèi)星標記篩選和反應體系優(yōu)化

從已發(fā)表的斑點叉尾鮰文獻中選取10個具有較高多態(tài)性微衛(wèi)星位點[16], 根據微衛(wèi)星標記兩端序列設計適于多重PCR擴增引物, 正向引物5′端作相應的熒光標記(表1)。建立2個多重PCR進行擴增,每個多重PCR包含5組微衛(wèi)星引物, 引物如表1所示。經優(yōu)化的PCR反應體系為20 μL: 2×TaqMaster Mix (Vazyme), 10 μL; 基因組DNA, 1 μL; 10P上下游引物, 0.25 μL; ddH2O, 6.5 μL。多重PCR擴增反應在Eppendorf Mastercycler nexus PCR儀上進行,擴增條件為: 94℃預變性5min; 94℃變性30s,58—51℃(每個循環(huán)減1℃)退火30s, 72℃延伸60s,9個循環(huán); 94℃變性30s, 55℃退火30s, 72℃延伸60s,15個循環(huán); 94℃變性30s, 50℃退火30s, 72℃延伸60s, 15個循環(huán); 72℃延伸10min。

表1 用微衛(wèi)星位點及引物信息Tab.1 The information of microsatellite markers and their primers

1.4 微衛(wèi)星位點基因分型

在PCR反應結束后, 取3 μL擴增產物樣品加入到ABI 3730 XL遺傳分析系統(tǒng) (美國ABI公司)配置的96孔板內, 每個孔內加入0.5 μL的GeneScanTM350ROXTM標準片段(美國ABI公司), 另外在每個孔內加入6.5 μL的Hi-DiTM 甲酞胺 (美國ABI公司),將96孔板放入PCR儀器內于95℃變性10min, 變性后立即置于冰上, 并上樣到ABI 3730XL遺傳分析系統(tǒng), 或者用鋁箔紙包好后放入-20℃保存待后續(xù)上機分析。待ABI 3730 XL遺傳分析系統(tǒng)毛細管電泳結束后, 導出電泳圖譜文件, 使用GeneMarker v2.2.0軟件讀取每個斑點叉尾鮰親本和子代在各微衛(wèi)星位點的基因型。

1.5 數據分析

采用Popgene 3.2軟件對基因分型數據進行等位基因頻率(Allele frequency)、觀測雜合度(Observed heterozygosity,Ho)、期望雜合度(Expected heterozygosity,He)、多態(tài)信息含量(Polymorphic information content,PIC)及無效等位基因頻率(Null allele frequency)等參數分析。使用Genepop 4.2.1軟件進行Hardy-Weinberg平衡檢驗。GenAlEx 6.51軟件計算每個微衛(wèi)星位點雙親基因型已知時的估計排除概率(PE-1)、已知一個親本基因型時的估計排除概率(PE-2)以及候選父母雙方和子代基因型已知, 排除父母雙方的概率(PE-3)及其相應的累積排除率。最后, 使用CERVUS 3.0軟件進行模擬分析以及親子鑒定分析。通過似然率(Likelihood, LOD)檢驗待測個體與親本基因型之間的關聯(lián)性, 并在95%置信水平下, 確定待測個體與候選親本之間的親子關系。

2 結果

2.1 微衛(wèi)星標記的分型研究

本研究根據10個微衛(wèi)星標記擴增產物范圍將其分為兩組進行多重PCR擴增, 具體分組情況為:第一組 (IP1、IP14、IP11、IP16、IP14)、第二組(IP13、IP18、IP19、IP20、IP12)。多重PCR擴增產物經ABI 3730XL遺傳分析系統(tǒng)進行毛細管電泳后, 使用GeneMarker v2.2.0軟件讀取每個斑點叉尾鮰親本和子代個體在10個微衛(wèi)星位點的基因型。圖1為第一組多重PCR體系, 每個微衛(wèi)星標記正向擴增引物的5′端間隔采用FAM和HEX熒光基團進行標記, 采用此標記方法可以清晰地辨別每個位點的擴增片段及大小。

2.2 微衛(wèi)星標記的多態(tài)性分析

從表2中可以看出, 通過檢測微衛(wèi)星標記在待測21個家系中的遺傳多樣性, 發(fā)現10個位點均具有較高多態(tài)性: 等位基因數(Na)在6—16個, 觀察雜合度(Ho)在0.748—0.952, 期望雜合度(He)在0.678—0.880, 各位點的多態(tài)信息含量(PIC)在0.647—0.868, 無效等位基因頻率在-0.0735—0.0316, 說明這10個微衛(wèi)星標記在斑點叉尾鮰親子鑒定中具有較高的使用價值。在待測21個家系中平均等位基因數均為9.8, 平均觀測雜合度、平均期望雜合度、平均多態(tài)信息含量依次分別為0.8591、0.8092和0.7845。除位點IP1外, 均顯著偏離Hardy-Weinberg平衡。

2.3 排除率和累積排除率

圖1 微衛(wèi)星標記分型圖Fig.1 Genotyping of microsatellite markers

使用GenAlEx 6.51軟件計算排除率與累積排除率, 結果如表3所示。每個微衛(wèi)星位點雙親基因型已知時的估計排除概率(PE-1)、已知一個親本基因型時的估計排除概率(PE-2)及候選父母雙方和子代基因型已知, 排除父母雙方的概率(PE-3)均與多態(tài)性信息含量成正比, 其中位點IP1各排除概率均最高, 分別為0.76、0.61和0.91, 而位點IP13各排除率均最低, 分別為0.47、0.28和0.67。10個微衛(wèi)星位點的累積排除概率CPE-1、CPE-2和CPE-3分別為0.99996806、0.99833267和0.99999998。隨著微衛(wèi)星位點數目的增多, 排除率也隨之增大, 且每種排除概率均趨于飽和。

2.4 親子鑒定結果分析

從G2世代育種群體中隨機選擇13個全同胞家系和8個半同胞家系子代幼魚混合養(yǎng)殖后, 從群體中隨機選取333尾子代, 通過對333尾子代、38尾目標親本和9尾干擾親本在10個微衛(wèi)星位點分型結果(表4), 應用似然法鑒定它們之間的親子關系。每個家系子代與父本平均配對LOD值在4.22—11.70,子代與母本平均配對LOD值在5.59—10.20, 子代與父母本三者之間配對LOD值在13.30—24.70。最終, 根據LOD值大小將子代與候選父母進行匹配,最終331尾子代在21個家系中找到了對應的候選父母本, 對應結果符合家系交配原則, 僅2尾個體與候選親本配對LOD值小于0, 此外存在1尾子代與2個候選母本配對的情況。結果表明該斑點叉尾鮰家系鑒定方案鑒定準確率達到99.10%。

表2 10對微衛(wèi)星標記在21個家系中的遺傳參數Tab.2 Genetic parameters of 10 microsatellite loci in 21 families0

表3 10對微衛(wèi)星標記的排除率統(tǒng)計表Tab.3 Combined exclusion probability and exclusion probability of 10 loci

3 討論

在魚類家系育種中掌握準確的系譜信息對于遺傳參數估計和育種方案制定具有關鍵性的作用,因此必須選擇合適的標記以正確掌握系譜信息。本研究選擇的10個微衛(wèi)星標記在21個斑點叉尾鮰家系群體中均具有較高的多態(tài)性,PIC值介于0.647—0.868, 而說明這10個微衛(wèi)星位點能提供較為豐富的遺傳變異信息。研究將10個微衛(wèi)星標記根據其擴增產物大小分成2組建立2個5重PCR擴增體系, 大大減少了PCR反應和毛細管電泳上樣過程中的工作量, 顯著提高了工作效率。隨著多重PCR反應中引物的增加, 對PCR反應的靈敏性和特異性均會帶來不小的挑戰(zhàn), 以往大多數親緣關系鑒定類研究通常采用低重PCR反應或者單獨PCR后再混合上樣的策略[17]。本文對篩選的微衛(wèi)星位點分別進行了引物和反應體系優(yōu)化。引物優(yōu)化主要通過對各微衛(wèi)星位點在基因組上定位再設計適合開展多重PCR反應的引物; 反應體系優(yōu)化則是通過選用適合多重PCR反應的商品試劑, 再結合Touchdown PCR反應得以實現。

基于似然法的親子鑒定主要是通過建立似然函數, 應用假設檢驗的方法在所有候選親本中找到最似父/母本。其計算過程是將每個微衛(wèi)星位點的似然比累加后求自然對數值得到配對LOD值。當LOD值等于0認為候選父/母本與群體中隨機父/母本成為子代真實父親的可能性相同; 當LOD值小于0認為候選父/母本不可能為子代的真實父/母親;LOD大于0認為候選父/母本是子代的真實父/母親,LOD值越大, 可靠性越高[15]。根據CERVUS軟件計算的LOD值, 當所有的微衛(wèi)星座位全部匹配, 并符合親本交配原則時, 330尾斑點叉尾鮰子代個體確認所屬家系, 真實鑒定率達99.1%, 且置信度均達到95%。3尾沒有被準確鑒定到家系的個體很可能是因為在基因分型時沒有準確讀取其基因型數據, 或是混養(yǎng)家系中滲入其他家系子代。準確的基因分型是親緣關系鑒定成功的關鍵, O’Reilly等[18]發(fā)現平均每個基因座位往往存在2%—3%的基因分型錯誤而無法達到100%的準確率。因此, 為了提高鑒定的準確性, 除了選擇多態(tài)性高的微衛(wèi)星標記外,盡量選擇三、四堿基重復型標記。此外, 還需要嚴把基因分型關口, 必要時可以采用人工輔助計算機對分型數據進行判讀。

表4 10個微衛(wèi)星標記親子鑒定結果Tab.4 Paternity test results of ten microsatellite markers

有效鑒定親本數目是衡量微衛(wèi)星標記鑒別能力的重要指標。通常, 隨著微衛(wèi)星位點數目的增加,累積排除概率逐漸增大; 相同數量的微衛(wèi)星標記數目, 多態(tài)信息含量大的微衛(wèi)星組合具有更高的累積排除概率。呂洋[19]使用不同微衛(wèi)星位點數量模擬鑒別青蝦親本數量的研究表明, 5個微衛(wèi)星標記(平均等位基因5個)可以對10個已知性別的候選親本和5個未知性別候選親本進行有效鑒定, 當微衛(wèi)星位點數目增加到10個時(平均等位基因5.6個; 平均PIC0.7245), 對已知性別候選親本和未知性別候選親本鑒定數則分別達到434和238尾。任昆等[20]使用8個高多態(tài)性微衛(wèi)星(平均等位基因8.75個, 平均PIC0.8135)模擬最多可鑒定草魚親本數量, 已知性別親本598尾, 未知性別親本431尾。本文所選擇的10個微衛(wèi)星位點平均等位基因(9.8個)高于以上兩項研究; 平均多態(tài)性信息含量PIC(0.7845)介于以上兩項研究結果之間。因此, 本研究所建立的斑點叉尾鮰家系親緣關系鑒定體系能夠提供準確完整的系譜信息, 從而滿足育種需求, 若具有更多候選親本時則可通過增加多態(tài)性微衛(wèi)星位點數目來實現準確鑒定的目的。