李 勤 李尚諭 熊 雄 張榜軍 劉 洋,

(1.河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 新鄉(xiāng) 453007; 2.中國科學(xué)院水生生物研究所, 武漢 430072;3.河南師范大學(xué)學(xué)報編輯部, 新鄉(xiāng) 453007)

微塑料是指粒徑從幾微米到幾毫米、形狀不一的塑料混合體的總稱, 定義為小于5 mm的塑料,其形狀有碎片、纖維、顆粒和小球等多種, 分為初級塑料和次級塑料[1]。近年來, 我國塑料制品的產(chǎn)值逐年增高, 主要組成成分為聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)、聚苯乙烯(PS)、聚氯乙烯(PVC)、聚乳酸(PLA)及聚對苯二甲酸乙二酯(PET)等聚合物[2]。塑料制品在生產(chǎn)過程中往往會添加大量的阻燃劑、塑化劑等助劑, 部分P V C 含有鄰苯二甲酸酯(PAEs)。PAEs 及其代謝產(chǎn)物屬于環(huán)境內(nèi)分泌干擾物, 對人體有生殖發(fā)育的影響、胚胎毒性和致癌毒性。如鄰苯二甲酸丁芐酯(BBP)、鄰苯二甲酸二己酯(DEHP)具有致癌性。PVC 中含有氯化氫, 這些物質(zhì)會隨著聚氯乙烯的老化逐漸釋放到環(huán)境中[3,4]。有研究表明, 接觸高濃度PVC中的氯乙烯單體的工人易患肝癌等病癥; PVC中的氯乙烯可能導(dǎo)致人體先天缺陷、遺傳變化、皮膚病和消化不良等[5,6]。

研究表明, 多種藻類、貝類、魚類及海洋哺乳類動物都直接或間接地受到微塑料的影響, 微塑料多變的形狀和類型, 對海洋中不同的生物可產(chǎn)生不同的毒性作用[7]。海洋微藻中肋骨條藻(Skeletonema costatum)經(jīng)96h平均直徑1 μm微塑料暴露后,其生長表現(xiàn)出抑制效應(yīng); 當(dāng)濃度為50 mg/L時, 其葉綠素含量和光合效率顯著降低[8]。PVC濃度為250 mg/L, 淡水小球藻葉綠素a含量下降55.23%; 在此劑量下蛋白核小球(Chlorella pyrenoidosa)和水華微囊藻(Microcystis flos-aquae)的光合作用都受到抑制[9]。納米塑料珠阻礙小球藻和柵藻的光合作用, 可導(dǎo)致藻類ROS的產(chǎn)生[10]。斑馬魚攝入聚苯乙烯顆粒(20—1000 nm粒徑), 腮細(xì)胞的DNA有輕微的損傷;而虹鱒的鰓因微塑料顆粒的附著出現(xiàn)免疫反應(yīng)[11,12];苯乙烯影響網(wǎng)紋蚤(Ceriodaphnia dubia)的繁殖率[13]。微塑料在遷移過程中可能富集重金屬和其他污染物, 對水生生物產(chǎn)生復(fù)合污染毒性, 進(jìn)而對人類健康造成威脅[14]。

目前微塑料的毒性和影響研究多集中在海洋領(lǐng)域, 淡水領(lǐng)域報道較少。我國淡水水體比如太湖、武漢城市水體、珠江支流、上海城市河道、洞庭湖和洪湖等都檢測到微塑料, 其中微塑料豐度最高的是三峽水庫(表層水), 達(dá)1.36×107個/km2[15]。微塑料對淡水生物的影響研究不容忽視, 因此, 本研究主要探討微塑料對淡水生物的生長、繁殖及恢復(fù)后的影響效應(yīng)。大型溞(Daphnia magna)屬于節(jié)肢動物門、甲殼綱和枝角類, 在淡水生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動的環(huán)節(jié)中起到重要作用, 由于其對毒物敏感性較高, 被廣泛用于化學(xué)產(chǎn)品的毒性評價、水污染的檢測及制定各種水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)實驗[16]。本實驗通過研究微塑料(800目的PVC)暴露后對大型溞的急性毒性、生長、繁殖及清水恢復(fù)實驗, 為微塑料(PVC)短期對淡水生物(大型溞)的影響提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

大型溞和小球藻(Chlorella vulgaris)來自中國科學(xué)院水生生物研究所。大型溞養(yǎng)殖在直徑為20 cm的圓形透明的玻璃缸中, 置于光暗比(L∶D)16∶8的光照培養(yǎng)箱中, 光照強(qiáng)度為3000 lx, 溫度為(24±1)℃,每天上午10點喂食小球藻, 用曝氣2d以上的自來水培養(yǎng)。毒性試驗前24h挑選懷卵的生命力強(qiáng)的母溞單獨培養(yǎng), 其敏感度測定符合國際標(biāo)準(zhǔn)。選用800目(15 μm)的PVC, 購自東莞市靜天塑膠原料有限公司。

1.2 幼溞的急性毒性

參考OECD[17]等方法, 根據(jù)預(yù)實驗, 將經(jīng)過超聲波水浴40min 的400 mg/L的PVC懸浮液, 依次稀釋0、12.5、25、50、100、200 和400 mg/L的梯度,記為CK、A、B、C、D、E、F組。設(shè)置4個重復(fù),每個燒杯中放入5只6—24h經(jīng)過饑餓處理的幼溞,在24h、48h、72h和96h記錄幼溞的死亡率。實驗過程中不喂食, 不換液。

1.3 心率測定

經(jīng)過96h的急性毒性處理, 使用體式顯微鏡(SZ61, 奧林巴斯, 日本)對每組隨機(jī)選擇2只的大型溞進(jìn)行60s左右的錄像, 然后使用計數(shù)器對錄像結(jié)果進(jìn)行大型溞跳動次數(shù)的計數(shù), 每個視頻計數(shù)3次,計算結(jié)果換算成“次/min”[18,19]。

1.4 攝食率測定

參考賈靜[20]方法, 96h的急性毒性處理后, 將其轉(zhuǎn)到含有小球藻的培養(yǎng)液中, 利用血球計數(shù)板計數(shù)的方法測定小球藻密度。小球藻初始密度為5×105cells/mL, 黑暗下靜態(tài)放置培養(yǎng)箱5h后計數(shù)小球藻的密度。參考羅艷蕊等[21]方法, 計算攝食率(I):

式中,I為攝食率, 平均每個大型溞單位時間內(nèi)攝取的藻細(xì)胞數(shù)量, 單位為cells/h;C0為藻液的初始密度, 單位為cells/mL;Ct為藻液的最終密度, 單位為cells/mL;t為時間, 單位為h;A為校正因子。

1.5 酶活測定

參考張楠等[22]方法, 將6—24h 幼溞置于不同濃度組(0、25、50、100和200 mg/L)處理96h。試驗期間不喂食, 不換試驗用液。96h 后將大型溞濾出,同時棄去死亡個體。用86%的生理鹽水, 沖洗3 次,在濾紙上吸干水分后稱重, 將大型溞以1 g∶9 mL 的比例添加86%的生理鹽水, 置冰中用勻漿器勻漿,勻漿多次。勻漿之后以10000 r/min 4℃下離心10 min,收集上清液, 分裝后-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用試劑盒?南京建成生物工程研究所)測SOD(超氧化物歧化酶)活性、GSH(谷胱甘肽過氧化酶)活性、組織中蛋白質(zhì)含量。

1.6 恢復(fù)試驗

在96h急性毒性處理后, 將其轉(zhuǎn)入含有藻液(小球藻)的50 mL燒杯中。每個燒杯中放1只溞, 每天加定量的藻液, 每隔1天換1次水, 每天記錄脫殼數(shù)、死亡數(shù)、產(chǎn)幼溞情況。測量首次產(chǎn)幼溞體長及21d母溞體長。

1.7 PVC排出試驗

96h急性毒性處理后, 將其轉(zhuǎn)入清水中。在顯微鏡下0、1h、4h和16h拍照, 觀察其清水排出PVC的過程。

1.8 數(shù)據(jù)處理

Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和繪圖, SPSS17.0進(jìn)行概率單位(Probit)回歸分析和單因素方差分析(One-way ANOVA); 當(dāng)方差不具有齊性時, 選擇未假定方差齊性的Tamhane’s T2和Dunnett’s T3(3)檢驗。數(shù)據(jù)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,P＜0.05為顯著性差異,P＜0.01表示極顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 PVC對大型溞的急性毒性及其心率和攝食率的影響

96hLC50值為130.132 mg/L, 95%置信區(qū)間為82.864—234.989 mg/L。通過觀察, 大型溞在24—48h時死亡率較低; 72—96h毒性上升。當(dāng)濃度為400 mg/L時, 在96h幼溞全部死亡。

在圖1中96h時, 大型溞的心率隨著濃度的增加而下降。當(dāng)處理組濃度為50、100和200 mg/L時,與對照組相比有顯著性差異(P＜0.05); 但低濃度組(12.5和25 mg/L)與對照組相比, 心率無顯著性差異(P＞0.05)。當(dāng)處理組為200 mg/L, 大型溞心率最低。這說明PVC濃度越大, 對其心率影響越大。

在圖2中, 大型溞的攝食率與對照組相比, 均低于對照組。當(dāng)處理組濃度為12.5 mg/L時, 處理組與對照組的攝食率無明顯差異(P＞0.05)。當(dāng)處理組濃度為200 mg/L時, 攝食率最小為(1.236×104±0.101) cells/(ind.·h), 與對照組的攝食率(1.772×104±0.040) cells/(ind.·h)相比, 具有極顯著性差異(P＜0.01)。

2.2 PVC對大型溞抗氧化酶的影響

圖1 PVC對大型溞96h心率的影響 (*代表P＜0.05, 下同)Fig.1 Effect of PVC on heart rates of D.magna (*means P＜0.05,the same applied below)

圖2 PVC對大型溞攝食率的影響 (**代表P＜0.01)Fig.2 Effect of PVC ingestion rate on D.magna (**means P＜0.01)

在圖3a中, 當(dāng)處理組濃度為200 mg/L時, 蛋白含量最低為(0.228×103±0.080) mg/L; 處理組濃度為100和200 mg/L時, 與對照組相比具有顯著性差異(P＜0.05); 其他處理組與對照組相比, 沒有明顯的差異(P＞0.05)。圖3b中處理組中的GSH含量與對照組相比呈升高的趨勢; 處理組除了濃度為200 mg/L時, 與對照組相比有顯著性差異(P＜0.05), 其余各組均無顯著性差異(P＞0.05)。圖3c中處理組的SOD的活力與對照組相比, 基本隨濃度的增加而升高;處理組只有濃度為200 mg/L時, 與對照組相比具有顯著性差異(P＜0.05), 其他均不具有顯著性差異(P＞0.05)。這說明大型溞經(jīng)過處理后, 體內(nèi)酶發(fā)生相應(yīng)變化, 出現(xiàn)氧化應(yīng)激。

2.3 PVC對大型溞后續(xù)生長繁殖的影響

圖3 PVC對大型溞蛋白含量(a)、GSH含量(b)和SOD活力(c)的影響Fig.3 Effect of PVC on protein content (a), GSH content (b) and SOD activity (c) of D.magna (the same applied above)

表1中的處理組比對照組的首次產(chǎn)生溞時間早;總產(chǎn)幼溞數(shù)多, 但處理組(除了E組)的幼溞死亡數(shù)都高于對照組, 表2的處理組首次產(chǎn)幼溞體長均比對照組短, 而且部分子代有畸形; 處理組的21d母溞體長也比對照組短。

2.4 大型溞在不同時間排出PVC的情況

圖4中的處理組隨著在清水中恢復(fù)的時間延長, 大型溞的腸道逐漸干凈, 但到16h仍未全部排出。所有組清洗后轉(zhuǎn)入清水中進(jìn)行拍照觀察, 所有處理組變化趨勢一致。E組在0時, 腸道都是白色;1h時, 大型溞周圍有白色絮狀物, 附肢上較多; 4h時,液體中有白色聚集體; 16h時, 大型溞的腸道內(nèi)容物減少, 液體中有較多的白色聚集體。

3 討論

3.1 PVC對大型溞心率和攝食行為的影響

本文的急性毒性終點時間是96h, Rehse等[23]提出大型溞在1 μm不同濃度的PE暴露下, 24—72h的大型溞活動抑制結(jié)果低于96h的結(jié)果。機(jī)體對污染物早期的應(yīng)激反應(yīng)包括心率的變化, 本研究對心率進(jìn)行了測定, 處理組的心率比對照組低, 表明暴露于PVC環(huán)境中的大型溞心率受到了影響。本研究心率數(shù)據(jù)比已有研究報道的心率低的原因可能是幼溞在試驗前進(jìn)行了饑餓處理[19]。

攝食行為是水生動物的一項基本行為, 可以直觀地反映外界環(huán)境對其機(jī)體的影響[18]。Rist等[24]證明了大型溞暴露100 nm的塑料顆粒中, 攝食率下降21%。Ogonowski等[25]提出了大型溞因MPs的存在,攝食率下降30%。還有研究表明大型溞暴露PE中0.5h、1h和1.5h, 暴露組的攝食率與對照組的差異越來越小[20]。本研究結(jié)果表明, 大型溞在高濃度組PVC(25—200 mg/L)暴露96h時, 攝食率顯著受到抑制。PVC處理后的大型溞的攝食率下降, 可能是其在腸道內(nèi)形成不規(guī)則的聚集體, 使腸道受到一定機(jī)械損傷[25], 與魚類攝入MPs阻塞消化道類似, 導(dǎo)致物理和機(jī)械損傷。MPs堵塞腸道和破壞腸道在動物的攝食和消化行為中較為常見的[26,27]。腸道中的微塑料可能誘導(dǎo)虛假的飽食感導(dǎo)致食物攝入量減少, 減少對微藻細(xì)胞的吸收和能量的攝入[28]。大型溞在饑餓的狀態(tài)下, 對食物無選擇性[29], 研究也發(fā)現(xiàn)處理組中的大型溞攝食PVC填滿腸道, 經(jīng)過96h的短期暴露, 依舊影響大型溞在無PVC環(huán)境的攝食, 說明短期內(nèi)(5h)無法改變PVC對大型溞攝食率的影響。

3.2 PVC對大型溞SOD和GSH的影響

生物體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)中重要的酶類包括SOD、過氧化氫酶(CAT)和GSH, 在應(yīng)對外界損傷中起關(guān)鍵作用。SOD可以將轉(zhuǎn)化成H2O2和O2,減少體內(nèi)的氧自由基, 阻止機(jī)體和細(xì)胞的氧化;CAT催化H2O2生成H2O和O2, 清除體內(nèi)的過氧化氫;GSH催化過氧化物還原[30]。大型溞經(jīng)過96h處理后,SOD和GSH都有不同程度的變化, 說明PVC處理后干擾了機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)。當(dāng)面對環(huán)境中PVC的脅迫時, 大型溞啟動抗氧化應(yīng)激系統(tǒng), 抵御不良環(huán)境, 從而維持自身抵抗外部環(huán)境改變的能力。

表1 21d大型溞恢復(fù)狀態(tài)的繁殖參數(shù)Tab.1 Reproductive parameters of 21d D.magna in restored state

表2 21d大型溞恢復(fù)狀態(tài)的生長參數(shù)Tab.2 Growth parameters of 21d D.magna in restored state

圖4 E組大型溞在不同時間排出PVC的情況Fig.4 The excretion of PVC from D.magna on E group at different times

3.3 PVC對大型溞繁殖的影響

水生生物攝入微塑料, 可以導(dǎo)致個體物理損傷、干擾其內(nèi)分泌、抑制其生長發(fā)育、降低其生殖能力和引起氧化應(yīng)激, 甚至增加其畸形率和死亡率[31]。處理組的子代數(shù)比對照組的多, 處理組子代體長及母溞體長均比對照組短, 子代有畸形, 表明短期的PVC暴露對大型溞后續(xù)的生長繁殖有不利影響。這與魚類攝入MP后, 影響其繁殖的觀點一致[27,30]。而部分研究發(fā)現(xiàn)大型溞暴露于63—75 μm的聚苯乙烯熒光顆粒中, 對其生存和繁殖沒有顯著影響[32]。這可能是微塑料材質(zhì)和大小不同, 對大型溞的毒性不同。本實驗經(jīng)過96h處理, 再進(jìn)行21d的有藻恢復(fù), 母溞仍存在死亡現(xiàn)象, 與大型溞暴露于PET(長62—1400 μm, 寬31—528 μm, 厚1—21.5 μm)48h后, 再進(jìn)行24h無MPs有藻的培養(yǎng)基恢復(fù)實驗,結(jié)果較為類似[27]?？赡苁俏⑺芰蠈Υ笮蜏械膿p傷在一定時間內(nèi)不可恢復(fù)。本實驗觀察到了幼溞出現(xiàn)尾刺彎曲和幼溞體長縮短的現(xiàn)象, 表明PVC暴露影響子代的形態(tài)發(fā)育。已有研究表明在Nano-PS暴露的大型溞表現(xiàn)出體型縮小和體重減輕的現(xiàn)象, 幼溞數(shù)量較少, 幼溞的畸形率上升至68%, 第二剛毛不完全發(fā)育和尾刺彎曲[33], 這些表明微塑料潛在地導(dǎo)致了大型溞子代畸形。在本試驗進(jìn)行16h后, 大型溞腸道內(nèi)容物仍未排除干凈。本研究結(jié)果與Rist等[24]關(guān)于大型溞攝食聚苯乙烯熒光顆(24h)結(jié)果較為一致。大型溞攝食微塑料后短時間內(nèi)較難排凈,這可能是由于大型溞腸道攝食動態(tài)平衡及清水恢復(fù)時間有關(guān)[20,25], 而這部分研究仍需要進(jìn)一步驗證。大型溞暴露96h后進(jìn)行有藻恢復(fù), 對子代仍會造成影響, 而究竟第幾代才能消除微塑料的影響,這部分研究還未見報道, 有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

PVC暴露對大型溞的96hLC50值為130.132 mg/L,95%置信區(qū)間為82.864—234.989 mg/L。PVC高濃度處理組大型溞的攝食率與對照組有極顯著性差異(P＜0.01), 低濃度組卻無顯著性影響(P＞0.05)。暴露PVC后的大型溞比對照組心率低, PVC對大型溞心率有一定的影響。大型溞在16h內(nèi)不能將腸道內(nèi)的PVC全部排出。短期的PVC暴露影響大型溞的子代數(shù)及子代的形態(tài)發(fā)育, 這種影響需要大型溞長期的無暴露物的恢復(fù)。

致謝:

感謝中國科學(xué)院水生生物研究所的侯淼淼在實驗中給予的幫助, 感謝河南師范大學(xué)的劉夏楠、黃莉曉和黨步云對實驗的參與和幫助。