程生輝，劉逸軒，姚帥君，門九章

（山西中醫(yī)藥大學，山西 晉中 030619）

過敏性紫癜是系統(tǒng)性IgA 免疫復合物介導的白細胞破碎性血管炎，臨床特征主要為皮膚非血小板減少性紫癜、關節(jié)炎、胃腸道出血及腎炎等。發(fā)病機制為毛細血管變態(tài)反應和血管的自體免疫損傷［1］。門氏保元湯是門九章教授治療過敏性疾病和自身免疫性疾病的常用方主方，由當歸、金銀花、元參、黃芪、炙甘草5 味藥組成，以“扶正培元，標本兼顧”組方，針對過敏性紫氣陰兩虛、熱瘀互結的病機特點，具有清熱解毒、益氣活血等功效，有著良好的臨床效果［2-3］。

整合藥理學是融合了中藥學、藥理學、計算機科學等多個學科的交叉學科，用以研究藥物與機體的相互作用及作用原理［4］。通過中醫(yī)藥整合藥理學平臺（TCMIP，http：www.tcmip.cn），本研究對門氏保元湯治療過敏性紫癜的機制進行了探究與分析，為闡釋本方分子機制以及臨床新藥研發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 化學成分來源

在整合藥理學平臺（http：//www.tcmip.cn/）中的中藥材數(shù)據(jù)庫，收集中藥材當歸、金銀花、元參、黃芪、甘草所含有的化學成分，建立門氏保元湯的化學成分數(shù)據(jù)庫。

1.2 候選靶基因預測

通過整合藥理學平臺“整合藥理學分析工具”采取化學成分二維結構相似性搜索，即采用MACCS 分子指紋特征提取方法和Tani-moto 系數(shù)定義的相似度計量方法，針對中藥化學成分和美國食品藥品監(jiān)督管理局上市藥物進行相似性打分，從而獲取高可信度（相似度＞0.8）的中藥候選靶點譜，在平臺“中藥成分數(shù)據(jù)庫”版塊分別輸入當歸、金銀花、元參、黃芪、炙甘草，即可獲得不同的藥物的化學成分信息，并可提取不同成分對應靶點信息。

整合藥理學平臺TCMIP 平臺依托“人類表型本體數(shù)據(jù)庫（HPO）”“Drugbank 數(shù)據(jù)庫”“基因相關性數(shù)據(jù)庫（DisGeNET）”“治療靶點數(shù)據(jù)庫（TTD）”等資源，構建疾病和常見臨床表型相關基因數(shù)據(jù)庫。在平臺“疾病相關分子集及其功能挖掘”板塊以“allergic purpura”為疾病或癥狀進行檢索，提取檢索出來的所有治療靶點。

1.3 關聯(lián)網(wǎng)絡挖掘與分析

TCMIP 平臺整合了蛋白互作數(shù)據(jù)庫（Database of Interacting Protein，DIP）、分子交互數(shù)據(jù)庫（molecular interaction Database，MINT）人類蛋白質(zhì)參考數(shù)據(jù)庫（Human Protein Reference Database，HPRD）、反應途徑數(shù)據(jù)庫（Reactome Pathway Database，Reactome）等8 個現(xiàn)有的蛋白相互作用網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫的信息，通過整合藥理學平臺的蛋白相互作用網(wǎng)絡構建門氏保元湯的潛在作用靶點-過敏性紫癜疾病靶點的蛋白相互作用網(wǎng)絡。通過整合藥理學平臺網(wǎng)絡分析模塊，計算靶點之間的PPI 網(wǎng)絡特征值，以“節(jié)點連接度（degree）”的2 倍中位數(shù)為卡值，選取中藥靶點-疾病基因網(wǎng)絡的核心節(jié)點（hubs）；并且在此基礎上，以“節(jié)點連接度（degree）”“節(jié)點緊密度（closeness）”和“節(jié)點介度（betweenness）”的中位數(shù)為卡值，選取滿足3 個卡值的節(jié)點為關鍵靶點網(wǎng)絡，而后對關鍵靶點網(wǎng)絡進行富集分析，選取P 值前20 的通路，構建“中藥-成分-靶點-通路”的多維關系網(wǎng)絡，并對其進行可視化分析。

TCMIP 基于基因本體數(shù)據(jù)庫（gene ontology，GO）和京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫（kyoto Encyclopedia of genes and genomes，KEGG），確定藥物靶點所參與的生物學反應和通路。結合富集計算，獲得門氏保元湯及其治療過敏性紫癜關鍵網(wǎng)絡靶點的生物學功能及其所參與的網(wǎng)絡通路。按P 值大小取前20 個GO 及KEGG 分析結果。

2 結果

2.1 門氏保元湯的化學成分分析及靶標預測

門氏保元湯共收集化學成分301 個，化合物主要為黃酮類、三萜類和有機酸類等。當歸收集到的成分有66 個，主要為有機酸類和揮發(fā)油化合物；元參收集到的成分有30 個，主要為環(huán)烯醚萜苷、苯丙素苷類化合物；金銀花共收集化學成分47 個，主要為有機酸類、黃酮類、揮發(fā)油類化合物；黃芪共收集化學成分27 個，主要為三萜皂苷類、黃酮類化合物；甘草共收集化學成分131 個，主要為三萜類、黃酮類化合物。當歸的60 個化學成分共預測出251 個靶標，元參中30 個化學成分共預測出73 個靶標，金銀花中47 個化學成分共預測出133 個靶標，黃芪中27 個成分共預測出249 個靶標，甘草中131 個化學成分共預測出184個靶標。

對中藥方劑候選靶標進行功能分析（表1），可見候選靶標基因功能涉及輔因子代謝、四氫葉酸互變、一氧化氮合酶合成、肽基-絲氨酸磷酸化調(diào)節(jié)等條目。對中藥方劑候選靶標進行通路富集分析（表2），可見涉及通路有四氫蝶呤合成、葉酸和嘌呤代謝、細胞內(nèi)受體的類泛素化、核受體轉(zhuǎn)錄途徑等通路。

2.2 門氏保元湯治療過敏性紫癜的核心靶標網(wǎng)絡、基因功能和通路富集分析

通過整合藥理學平臺的網(wǎng)絡分析模塊，構建了門氏保元湯潛在靶點與疾病靶點相互作用網(wǎng)絡。根據(jù)上述條件共獲得62 個靶點并篩選出25個關鍵靶點（表5），采用PPI 模塊構建了“藥物-疾病核心靶點”網(wǎng)絡（圖1），圖中節(jié)點的大小與degree 呈正比。

GO 和KEGG 富集分析結果顯示，門氏保元湯對過敏性紫癜的干預機制涉及B 細胞增殖、一氧化氮生物合成過程、輔因子代謝過程、血小板聚集、細胞因子介導的信號通路等多個條目（表3）。通路富集分析結果顯示主要集中在NF-κB 信號通路異常導致免疫缺陷、血小板聚集、四氫蝶呤合成、內(nèi)皮型一氧化氮合酶激活、BRAF 的異常轉(zhuǎn)導以及BRAF 對RAF 激酶的異常激活等通路（表4）。

2.3 門氏保元湯治療過敏性紫癜的“中藥-成分-靶標-通路”多維網(wǎng)絡分析

表1 門氏保元湯候選靶點功能信息

表2 門氏保元湯候選靶點參與的通路信息

表3 門氏保元湯治療過敏性紫癜靶點生物過程富集分析

涉及到的通路主要有NF-κB 信號通路、血小板聚集、四氫蝶呤合成、內(nèi)皮型一氧化氮合酶激活、BRAF 編碼RAF 激酶等通路。從候選靶標網(wǎng)絡與“藥物-化學成分-靶標-通路”網(wǎng)絡圖（圖2），認為門氏保元湯對過敏性紫癜的干預作用與血小板代謝、NF-κB 信號通路以及BRAF 編碼RAF 激酶等有關。

表4 門氏保元湯治療過敏性紫癜靶點通路富集分析

表5 門氏保元湯治療過敏性紫癜關鍵靶點

3 討論

圖1 門氏保元湯治療過敏性紫癜靶點網(wǎng)絡

門氏保元湯由當歸、金銀花、元參、黃芪、炙甘草組成，黃芪多糖可以顯著增加胸腺和脾內(nèi)T 細胞的數(shù)量，進而促進IgG 的生成，從而提高機體的免疫功能；抑制血小板相關抗體，減少血小板的損傷與破壞［5］。黃芪甲苷、黃芪黃酮等能使血管的通透性得到改善，使毛細血管對損傷的抵抗力增強，使出血的風險得到降低［6］。當歸有機酸具有抑制抗血小板凝聚的作用，當歸多糖具有升高血小板和刺激骨髓造血的功能［7］。元參苯丙素苷能減少血管炎癥，元參環(huán)烯醚萜苷能有效抑制血小板聚集［8］。金銀花有機酸類化合物有抗血小板凝聚和保護內(nèi)皮細胞過氧化損傷的作用［9］。甘草中的甘草皂苷和甘草黃酮類能抑制致炎性因子，有明顯的抗變態(tài)反應作用［10］。

圖2 門氏保元湯治療過敏性紫癜“中藥-成分-核心靶點-通路”多維網(wǎng)絡關系

經(jīng)過富集分析得出，門氏保元湯治療過敏性紫癜與NF-κB 信號通路、內(nèi)皮型一氧化氮合酶激活、血小板代謝以及BRAF 編碼RAF 激酶有著密切的關系。研究發(fā)現(xiàn)NF-κB 是一種由兩個亞單位（P50 和P65）組成的二聚體［11］。由于NF-κB 參與多種蛋白基因轉(zhuǎn)錄，且與T 細胞的活化密切相關［12］。T 細胞過度激活是過敏性紫癜發(fā)病的機制之一，有研究認為黃芪能抑制NF-κB 的活性，從而減少T 細胞的過度活化［13］。NO 是具有免疫調(diào)節(jié)作用的小分子，可調(diào)節(jié)血管張力及血流速度，防止血小板黏附和血栓形成［14］。研究表明，黃芪多糖能激活被抑制的AMPK-eNOS 通路，進而保護血管內(nèi)皮細胞［15］。當歸能夠?qū)ρ“寰奂a(chǎn)生明顯的抑制作用，也可以提高已聚集血小板的解聚率［16］，從而對過敏性紫癜起到一定的治療作用。血小板膜糖蛋白（ITGA2B）是一類與血小板凝聚有關的蛋白，這類蛋白主要參與出血與凝血過程，并發(fā)揮著重要的作用。對于HSP 患兒來說，其自身的血小板聚集功能加強，因而存在血液的高凝狀態(tài)甚至會形成微血栓。ITGA2B 含量的增加是導致血小板凝聚、微血栓形成的關鍵原因［17］。而當歸有機酸、金銀花有機酸、元參環(huán)烯醚萜苷有抗血小板凝聚的作用，能降低細胞內(nèi)ITGA2B 的水平，從而對過敏性紫癜起到治療作用。有研究報道，BRAF 基因編碼RAF 家族蛋白激酶，該蛋白在調(diào)節(jié)MAPK-ErK 信號通路中起重要作用，影響細胞分裂，分化和分泌；并且影響著腫瘤的產(chǎn)生及進展，有著生長、增殖甚至是凋亡細胞的作用［18-19］。有研究發(fā)現(xiàn)可通過活化MAPK/Erk 信號通路，對糖尿病血管病變中起到抑制作用［20］，另有研究發(fā)現(xiàn)白芷提取物可能通過增加NO 和TNF-α 產(chǎn)物，激活MAPK 通路發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，進而抑制大腸癌瘤體的增長［21］。潘耀謙等［22］研究發(fā)現(xiàn)Erk 信號轉(zhuǎn)導通路通過強大的級聯(lián)反應參與了家兔腦炎原蟲性腦肉芽腫的形成，在腦肉芽腫形成過程中促進星形膠質(zhì)細胞、血管內(nèi)皮細胞和成纖維細胞增殖。

綜上所述，本研究借助整合藥理學這一新興學科理念及技術，對門氏保元湯治療過敏性紫癜的作用機制及藥效物質(zhì)基礎進行分析，既為該方未來的進一步研究提供理論依據(jù)，也為過敏性紫癜的臨床治療提供更加開闊的思路。