劉 瑞，泰 剛，王 瑞，張淑蓉

（1.山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西 晉中 030619；2.山西省食品藥品檢驗(yàn)所，山西 太原 030001）

桂枝為樟科植物肉桂Cinnamomum cassia Presl 的干燥嫩枝［1］，味辛、甘，性溫，具有發(fā)汗解肌、溫通經(jīng)脈、助化陽氣、平?jīng)_降氣等功效，在臨床上多用于風(fēng)寒感冒、脘腹冷痛、血寒經(jīng)閉、關(guān)節(jié)痹痛、痰飲、水腫、心悸、奔豚等［2-3］。桂枝臨床應(yīng)用廣泛，常與白術(shù)、麻黃、桃仁、芍藥和附子等配伍，其中用于治療風(fēng)寒表虛證的桂枝湯因其組方嚴(yán)謹(jǐn)，力效專宏而被譽(yù)為張仲景“群方之冠”。

目前桂枝的研究主要集中在桂枝中肉桂酸、肉桂醛等簡(jiǎn)單苯丙素類成分的研究及藥理作用方面，對(duì)桂枝中黃酮、木脂素和苷類等其他化學(xué)成分研究較少［4-5］。臨床應(yīng)用中，桂枝多以湯劑形式用藥，湯劑中所含成分復(fù)雜，且主要為水溶性成分，因此本文采用超高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道肼高分辨質(zhì)譜技術(shù)（ultrahigh performanceliquid chromatography-quadrupole/orbitrapmass spectrometry，UHPLC-Q/Orbitrap HRMS）對(duì)桂枝水提液的化學(xué)成分進(jìn)行研究。通過高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)解析，并結(jié)合對(duì)照品對(duì)照、質(zhì)譜裂解規(guī)律和相關(guān)文獻(xiàn)檢索等共鑒定出20 個(gè)水溶性化合物，為進(jìn)一步深入闡明桂枝的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、配伍機(jī)制及臨床應(yīng)用等相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

Dionex Ultimate 3000 二元超高壓液相色譜系統(tǒng)，Thermo Scientific Q-Exactive Focus 質(zhì)譜儀，電噴霧離子源，Xcalibur 工作站（美國(guó)Thermo Scientific 公司），BT25 電子分析天平（德國(guó)Sartorius）。

桂枝購(gòu)自山西省太原市同仁堂大藥房（產(chǎn)地廣西），經(jīng)山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥與食品工程學(xué)院裴香萍副教授鑒定為樟科植物桂枝的干燥嫩枝。肉桂酸（批號(hào)：180824），購(gòu)買于上海融禾醫(yī)藥科技有限公司，純度≥98%。乙腈（色譜純，美國(guó)賽默飛公司），甲酸（色譜純，天津科密歐試劑有限公司），水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與質(zhì)譜條件

色譜條件：Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm ID，1.7 μm）；流動(dòng)相為0.1%甲酸水（A）和乙腈（B），梯度洗脫程序?yàn)椋?～13 min，5%B～15%B；13～17 min，15%B；17～25 min，15%B～85%B；25～30 min，85%B。柱溫30 ℃，進(jìn)樣量2 μL，流速0.2 mL/min。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，鞘氣和輔助氣為高純氮?dú)?，碰撞氣體為高純氦氣，噴霧電壓正離子模式下為3.5 kV，負(fù)離子模式下為2.5 kV，離子傳輸管溫度300 ℃，輔助氣加熱溫度320 ℃，射頻透鏡電壓50 V。質(zhì)量掃描范圍為m/z 100～1500，正負(fù)離子切換掃描，一級(jí)質(zhì)譜全掃描結(jié)合數(shù)據(jù)依賴性二級(jí)質(zhì)譜掃描，分辨率：MS1-70 000 FWHM，MS2-17 500 FWHM，高能量碰撞解離（HCD）。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備 取桂枝9 g 置于圓底燒瓶中，加入10 倍量的水浸泡30 min，回流提取1 h，過濾；殘?jiān)偌尤?0 倍量的水回流提取1 h，過濾。合并2 次濾液，加熱濃縮至9 mL（約含生藥1 g/mL）。取溶液1 mL，加50%甲醇溶液10 mL 稀釋后，搖勻，0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 取肉桂酸對(duì)照品適量，精密稱定，加50%甲醇水制成濃度10 μg/mL的溶液，備用。

2.3 桂枝中水溶性成分解析

桂枝水提液在“2.1 項(xiàng)”色譜和質(zhì)譜條件下得到的總離子流圖，見圖1。根據(jù)Q-Orbitrap 高分辨質(zhì)譜的一級(jí)質(zhì)譜中化合物的準(zhǔn)分子離子、加和離子等信息推測(cè)精確分子量，Xcalibar 4.0 軟件在5 ppm質(zhì)量偏差范圍內(nèi)擬合其分子式；再根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜中碎片離子、裂解規(guī)律以及與對(duì)照品、參考文獻(xiàn)、PubChem、massbank 等數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)等方式對(duì)化學(xué)成分的推導(dǎo)鑒定和確證。最終，從桂枝水提液中鑒定了20 個(gè)化學(xué)成分，其中部分化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)式見圖2，鑒定結(jié)果見表1。

化合物2 準(zhǔn)分子離子峰m/z 153.018 1［M-H］-，Xcalibar 軟件擬合并推測(cè)其最可能的分子式為C7H6O4，二級(jí)質(zhì)譜中生成m/z 109.03［M-H-CO2］-，結(jié)合文獻(xiàn)［6］鑒定化合物2 為原兒茶酸?；衔?準(zhǔn)分子離子峰m/z 315.072 6［M-H］-，推測(cè)其最可能的分子式為C13H16O9，二級(jí)質(zhì)譜中失去1 分子六碳糖C6H10O5（162 Da）生成碎片離子m/z 153.02，并繼續(xù)失去1 分子CO2生成m/z 109.03，因此推測(cè)化合物1 為原兒茶酸葡萄糖苷。

圖1 桂枝總離子流圖（A：負(fù)離子模式；B：正離子模式）

圖2 桂枝中部分化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)式

圖3 肉桂醇苷裂解規(guī)律

表1 UHPLC-Q-Orbitrap-HRMS 鑒定桂枝的化學(xué)成分

化合物3 準(zhǔn)分子離子峰為137.023 1［M-H］-，推測(cè)其分子式為C7H6O3。二級(jí)質(zhì)譜中形成碎片離子m/z 119.02［M-H-H2O］-，m/z 109.02［M-H-CO］-，根據(jù)文獻(xiàn)［7］和MassBank 數(shù)據(jù)庫(kù)，推測(cè)其為對(duì)羥基苯甲酸。

化合物4 和5 的保留時(shí)間分別為8.81 和10.90 min，在負(fù)離子模式下準(zhǔn)分子離子峰均為m/z 289.072 2［M-H］-，正離子模式下準(zhǔn)分子離子峰均為m/z 291.086 5［M+H］+，故確定化合物的分子量為290，軟件擬合其分子式為C15H14O6。兩個(gè)化合物的二級(jí)質(zhì)譜碎片離子相同，均形成m/z 245［M-H-CO2］-，且形成m/z 125.02 1，4A-，1，3A m/z 137.02-，1，2Am/z 165.02 和［M-H-B 環(huán)］-m/z 179.03 等4 個(gè)兒茶素類化合物的特征性離子［8］，故推測(cè)化合物4 和5分別為兒茶素和表兒茶素。

化合物6 的保留時(shí)間為11.44 min，負(fù)離子模式下準(zhǔn)分子離子峰為m/z 327.108 6［M-H］-，655.225 0［2M-H］-，確定其分子量為328，軟件擬合其分子式為C15H20O8。二級(jí)質(zhì)譜中生成m/z 165.05［M-H-Glu］-，m/z 121.06［M-H-Glu-CO2］-，根據(jù)其裂解規(guī)律和文獻(xiàn)［9］推測(cè)其為二氫肉桂苷。

化合物7 和16 二者準(zhǔn)分子離子峰均為m/z 165.054 79［M+H］＋，二級(jí)質(zhì)譜中失去1 分子H2O生成m/z 147.04 碎片，繼續(xù)丟失1 分子CO 生成m/z 119.04，丟失1 分子CO 生成m/z 91.05 碎片，且比肉桂酸分子量多16，故推斷化合物6 和17為羥基肉桂酸及其異構(gòu)體。桂枝中含有較多的肉桂酸、羥基肉桂酸等具有C6～C3結(jié)構(gòu)的苯丙素類化合物及其衍生物，其二級(jí)質(zhì)譜中易脫去H2O、CO、CO2等小分子產(chǎn)生相應(yīng)的碎片離子峰。

化合物8 和9 互為同分異構(gòu)體，二者準(zhǔn)分子離子峰為m/z 581.224 7［M-H]-，m/z 627.230 1［MH+COOH]-，確定相對(duì)分子量為582，軟件擬合其分子式為C28H38O13。二級(jí)質(zhì)譜中脫去1 分子葡萄糖（162 Da）生成苷元離子m/z 419.171 4。繼而生成m/z 404.15［M-H-CH3］-，m/z 401.16［M-H-H2O］-，m/z 389.12［M-H-2CH3］-，m/z 373.13［M-H-H2O-CO］-，m/z 359.11［M-H-4CH3］-等碎片離子，根據(jù)以上數(shù)據(jù)并參考文獻(xiàn)［10-11］將其指認(rèn)為（+）南燭木樹脂酚-3α-O-β-D-葡萄糖苷和（-）-4-epi-南燭木樹脂酚-3α-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物10 的保留時(shí)間為14.52 min，負(fù)離子模式下準(zhǔn)分子離子峰為m/z 303.051 36［M-H］-，擬合其分子式為C15H12O7。其二級(jí)質(zhì)譜圖中生成m/z 285.04［M-H-H2O］-、m/z 275.05[M-H-CO］，m/z 259［M-H-CO2］-，m/z 241［M-H-CO2-H2O］-和C 環(huán)發(fā)生RDA 裂解生成m/z 125（A1，4-）等碎片離子。通過查閱文獻(xiàn)［12］，該化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律符合二氫槲皮素的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，因此鑒定化合物10 為二氫槲皮素。

化合物11 的保留時(shí)間為14.76 min，負(fù)離子模式下準(zhǔn)分子離子峰為m/z 427.161 2［M-H］-，m/z 473.166 8［M-H+HCOOH］-，軟件擬合其分子式為C20H28O10。根據(jù)其裂解規(guī)律推測(cè)為肉桂醇苷（絡(luò)塞維），二級(jí)質(zhì)譜中m/z 293.08 為母離子失去1 分子肉桂醇生成，m/z 133.06 為母離子失去結(jié)構(gòu)中的阿拉伯糖和葡萄糖形成的苷元肉桂醇，裂解規(guī)律見圖3。另可見阿拉伯糖（Ara）碎片離子131.03［Ara-HH2O］-、113.02［Ara-H-2H2O］-和葡萄糖（Glu）碎片離子161.04［Glu-H-H2O］-、143.03［Glu-H-H2OH2O］-、131.03［Glu-H2O-CH2O-H］-、119.03［Glu-H2O-C2H2O-H］-和113.02［Glu-H2O-CH2O-H2O-H］-。

化合物13 負(fù)離子模式下準(zhǔn)分子離子峰為m/z 429.177 3［M-H］-，其分子式為C20H30O10，比化合物11 分子量多2 Da，其二級(jí)質(zhì)譜中生成297.13［M-H-Ara］-，同時(shí)也生成阿拉伯糖（Ara）和葡萄糖（Glu）碎片離子相應(yīng)的碎片離子。絡(luò)塞維苷元肉桂醇結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)雙鍵，故推斷化合物13 為二氫絡(luò)塞維?；衔?2 和14 分別為絡(luò)塞維和二氫絡(luò)塞維的順反異構(gòu)體。

化合物18 保留時(shí)間為20.30 min，負(fù)離子模式下準(zhǔn)分子離子峰為m/z 147.043 91［M-H］-，二級(jí)質(zhì)譜裂解形成m/z 131.05［M+H-CO］-、m/z 103.05［M+H-CO2］-；正離子模式下準(zhǔn)分子離子峰為m/z 149.059 9［M+H］＋，二級(jí)質(zhì)譜裂解形成m/z 131.05［M+H-H2O］+、m/z 103.05［M+H-H2O-CO］＋的碎片離子，其質(zhì)譜裂解規(guī)律和文獻(xiàn)中肉桂酸相同［13］，并進(jìn)一步通過與對(duì)照品比對(duì)，確認(rèn)化合物18 為肉桂酸。

化合物15、17 和19 依此規(guī)律分別鑒定為甲氧基肉桂酸、香豆素和甲基肉桂酸。

化合物20 的保留時(shí)間為24.15 min，負(fù)離子模式下準(zhǔn)分子離子峰為m/z 295.097 6［M-H］-，推測(cè)其最可能的分子式為C28H38O13。二級(jí)質(zhì)譜中脫去1 分子H2O 生成碎片離子m/z 277.09，繼而丟失1 分子CO2生成碎片離子m/z 233.10，根據(jù)其質(zhì)譜裂解規(guī)律，并參照文獻(xiàn)［14］暫定化合物20 為（3-methoxy-5H-9，11-dioxabenzo［3，4］-cyclohepta-［1，2-f］-iden-7-yl）metahnol。

3 討論

中藥為公認(rèn)的復(fù)雜體系，其整體藥效表征具有多成分、弱效應(yīng)、協(xié)調(diào)整合作用等特點(diǎn)。繁雜多樣的化學(xué)成分是中藥及其方劑發(fā)揮多種藥理活性的物質(zhì)基礎(chǔ)。隨著現(xiàn)代儀器分析技術(shù)的快速發(fā)展，液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)把色譜的高分離性能和質(zhì)譜的高選擇性、高靈敏度及碎片離子重現(xiàn)性好的優(yōu)點(diǎn)結(jié)合起來［15］，已被廣泛用于中藥及其制劑的研究，極大地推動(dòng)了中藥現(xiàn)代化的發(fā)展。

本研究采用超高效液相色譜-四級(jí)桿/靜電場(chǎng)軌道肼高分辨質(zhì)譜對(duì)桂枝藥材水煎液的成分進(jìn)行了較為全面的分析，基于化合物的精確分子量、裂解特征、相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)和參考文獻(xiàn)，鑒定了桂枝藥材水煎液中20 種化合物，包括苯丙素、苯丙素苷、木脂素、黃酮、倍半萜和小分子有機(jī)酸等多種類型的化合物，研究結(jié)果為進(jìn)一步闡明桂枝及其方劑的藥效物質(zhì)及作用機(jī)制提供了科學(xué)的依據(jù)。