陳德勝，張 晨，劉子歌，宋國瑞，郭鳳英，李 燕

（1.寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院，銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學臨床醫(yī)學院，銀川 750004；

3.寧夏醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，銀川 750004）

骨性關節(jié)炎、類風濕性關節(jié)炎、痛風性關節(jié)炎是臨床常見關節(jié)疾患，主要有關節(jié)疼痛、腫脹、活動受限等臨床表現(xiàn)，發(fā)展到中晚期會出現(xiàn)關節(jié)屈曲攣縮畸形。人工關節(jié)置換術是治療關節(jié)終末期疾病的有效治療手段，很大程度地提高了患者生活質(zhì)量[1-2]。經(jīng)前期研究證實[3-4]：磨損顆粒隨著假體植入機體內(nèi)的時間推移，不斷聚集在關節(jié)間隙，并進入骨-假體的界膜組織內(nèi)，從而激活巨噬細胞，釋放腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）等大量強效溶骨細胞因子和炎性介質(zhì)，進一步誘導假體周圍骨組織的破骨細胞增殖、成熟、活化，引起一系列溶骨反應，導致假體周圍骨溶解，假體失效。因此，尋找一種行之有效的方法預防和治療假體后無菌性松動是目前關節(jié)外科關注的熱點。

與調(diào)控無菌性松動所致骨溶解有關聯(lián)的信號轉(zhuǎn)導通路有絲裂源活化蛋白激酶（MAPK）、核轉(zhuǎn)錄因子kappa B（NF-κB）、P13t信號轉(zhuǎn)導通路Wnt信號轉(zhuǎn)導通路等，而MAPK信號轉(zhuǎn)導通路是極其重要的相關通路。細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）是MAPK家族中的重要成員之一[5]。近期研究[6-9]證實，ERK信號轉(zhuǎn)導通路不僅參與骨重建的調(diào)節(jié)可能在人工關節(jié)置換術后無菌性松動的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用。本文以小鼠Air pouc氣囊植骨動物模型為研究對象，鈦顆粒為研究因素，ERK信號轉(zhuǎn)導通路及其下游炎性因子TNF α為作用靶點，探討ERK抑制劑PD98059在無菌性松動中潛在的預防和治療價值。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

鈦顆粒購自美國Alfa Aesar公司，顆粒直徑＜20μm。內(nèi)毒素檢測試劑盒購自廈門市鱟試劑實驗廠有限公司，ERK選擇性抑制劑PD9805購自美國Sigma公司。

1.2 實驗動物

選用雌性SPF級BALB/c小鼠70只，體質(zhì)量為（25±5）g，8～10周齡，健康狀況良好。本實驗經(jīng)寧夏醫(yī)科大學實驗動物管理和使用委員會審批通過［批準號：SCXK（京）2016-0006］，符合動物倫理要求，所有動物飼養(yǎng)及動物實驗均在寧夏醫(yī)科大學實驗動物中心SPF級動物房完成。

1.3 實驗方法

1.3.1 磨損顆粒的內(nèi)毒素去除處理并檢測 將鈦顆粒放置燥箱內(nèi)180℃焙烤6 h后浸泡在70%乙醇里，離心、沉淀出鈦顆粒，反復多次進行此循環(huán)操作，加PBS洗滌、離心、干燥，通過紫外線持續(xù)照射消毒，加PBS，配制成鈦顆粒懸液（300 mg·mL-1），放置4℃?zhèn)溆?。鈦顆粒懸液加入內(nèi)毒素檢測試劑，按照試劑盒說明順序，進行鈦顆粒內(nèi)毒素檢測陰性后備用。

1.3.2 小鼠Air pouch氣囊植骨動物模型建立 采用文獻[10]中的手術方法建立小鼠Air pouch氣囊植骨動物模型。將小鼠腹腔麻醉，待麻醉成功后，在其背部注射2 mL無菌空氣形成氣囊；在以后的6 d內(nèi)，連續(xù)每天向小鼠背部氣囊中注射0.5 mL無菌空氣，第7天氣囊形成；再隨機選同品系同齡小鼠處死，常規(guī)消毒鋪巾后，取出其顱骨骨片，剔除多余的軟組織。切開氣囊，植入小鼠顱骨骨片，縫合切口。

1.3.3 動物模型分組和處理 將45只SPF級BALB/c雌性小鼠隨機分為空白對照組、鈦顆粒刺激組和鈦顆粒+ERK抑制劑組，每組15只。另選25只SPF級BALB/c同品系同齡雌性小鼠，作為磨損顆粒誘導骨溶解動物模型植骨的供體，每只小鼠可提供兩片用于植骨的顱骨骨片，大小約0.5 cm×0.25 cm×0.1 cm?？瞻讓φ战M：植骨后小鼠氣囊內(nèi)立即注射0.1 mL PBS液。每日1次腹腔注射0.1 mL生理鹽水，持續(xù)14 d。鈦顆粒刺激組：植骨后小鼠氣囊內(nèi)立即注射0.1 mL處理好的鈦顆粒懸液。每日1次腹腔注射0.1 mL生理鹽水，持續(xù)14 d。鈦顆粒+ERK抑制劑組：植骨后小鼠氣囊內(nèi)立即注射0.1 mL處理好的鈦顆粒懸液，每日1次腹腔注射0.1 mL·kg-1ERK抑制劑PD98059，持續(xù)14 d。之后將三組動物同時間處死，取出小鼠顱骨及其囊壁組織。

將小鼠顱骨及其囊壁組織置于12.5%EDTA脫鈣液脫鈣2周；再經(jīng)自動脫水機處理后進行石蠟包埋，制作成組織蠟塊。做4μm連續(xù)切片，撈片到載玻片上，置于烤箱中烘烤后備用。

1.3.4 蘇木素-伊紅染色（HE） 將準備好的切片先后置入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ以及不同濃度乙醇中浸泡，用蒸餾水洗滌；加蘇木素，持續(xù)14 d清水沖洗，鹽酸乙醇分化，再自來水沖洗，用0.6%氨水返藍，流水沖洗殘液；再將切片置入伊紅染液中染色；再置入95%乙醇I、乙醇II、無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中脫水透明；中性樹膠對已脫水的切片進行封片。

1.3.5 抗酒石酸酸性磷酸酶染色（TRAP） 對破骨細胞的觀察和確定具有特異性，用于檢測磨損顆粒誘導炎性骨溶解中產(chǎn)生的TRAP染色陽性細胞（破骨細胞樣細胞）數(shù)目。嚴格按照美國Sigma公司TRAP試劑盒進行操作。將脫鈣后的小鼠顱骨及其囊壁組織石蠟切片二甲苯脫蠟后，依次經(jīng)過不同濃度乙醇階梯脫水，雙蒸水沖洗；放入丙酮溶液中固定，雙蒸水沖洗，將玻片放入暗盒內(nèi)，加入新鮮配制的TRAP染液，染液須完全覆蓋切片，37℃水浴鍋避光孵育1 h；雙蒸水沖洗，蘇木素復染，自來水沖洗、晾干，中性樹膠封片。

1.3.6 免疫組織化學染色 切片在68℃中烤片2 h后置入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ、95%乙醇、80%乙醇浸泡，自來水、蒸餾水沖洗；3%H2O2孵育，將切片小心放入0.01 mol·L-1檸檬酸緩沖液中進行抗原修復，滴加羊血清于玻片封閉，PBS液沖洗，滴加ERK多克隆抗體及TNF-α多克隆抗體（購自英國Abcam公司）孵育，4℃過夜，PBS沖洗3次。滴加山羊抗兔IgG（北京中杉金橋生物技術有效公司），37℃孵育，PBS沖洗。滴加辣根過氧化物酶標記鏈霉抗生物素蛋白稀釋液，37℃孵育。滴加DAB液靜置數(shù)分鐘，置于顯微鏡下觀察顯色，適時終止，用流水沖洗。蘇木素液對已顯色的切片復染，流水輕洗；1%鹽酸乙醇分化，流水輕洗；碳酸鋰返藍，流水輕洗。95%乙醇、無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ浸泡，中性樹脂封片。

三組免疫組化染色切片通過顯微鏡下觀察結(jié)果并進行圖像采集。觀察可見組織標本中出現(xiàn)細胞胞漿或細胞質(zhì)中的棕黃色顆粒分布視為陽性表達，每張免疫組化切片隨機選取5個表達的高倍鏡（10×40）視野，需確保每張圖像的位置以及背景亮度一致。將采集圖像運用Image-Pro軟件進行分析，確定統(tǒng)一的測定標準，計算分析后得到平均光密度（AOD）值。

1.4 統(tǒng)計學方法

資料運用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間比較采用方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用SNK法，P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠植骨氣囊病理變化

HE染色結(jié)果顯示，空白對照組未見鈦顆粒，沒有明顯的炎性反應，囊壁組織分布著少量的中性粒細胞、淋巴細胞等炎癥細胞，所植顱骨骨塊邊緣表面光滑，完整；鈦顆粒刺激組可見植骨氣囊的囊壁增厚，組織中存在明顯的炎性反應，有大量炎性細胞浸潤，主要為中性粒細胞及嗜酸性粒細胞等，氣囊組織中可見大量的鈦顆粒，植骨的顱骨骨塊表面存在侵蝕作用，表現(xiàn)為顱骨骨塊邊緣欠光整，有部分缺損。與鈦顆粒刺激組比較，鈦顆粒+ERK抑制劑組可見氣囊組織厚度相對較薄，氣囊中炎性細胞減少，所植顱骨骨塊邊緣的溶骨反應減輕，見圖1。

2.2 小鼠植骨氣囊中溶骨性變化

空白對照組中可見少量的TRAP染色陽性細胞，陽性染色面積較小，染色較淺；鈦顆粒刺激組，植入顱骨骨塊囊壁中TRAP染色陽性細胞數(shù)目顯著增多，陽性染色面積較大，染色較深；與空白對照組相比，鈦顆粒刺激組、鈦顆粒+ERK抑制劑組TRAP染色陽性細胞增多；與鈦顆粒刺激組相比，鈦顆粒+ERK抑制劑組中TRAP染色陽性細胞數(shù)目減少，見圖2、表1。

2.3 免疫組織化學染色檢測植骨氣囊中ERK及TNF-α的陽性表達

2.3.1 三組植骨氣囊中ERK的陽性表達 空白對照組小鼠植骨氣囊組織中囊壁的纖維細胞的胞漿中可見少量的ERK染色陽性細胞，陽性染色較淺，有一定的陽性表達（圖3A）；鈦顆粒刺激組，植入顱骨骨塊囊壁中ERK染色陽性細胞數(shù)目顯著增多，陽性表達較高（圖3B）；鈦顆粒+ERK抑制劑組中ERK染色陽性細胞數(shù)目及陽性表達與鈦顆粒刺激組比較相對減少（圖3C）。

運用Image-Pro軟件進行分析后，與空白對照組相比，鈦顆粒刺激組、鈦顆粒+ERK抑制劑組ERK染色陽性細胞增多（P＜0.05）；與鈦顆粒刺激組相比，鈦顆粒+ERK抑制劑組中ERK染色陽性細胞數(shù)目減少（P＜0.05），見表2。

圖1 三組植骨氣囊HE染色結(jié)果（HE×10）

圖2 三組小鼠植骨氣囊溶骨性變化結(jié)果（TRAP×200）

表1 三組植骨氣囊TRAP染色陽性細胞數(shù)目比較（x±s，個）

圖3 三組小鼠ERK免疫組化結(jié)果（×20）

表2 三組植骨氣囊中ERK免疫組化陽性表達的結(jié)果比較（x±s）

2.3.2 三組植骨氣囊中TNF-α的陽性表達 空白對照組小鼠中植骨氣囊組織中囊壁的纖維細胞的胞漿中可見少量的TNF-α染色陽性細胞，陽性染色淺；鈦顆粒刺激組，植入顱骨骨塊囊壁中TNF-α染色陽性細胞數(shù)目增多，陽性表達增高；鈦顆粒+ERK抑制劑組中TNF-α染色陽性細胞數(shù)目及陽性表達與鈦顆粒刺激組相比減少，見圖4。

運用Image-Pro軟件進行分析后，與空白對照組相比，鈦顆粒刺激組、鈦顆粒+ERK抑制劑組TNF-α染色陽性細胞增多（P＜0.05）；與鈦顆粒刺激組相比，鈦顆粒+ERK抑制劑組中TNF-α染色陽性細胞數(shù)目減少（P＜0.05），見表3。

3 討論

人工關節(jié)置換術是目前骨關節(jié)終末期疾病最為有效的治療手段，該手術可重建關節(jié)形態(tài)，緩解患者疼痛，改善關節(jié)功能，使患者生活質(zhì)量得到很大提高。假體周圍無菌性松動是人工關節(jié)置換術后最為首要的并發(fā)癥。目前研究表明[11-12]，假體植入體內(nèi)產(chǎn)生的磨損顆粒刺激人工關節(jié)界膜組織中巨噬細胞激化，引起一系列炎性反應，炎性細胞因子可致破骨細胞增殖成熟活化，引起骨組織溶骨性改變，出現(xiàn)人工關節(jié)無菌性松動。

磨損顆粒刺激人工關節(jié)局部產(chǎn)生的各種細胞因子可通過多種信號轉(zhuǎn)導通路單一或者協(xié)同調(diào)控破骨細胞分化成熟，ERK通路是其中之一。ERK信號轉(zhuǎn)導通路又稱p42/p44 MAPK通路，磷酸化激活后的ERK從細胞胞質(zhì)向細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，參與細胞增殖與分化、細胞形態(tài)完整性的維持、細胞基本結(jié)構的構建以及細胞凋亡等一系列分子生物學反應[7]。

圖4 三組植骨氣囊中TNF-α免疫組化陽性表達的結(jié)果（×200）

表3 三組植骨氣囊中TNF-α免疫組化陽性表達的結(jié)果比較（x±s）

磨損顆粒在假體周圍界膜組織中誘發(fā)巨噬細胞，釋放TNF-α、MMP-9等大量細胞因子和炎性介質(zhì)，進一步誘導假體周圍骨組織的破骨細胞激活，活化從而產(chǎn)生骨溶解反應，導致無菌性炎性骨溶解[5]。ERK作為MAPK信號通路家族的成員，當細胞受到磨損顆粒刺激時也相應激活，參與炎性反應過程[13]。TNF-α是機體介導炎性反應的關鍵炎性因子，當磨損顆粒刺激巨噬細胞后，TNF-α協(xié)同巨噬細胞釋放多種炎性因子和細胞因子，發(fā)揮“級聯(lián)放大”的作用，在整個炎性反應中，TNF-α作為ERK信號通路的下游炎性因子，有著重要的始動作用[14]。

有研究[15]證實，在ERK信號轉(zhuǎn)導通路調(diào)控下，LPS作用于M-SCF刺激破骨細胞成熟分化，通過ERK抑制劑PD98059干預后，可抑制LPS介導下的TNF-α、MIP-la的表達。Ang等[16]通過體外實驗，運用紫杉醇作用于鈦顆粒刺激小鼠RAW 264.7巨噬細胞出現(xiàn)炎性因子及破骨細胞生成，以及作用于體內(nèi)實驗的鈦顆粒刺激小鼠顱骨產(chǎn)生骨溶解，證實紫杉醇可以通過抑制NF-KB和ERK信號轉(zhuǎn)導通路，最終有效地抑制鈦顆粒誘導骨溶解的生物學反應。還有體外實驗[17]將Sargachromanol G作用于磨損顆粒刺激的巨噬細胞，證實Sargachromanol G通過NF-KB和ERK兩條信號轉(zhuǎn)導通路抑制破骨細胞的分化和增殖。

本實驗研究中，選用小鼠顱骨植入Air pouch氣囊，加入鈦顆粒刺激建立磨損顆粒骨溶解動物模型，在此基礎上，選用ERK選擇性抑制劑PD98059作用于該動物模型。結(jié)果顯示，ERK抑制劑PD98059可以減輕鈦顆粒刺激小鼠顱骨植入Air pouch氣囊中炎性細胞浸潤及炎性反應；TRAP染色結(jié)果證實，ERK抑制劑PD98059可以減少鈦顆粒刺激后破骨樣細胞的陽性細胞數(shù)目及陽性表達區(qū)域；并且在免疫組化染色結(jié)果看到，ERK抑制劑PD98059抑制了鈦顆粒刺激下小鼠顱骨植入Air pouch氣囊中ERK與其下游炎性因子TNF-α的陽性表達。通過下調(diào)ERK信號通路蛋白表達，而其表達的下調(diào)使得多種轉(zhuǎn)錄因子基因蛋白的活性降低，從而抑制ERK信號通路下游炎性因子蛋白TNF-α的表達。

綜上所述，ERK信號轉(zhuǎn)導通路在磨損顆粒誘導的骨溶解中發(fā)揮重要作用。ERK信號轉(zhuǎn)導通路可能影響破骨細胞的分化和活化，進而調(diào)控炎性骨溶解發(fā)生、發(fā)展，可為延緩和抑制假體周圍骨溶解引起的無菌性松動尋找有效的途徑和方法。