陳世梁，吳文川，胡莎莎，盧志承

真菌感染是臨床上較常見的感染性疾病，部分真菌感染病灶和炎癥、結(jié)核、腫瘤病灶難以鑒別，常用Grocott六胺銀染色檢測組織中的真菌來確診。近年來由于環(huán)境惡化和廣譜抗生素、抗腫瘤藥物、免疫抑制劑的廣泛使用，以及臨床上侵入性操作的普遍開展，使人體抵抗力下降，導(dǎo)致真菌感染性疾病日益增多[1-2]。因此，Grocott六胺銀染色檢測真菌的應(yīng)用越來越廣泛，這就需要更高質(zhì)量的染色效果。為提高染色質(zhì)量，本文對傳統(tǒng)方法進(jìn)行了改良，在實(shí)踐工作中取得了比較滿意的效果，現(xiàn)介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料選取海南省人民醫(yī)院送檢真菌感染的活檢標(biāo)本29例,其中肺15例，鼻部4例，扁桃體3例，淋巴結(jié)3例，足2例，肝1例，角膜1例。所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)取材、脫水、透明、浸蠟、包埋。

1.2 主要儀器GZX-GF-MBS電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，購自上海躍進(jìn)醫(yī)療器械公司；LEICA CM2245切片機(jī)，購自德國徠卡公司；櫻花VIP-6脫水機(jī)，購自日本。

1.3 試劑及配制(1)六胺銀原液：將5%硝酸銀5 mL加入到3%六次甲基四胺100 mL內(nèi)，即形成白色沉淀，慢慢搖動(dòng)至沉淀溶解變清，用棕色瓶裝，4 ℃保存[3]。(2)傳統(tǒng)六胺銀工作液：六胺銀原液25 mL，蒸餾水25 mL，5%四硼酸鈉2 mL，依次加入，混合后即可使用。(3)改良六胺銀工作液：六胺銀原液10 mL，蒸餾水25 mL，5%四硼酸鈉2 mL，依次加入，混合后即可使用。(4)5%鉻酸水溶液：鉻酸5 g，蒸餾水100 mL。(5)8%鉻酸水溶液：鉻酸8 g，蒸餾水100 mL。(6)0.5%偏重亞硫酸鈉水溶液：偏重亞硫酸鈉0.5 g，蒸餾水100 mL。(7)0.2%氯化金水溶液：氯化金0.2 g，蒸餾水100 mL。(8)0.1%氯化金水溶液：氯化金0.1 g，蒸餾水100 mL。(9)5%硫代硫酸鈉：硫代硫酸鈉5 g，蒸餾水100 mL。(10)橙黃G液：橙黃G 2 g，磷鎢酸5 g，蒸餾水100 mL。

1.4 方法29例蠟塊每例分別4 μm厚切片2張，分成傳統(tǒng)組和改良組，分別按各自的染色方法進(jìn)行染色。

1.4.1傳統(tǒng)Grocott六胺銀染色法 (1)切片常規(guī)脫蠟至水，蒸餾水洗；(2)5%鉻酸溶液氧化1 h，流水沖洗，再用蒸餾水洗2次；(3)5%偏重亞硫酸鈉水溶液處理1 min；(4)流水沖洗5 min，再用蒸餾水浸洗2次；(5)置入傳統(tǒng)六胺銀工作液1～1.5 h(于45～50 ℃溫箱內(nèi))，至切片呈黃褐色，鏡下觀察真菌呈黑褐色為止；(6)蒸餾水浸洗3次；(7)滴入0.2%氯化金溶液調(diào)色3 min，蒸餾稍洗；(8)5%硫代硫酸鈉處理2 min；(9)流水沖洗5 min；(10)橙黃G液復(fù)染30 s，流水稍洗；(11)常規(guī)脫水透明，中性樹膠封固[4]。

1.4.2改良Grocott六胺銀染色法 本實(shí)驗(yàn)主要對以下3個(gè)關(guān)鍵步驟進(jìn)行改良：第(2)步改為8%鉻酸溶液氧化20 min；第(5)步改為切片置入預(yù)熱至60 ℃的改良六胺銀工作液內(nèi)，于60 ℃溫箱內(nèi)作用20～60 min，至切片呈淡黃色，鏡下觀察真菌呈黑褐色為止；第(7)步改為滴入0.1%氯化金溶液調(diào)色1 min(顯微鏡下觀察)。其余染色步驟同傳統(tǒng)染色法。

2 結(jié)果

29例標(biāo)本經(jīng)兩種方法染色的真菌檢出率均為100%，但改良染色法染色效果優(yōu)于傳統(tǒng)法。改良染色法真菌呈棕黑至黑色，菌體和背景著色適度，對比明顯而清晰(圖1)；傳統(tǒng)染色法真菌呈棕黑至黑色，背景欠清，菌體與組織混雜(圖2)。

圖1 肺組織中隱球菌呈棕黑至黑色，菌體與背景著色對比清晰，改良Grocott六胺銀染色法 圖2 肺組織中隱球菌呈棕黑至黑色，背景欠清，菌體與組織混雜，傳統(tǒng)Grocott六胺銀染色法

3 討論

在患者活檢組織中找到真菌是診斷真菌感染的金標(biāo)準(zhǔn)，而常規(guī)HE染色中大部分真菌著色不佳，易漏診，需用特殊染色法顯示，最常用的是Grocott六胺銀染色[5-6]。傳統(tǒng)Grocott六胺銀染色存在染色時(shí)間過長、易過染、背景不清晰等缺點(diǎn)，為提高染色效果，本科室作了一些改良。

3.1 加強(qiáng)氧化Grocott六胺銀染色的機(jī)制是各種真菌菌壁都含有多糖類物質(zhì)，鉻酸氧化真菌內(nèi)多糖化合物而暴露出醛基，游離的醛基還原六胺銀的銀離子成黑色的金屬銀而顯色。要在組織切片上清晰顯示真菌，必須做到氧化充分，傳統(tǒng)法是5%鉻酸氧化1 h，改良法用8%鉻酸氧化20 min即可，一方面縮短了染色時(shí)間，同時(shí)也避免氧化時(shí)間過長造成的組織結(jié)構(gòu)破壞；另一方面8%鉻酸有更強(qiáng)的氧化能力，暴露出更多的醛基，增強(qiáng)了染色的敏感性。

3.2 適當(dāng)降低六胺銀工作液銀濃度傳統(tǒng)法六胺銀工作液中銀的含量較高，真菌著色太快，不易操作，如果溫度過高或染色時(shí)間過長都會(huì)過染，一旦過染經(jīng)水洗和氯化金調(diào)色，也難以將組織切片上非特異性著色清洗干凈，影響染色效果。傳統(tǒng)法工作液的配制是六胺銀原液25 mL，蒸餾水25 mL，5%四硼酸鈉溶液2 mL；而改良法是六胺銀原液10 mL，蒸餾水25 mL，5%四硼酸鈉溶液2 mL，通過降低原液的量而降低了改良六胺銀工作液中銀的含量，真菌著色反應(yīng)比較溫和，容易控制溫度和染色時(shí)間。

3.3 控制染色的溫度和時(shí)間溫度在六胺銀染色中至關(guān)重要，溫度在60 ℃以下，組織反應(yīng)緩慢，浸染時(shí)間長，溫度如果更低，則幾乎不反應(yīng)；溫度過高，組織反應(yīng)快，易過染，難以控制。六胺銀染色時(shí)間的長短受染液的銀濃度和染色溫度影響，染色時(shí)間過短，染色反應(yīng)不足，真菌著色淺，不能清晰顯示出來；染色時(shí)間過長，染色反應(yīng)過度，真菌著色很深，易出現(xiàn)銀鏡反應(yīng)，切片背景較臟，影響對比度。本科室使用的改良方法是預(yù)先打開烤箱將溫度設(shè)置為60 ℃，滴上8%鉻酸開始氧化后即配制工作液，放入烤箱中預(yù)熱，等操作到浸染步驟時(shí)溫度也達(dá)到60 ℃，不僅保證工作液質(zhì)量，又有效地縮短了反應(yīng)時(shí)間。浸染20 min后仔細(xì)觀察切片，染成淡黃色即取出，經(jīng)蒸餾水洗后，在顯微鏡下觀察是否有菌體出現(xiàn)，如有淡棕色菌體出現(xiàn)，每隔5 min取出鏡檢以控制菌體著色深淺，直至認(rèn)為顯色恰當(dāng)為止。

3.4 靈活掌握氯化金液調(diào)色程度組織經(jīng)六胺銀工作液浸染后，經(jīng)氯化金作用可排除組織中的黃色色調(diào)，使多余的銀與氯作用產(chǎn)生氯化銀，然后再用硫代硫酸鈉溶液洗去組織上未還原的銀鹽，從而使組織內(nèi)各種成分顯示得更為清晰，已反應(yīng)的銀鹽被固定得更加牢固[7]。傳統(tǒng)法使用0.2%氯化金調(diào)色3 min，在實(shí)踐中我們發(fā)現(xiàn)使用此調(diào)色方法容易使著色的真菌顏色變淺呈灰色，影響觀察。改良法用0.1%氯化金調(diào)色1 min，在顯微鏡下觀察，多余的黑色沉淀變淺色至消失，蒸餾水稍洗。通過降低氯化金濃度和顯微鏡觀察，能更好把控調(diào)色程度，真菌顯示清晰，背景干凈。

3.5 其他提高Grocott六胺銀染色質(zhì)量，還需注意以下細(xì)節(jié)：(1)切片脫蠟要徹底，否則影響鉻酸有效氧化，妨礙染色。(2)玻璃器皿，應(yīng)預(yù)先用硫酸洗液浸泡過并沖洗干凈，以避免留有的雜質(zhì)與銀發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，造成染液混濁現(xiàn)象。(3)試劑均為分析純，因?yàn)樵噭┘兌仍礁呷旧Y(jié)果越敏感。(4)六胺銀工作液要現(xiàn)配、現(xiàn)用，一般只用1次。(5)嚴(yán)格控制染色時(shí)間，銀浸染步驟隨時(shí)觀察染色進(jìn)度，及時(shí)終止染色。