賀國洋，李 巍，周 琳，趙文麗，王永強(qiáng)，朱會芳，李 娜，崔 靜，王永霞，千新來

目前，結(jié)直腸癌的發(fā)病率呈逐年上升且年輕化趨勢，嚴(yán)重威脅人類健康[1]，其中20%～40%的結(jié)直腸癌患者確診時已經(jīng)合并遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致結(jié)直腸癌患者死亡的主要原因[2-4]。過氧化物酶體膜蛋白4(peroxisomal membrane protein 4, PXMP4)基因定位于20q11.12，編碼含212個氨基酸的多通道跨膜蛋白，是PXMP2/4家族的重要成員[5-6]?，F(xiàn)階段PXMP4在結(jié)直腸癌中作用及其機(jī)制尚未見報道。本實驗旨在探討PXMP4對結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲的影響，為結(jié)直腸癌的早期診斷和靶向治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑收集2013～2017年新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院結(jié)直腸癌標(biāo)本和距腫瘤邊緣≥5 cm正常腸黏膜組織各112例。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者術(shù)前均未行放、化療和免疫治療，具有手術(shù)治療適應(yīng)癥，符合結(jié)直腸癌手術(shù)病理學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)。人結(jié)直腸癌細(xì)胞株購自中科院上海細(xì)胞庫，構(gòu)建PXMP4-HA過表達(dá)質(zhì)粒，干擾片段購自廣州銳博公司。E.Coli DH5α大腸桿菌為本實驗室自存。Lipofectamine 2000、RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購自大連Takara公司；引物購自美國Invitrogen公司；抗PXMP4抗體購自美國Abcam公司；抗HA抗體和Tublin抗體均購自賽默斯生物公司。PBS緩沖液、檸檬酸鈉抗原修復(fù)液、胰蛋白酶、Western blot一抗稀釋液、凝膠配制試劑盒、PMSF、RIPA裂解液BCA蛋白濃度測定，均購自上海碧云天公司；Transwell小室購自美國康寧公司；CCK-8購自日本同仁科技公司。

1.2 方法

1.2.1生物信息學(xué)數(shù)據(jù)處理 登錄Oncomine數(shù)據(jù)庫(https://www.oncomine.org/resource/login.html)，在搜索框中輸入基因名“PXMP4”，選擇Cancer type：Colorectal cancer，點擊Gaedcke Colorectal數(shù)據(jù)進(jìn)入數(shù)據(jù)獲取頁面并下載數(shù)據(jù)，分析PXMP4在結(jié)直腸癌及正常腸黏膜組織中的表達(dá)。

1.2.2免疫組化 采用免疫組化SP法染色，標(biāo)本均經(jīng)4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，脫蠟，水化，PBS清洗。高壓修復(fù)、室溫冷卻，PBS清洗，加入3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化氫酶，PBS沖洗3次。山羊血清封閉1 h，甩干血清后，直接加入PXMP4特異性抗體，于4 ℃冰箱孵育過夜。次日，室溫下放置1 h。滴加山羊抗兔二抗，37 ℃孵育30 min，PBS清洗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染、流水藍(lán)化、梯度乙醇脫水、二甲苯透明，中性樹膠封固。應(yīng)用半定量積分法進(jìn)行染色細(xì)胞判讀，隨機(jī)選取10個高倍視野。(1)根據(jù)陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)計分：陽性細(xì)胞數(shù)≤25%為1分，26%～50%為2分，>50%為3分；(2)根據(jù)陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度計分：未著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分[7]。將兩項得分結(jié)果相乘：0～3分為陰性，4～6分為陽性。

1.2.3細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 人結(jié)直腸癌細(xì)胞株均用含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基，于5%CO2的37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)。過表達(dá)組：空細(xì)胞組、空載組、PXMP4-HA組。干擾組：空細(xì)胞組、陰性對照組、干擾片段1組/2組/3組。轉(zhuǎn)染前對結(jié)直腸癌細(xì)胞株進(jìn)行傳代，計數(shù)8.0×105個細(xì)胞均勻接種于6孔板中，使用無雙抗的培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞生長密度約70%時，再行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。按照Lipofectamine 2000使用說明書制備A液與B液混勻，室溫靜置20 min后加入6孔板中，總體積為2 μL。置于5%CO2的37 ℃恒溫箱中孵育6 h，更換為正常培養(yǎng)基24 h，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.4Western blot法 本實驗提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測蛋白濃度。取已變性蛋白質(zhì)30 μg和5 μL蛋白預(yù)染Marker，行SDS-PAGE凝膠電泳后移至PVDF膜，用5%脫脂牛奶室溫封閉1～2 h。加入一抗(1 ∶500)，4 ℃搖床孵育過夜，TBST清洗3次；加入二抗(1 ∶2 000)搖床室溫孵育2 h，TBST清洗3次，ECL發(fā)光成像。

1.2.5RT-PCR實驗 提取細(xì)胞總RNA，Nanodrop 2000核酸蛋白測定儀檢測RNA濃度和純度，使用Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA轉(zhuǎn)錄成為cDNA。反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min；85 ℃ 5 s。按Takara熒光定量試劑盒說明書操作步驟進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s。用 2-ΔΔCt法計算PXMP4 的相對表達(dá)量，實驗重復(fù)3次。引物序列：GAPDH上游引物：5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′，下游引物：5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′；PXMP4上游引物：5′-TGTCGCCACAGGACCGGAA-3′，下游引物：5′-CAACTCATTGGAGTTGTTGC-3′。PXMP4三個干擾片段序列分別為：si-1(CGCTGGT CATGACCTTTCT)、si-2 (GTTGTCACGCGTCCTGTTT)、si-3 (CTGCGTTGGCCGTGCTTAA)。

1.2.6CCK-8檢測細(xì)胞增殖 將轉(zhuǎn)染24 h后的各組細(xì)胞以1×103個/孔接種于96孔板中，每孔100 μL，每組設(shè)3個重復(fù)孔。分別在1～6天向每孔加入10 μL的CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用酶標(biāo)儀測量每孔在波長450 nm處吸光度(A450)，以時間為橫坐標(biāo)，A450值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長曲線，實驗重復(fù)3次。

1.2.7劃痕愈合實驗和Transwell實驗檢測細(xì)胞遷移和侵襲 細(xì)胞常規(guī)消化和鋪板，待細(xì)胞長至80%，用10 μL槍頭在6孔板中的背后平行劃3條線，然后孔內(nèi)沿著與孔板背面線垂直的方向劃3條線，用PBS清洗細(xì)胞2次，加入2 mL的無血清培養(yǎng)基，分別于0、24、48 h在同一劃線相交處進(jìn)行拍照記錄。

收集上述轉(zhuǎn)染過的細(xì)胞，計數(shù)4×104個細(xì)胞，用200 μL無血清培養(yǎng)基重懸，加入Transwell細(xì)胞培養(yǎng)板的小室上室(加基質(zhì)膠)，下室加入500 μL含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液。每組設(shè)3個復(fù)孔。在37 ℃、含5%CO2的孵箱中培養(yǎng)48 h后，用棉簽輕輕拭去微孔膜上層的細(xì)胞，用4%多聚甲醛溶液固定下層細(xì)胞20 min，PBS沖洗3次；再用0.1%結(jié)晶紫染色液室溫染色10 min，PBS沖洗3次，隨機(jī)選取5個視野，光鏡下計數(shù)穿膜并黏附在膜下表面的細(xì)胞拍照記錄。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌中PXMP4的表達(dá)生物信息學(xué)結(jié)果表明：65例結(jié)直腸癌組織中有64例PXMP4 mRNA的相對表達(dá)量顯著高于正常腸黏膜組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001，圖1)。免疫組化結(jié)果表明：PXMP4主要定位于細(xì)胞器膜上，染色呈強(qiáng)陽性，為棕褐色顆粒。本實驗結(jié)直腸癌組織中PXMP4的陽性率為71.429%(80/112)，高于正常腸黏膜組織(5.4%，6/112)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖2)。

2.2 結(jié)直腸癌中PXMP4表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系本組結(jié)果表明：低分化組與高中分化組結(jié)直腸癌相比，低分化組中PXMP4蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組相比，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中PXMP4蛋白表達(dá)升高(P<0.05)。PXMP4蛋白表達(dá)與患者性別、年齡和腫瘤大小均無相關(guān)性(P>0.05，表1)。

圖1 A.PXMP4 mRNA在結(jié)直腸癌和正常腸黏膜組織中表達(dá)；B.PXMP4 mRNA在結(jié)直腸癌和正常腸黏膜組織中表達(dá)分析

圖2 A.正常腸黏膜組織中PXMP4表達(dá)，SP法；B.結(jié)直腸癌組織中PXMP4表達(dá)，SP法

表1 結(jié)直腸癌中PXMP4表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 過表達(dá)/干擾PXMP4結(jié)直腸癌的細(xì)胞株效率本組經(jīng)Western blot和RT-PCR檢測6株結(jié)直腸癌細(xì)胞中PXMP4內(nèi)源性表達(dá)：高表達(dá)PXMP4的HCT116和SW620用于構(gòu)建干擾細(xì)胞株，低表達(dá)PXMP4的RKO和SW480用于構(gòu)建過表達(dá)細(xì)胞株(圖3A)。Western blot和RT-PCR結(jié)果顯示：與空細(xì)胞組和空載組相比，PXMP4-HA組PXMP4的表達(dá)顯著升高(P<0.05，圖3B)；與空細(xì)胞組和陰性對照組相比，干擾片段3組PXMP4的表達(dá)顯著降低(P<0.05，圖3C)，后續(xù)使用干擾片段3組進(jìn)行功能實驗。

2.4 過表達(dá)/干擾PXMP4對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的影響本組結(jié)果顯示：PXMP4-HA組與空細(xì)胞組和空載組相比，PXMP4-HA組細(xì)胞生長速度增快(P<0.05，圖4A、B)；與空細(xì)胞組和陰性對照組相比，干擾片段3組細(xì)胞生長速度降低(P<0.05，圖4C、D)。

2.5 過表達(dá)/干擾PXMP4對結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移的影響本組結(jié)果顯示：PXMP4-HA組與空載組相比，其細(xì)胞遷移速度增快(P<0.05，圖5A)；干擾片段3組與陰性對照組相比，其細(xì)胞遷移速度降低(P<0.05，圖5B)。

2.6 過表達(dá)/干擾PXMP4對結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲的影響本組結(jié)果顯示：PXMP4-HA組與空載組相比，其細(xì)胞穿過小室基膜的細(xì)胞數(shù)顯著增加(P<0.05，圖6A)；干擾片段3組與陰性對照組相比，其細(xì)胞穿過小室基膜的細(xì)胞數(shù)顯著減少(P<0.05，圖6B)。

3 討論

結(jié)直腸癌是全球常見的癌癥之一，病死率僅次于肺癌、肝癌和胃癌。結(jié)直腸癌患者的治療以手術(shù)切除為主，但術(shù)后仍有復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[1-4]。目前，結(jié)直腸癌的發(fā)生機(jī)制尚未完全闡明，因此探討結(jié)直腸癌發(fā)病機(jī)制已成為研究熱點。

過氧化物酶體存在所有真核細(xì)胞的基本細(xì)胞器中，含有一系列生物化學(xué)反應(yīng)所需的酶類，在多種細(xì)胞分解代謝和合成代謝途徑中起重要作用[8-9]。編碼過氧化物酶體蛋白的人類基因缺陷可能導(dǎo)致不同的過氧化物酶體功能紊亂。PXMP4是過氧化物酶體固有膜蛋白。據(jù)國外文獻(xiàn)報道PXMP4的5′-CPG區(qū)胞嘧啶甲基化后沉默PXMP4 mRNA的表達(dá)，即PXMP4在前列腺上皮細(xì)胞中和雄激素依賴的前列腺癌細(xì)胞中表達(dá)，而在雄激素非依賴的前列腺癌細(xì)胞中不表達(dá)。PXMP4啟動子區(qū)的甲基化可能是一種分子機(jī)制參與其過程[10-11]。DNA甲基化介導(dǎo)的PXMP4轉(zhuǎn)錄沉默在雄激素依賴的前列腺癌向雄激素非依賴的前列腺癌轉(zhuǎn)變中起重要作用[12-14]。研究發(fā)現(xiàn)單個內(nèi)含子CpG二核苷酸通過DNA甲基化在PXMP4基因調(diào)控中的關(guān)鍵作用，提示甲基化介導(dǎo)的PXMP4沉默是與前列腺癌發(fā)生相關(guān)的分子事件，表明PXMP4在前列腺癌中作為一種抑癌基因發(fā)揮其抗腫瘤作用[15-17]。目前，PXMP4在結(jié)直腸癌中的作用報道較少。本組通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)PXMP4是正常結(jié)直腸和癌組織的差異表達(dá)基因。免疫組化證實PXMP4蛋白的表達(dá)在結(jié)直腸癌組織中顯著增強(qiáng)，其與腫瘤分化及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。構(gòu)建過表達(dá)/干擾PXMP4的結(jié)直腸癌細(xì)胞株實驗表明：過表達(dá)PXMP4能促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，干擾PXMP4能抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。

圖3 A.Western blot和RT-PCR檢測6株結(jié)直腸癌細(xì)胞中PXMP4表達(dá)；B. Western blot和RT-PCR檢測過表達(dá)PXMP4細(xì)胞株中PXMP4表達(dá)；C.Western blot 和RT-PCR檢測干擾PXMP4細(xì)胞株中PXMP4表達(dá)

圖4 CCK-8法檢測過表達(dá)PXMP4對RKO(A)和SW480(B)細(xì)胞增殖的影響；CCK-8法檢測干擾PXMP4對HCT116(C)和SW620(D)細(xì)胞增殖的影響

圖5 A.劃痕愈合實驗檢測過表達(dá)PXMP4對RKO和SW480細(xì)胞遷移的影響；B.劃痕愈合實驗檢測干擾PXMP4對HCT116和SW620細(xì)胞遷移的影響

圖6 A.Transwell實驗檢測過表達(dá)PXMP4對RKO和SW480細(xì)胞侵襲的影響，結(jié)晶紫染色；B.Transwell實驗檢測干擾PXMP4對HCT116和SW620細(xì)胞侵襲的影響，結(jié)晶紫染色

總之，PXMP4在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮促癌基因的功能，為臨床制定新的結(jié)直腸癌治療策略、評估患者預(yù)后提供新的靶點。