李丹妮，高文萱，張克強，孔德望，王思淇，杜連柱

分層接種對豬糞厭氧干發(fā)酵產(chǎn)氣性能及微生物群落結構的影響

李丹妮1，高文萱1，張克強1，孔德望2，王思淇1，杜連柱1※

（1. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護科研監(jiān)測所，天津 300191；2.杭州能源環(huán)境工程有限公司，杭州 310020）

為避免厭氧干發(fā)酵酸抑制，提高產(chǎn)氣效率，以豬糞和玉米秸稈為發(fā)酵原料，采用中溫批式試驗，在總固體（Total Solid, TS）為20%、接種比為25%的條件下研究分層接種和混合接種對豬糞干發(fā)酵厭氧消化性能的影響。結果表明：2種接種方式下的發(fā)酵體系內(nèi)揮發(fā)性脂肪酸（Volatile Fatty Acids,VFAs）均發(fā)生明顯積累，其中，分層接種在第15天的TVFAs質量濃度達到33.0 mg/g，之后明顯降低，至發(fā)酵結束時VFAs消耗殆盡。混合接種從第15天至發(fā)酵結束，TVFAs質量濃度維持在29.2～38.5 mg/g高水平范圍內(nèi)。分層接種的累積揮發(fā)性固體甲烷產(chǎn)率為211.5 mL/g。高通量測序結果顯示，氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷途徑在2種接種方式下均占主導，但分層接種增加了發(fā)酵體系中微生物的豐富度和多樣性，且群落結構更加穩(wěn)定。進一步分析表明，乙酸和pH值是影響厭氧干發(fā)酵中微生態(tài)結構的主要環(huán)境因子。該研究結果為解除畜禽養(yǎng)殖廢棄物酸抑制、提高產(chǎn)氣效率提供理論依據(jù)與有益借鑒。

發(fā)酵；糞；微生物群落；分層接種；混合接種

0 引 言

近年來，中國的沼氣產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，已經(jīng)成為最大的生物質能源產(chǎn)業(yè)之一[1]，隨著畜禽養(yǎng)殖向集約化、規(guī)?；l(fā)展方式轉變，沼氣發(fā)酵成為消納養(yǎng)殖廢棄物應用最廣泛的有效措施之一[2]。厭氧干發(fā)酵具有有機負荷高、能耗低、消化殘余物易處理等優(yōu)勢，逐漸引起重視，有望成為畜禽養(yǎng)殖糞污、農(nóng)作物秸稈等農(nóng)業(yè)廢棄物資源化處理和利用的主流工藝[3]。

盡管厭氧干發(fā)酵具有諸多優(yōu)點，但VFAs（Volatile Fatty Acids）等發(fā)酵中間產(chǎn)物的抑制作用，常常導致發(fā)酵啟動慢、周期長、產(chǎn)氣效率低。為解決以上問題，學者們開展了大量的試驗研究。田夢等[4]通過豬糞和香蕉秸稈混合發(fā)酵，在TS（Total Solid）為20%條件下，累積甲烷產(chǎn)率達138.0 mL/g，較秸稈單獨發(fā)酵提高了3.1倍。江皓等[5]在通過雞糞和秸稈混合發(fā)酵的同時通過沼液回流改善發(fā)酵性能，結果顯示累積甲烷產(chǎn)率為184.3 mL/g，較不回流組提高了1.4倍。豬糞中添加生物炭也能夠緩解豬糞厭氧干發(fā)酵的酸抑制，提高甲烷產(chǎn)率，其中添加20%生物炭發(fā)酵組的累積VS甲烷產(chǎn)率較不添加組提高了2.0倍[6]。于佳動等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵初期通過微曝氣可使丙酸累積量較非曝氣組下降了82.6%，甲烷質量分數(shù)提高了41.8%。接種物對中間代謝產(chǎn)物的耐受能力、厭氧發(fā)酵啟動時間具有重要影響，研究主要集中在預混合接種方式（接種物與底物混勻后發(fā)酵）下接種物馴化和接種比等方面[8-10]，而對厭氧干發(fā)酵不同接種方式的探索及微生物群落結構的動態(tài)變化規(guī)律與代謝產(chǎn)物（如VFAs）的關聯(lián)性尚待深入研究。

因此，本試驗以豬糞和玉米秸稈為發(fā)酵底物，通過批式試驗對比分層接種和混合接種方式下厭氧干發(fā)酵產(chǎn)氣性能，采用高通量測序技術分析2種接種方式下厭氧干發(fā)酵體系的微生物群落結構及演替規(guī)律，同時利用生態(tài)因子綜合分析法，揭示微生物群落結構與環(huán)境因子的內(nèi)在聯(lián)系，研究結果有望為解決厭氧干發(fā)酵酸抑制，改善產(chǎn)氣性能提供技術支撐與數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用豬糞和玉米秸稈取自天津市西青區(qū)某規(guī)模化養(yǎng)殖場，日產(chǎn)鮮豬糞儲存于(4±1)℃冰箱中。玉米秸稈粉碎至1.0～3.0 mm，存放于干燥通風處。接種物取自實驗室前一批次厭氧干發(fā)酵后的剩余物。底物與接種物的理化指標見表1。

1.2 試驗裝置

試驗裝置為自制立式厭氧發(fā)酵罐，有機玻璃材質，內(nèi)徑200 mm，高度750 mm，有效容積11 L。發(fā)酵罐側面的垂直方向設置多個取樣口，取樣口直徑15 mm，頂部設置取氣口和排氣口，其中排氣口連接集氣袋。

表1 底物和接種物的理化指標

1.3 試驗設計

以豬糞和玉米秸稈為發(fā)酵底物（VS質量比為1:1），接種比為25%（以VS計）。按接種方式分為L組和M組共2組處理。其中L組為分層接種，首先分別將接種物和底物均分3份（按質量計），然后取1份接種物平鋪至反應器底部，再將1份底物均勻鋪至接種物層上方（不攪拌），重復上述操作共3次，最后形成接種物層位于底物層下方共3層。M組為混合接種，將接種物和底物按比例混勻，稱質量后填裝至反應器。每組處理3個重復，每個反應器的總進料質量為10.2 kg，發(fā)酵體系TS為20%，裝料后向各發(fā)酵罐內(nèi)充入氮氣創(chuàng)造厭氧環(huán)境，室溫下發(fā)酵。

發(fā)酵產(chǎn)生的沼氣收集于20 L集氣袋中，每1~2 d測定沼氣產(chǎn)量及沼氣中CH4含量；每2~3 d從發(fā)酵罐側面上中下取樣口采集發(fā)酵樣品，用于測量pH值、溶解性化學需氧量（Solible Chemical Oxygen Demand，SCOD）、VFAs和氨氮的理化指標。依據(jù)產(chǎn)氣情況及理化指標的變化，在0 d（發(fā)酵前）、13 d（Ⅰ階段）、33 d（Ⅱ階段）、45 d（Ⅲ階段）和78 d（Ⅳ階段）取發(fā)酵樣品用于微生物群落結構分析。

1.4 分析方法

TS、VS含量采用標準方法測定[11]。C、N含量采用Vario EL cube 元素分析儀進行測定。將所取上中下3個固態(tài)樣品等質量混勻后用純凈水稀釋10倍，Mettler-toledo pH計測定pH值。

沼氣產(chǎn)量用濕式氣體流量計配蠕動泵進行測量。沼氣組分和固態(tài)樣品的TVFAs質量濃度采用Thermo-trace-1300氣相色譜儀測定[6]。

發(fā)酵樣品DNA采用Fast DNAs Spin Kit（Mpbio，美國）試劑盒提取，通過超微量分光光度計（Nano Drop 2000，Thermo Scientific，Wilmington，美國）測定DNA濃度。根據(jù)DNA的濃度，以等質量DNA混勻平行樣品、上中下層樣品[12]，將混合樣品送生工生物工程（上海）股份有限公司進行微生物分類測序（Miseq 2×300），測序類群為細菌和古菌，其中細菌擴增引物為341F-805R，產(chǎn)甲烷古菌擴增引物為349F-806R。

1.5 動力學模型

試驗采用修正的Gompertz模型模擬兩種接種方式發(fā)酵過程中的累積VS甲烷產(chǎn)率[13]，具體模型方程見式（1）。

式中為時刻對應的累積VS甲烷產(chǎn)率，mL/g；max為最終累積VS甲烷產(chǎn)率，mL/g；max為最大VS產(chǎn)甲烷速率，mL/(g·d)；為遲滯期，d；為時間，d；為2.718 3。根據(jù)模型擬合結果預測發(fā)酵過程中最大VS產(chǎn)甲烷速率max和遲滯期。

2 結果與討論

2.1 產(chǎn)甲烷性能

甲烷產(chǎn)率反映了物料的生物可降解性和轉化率，是衡量當前發(fā)酵條件下產(chǎn)甲烷能力的一個重要參數(shù)[14]。圖2為日VS甲烷產(chǎn)率和甲烷含量隨發(fā)酵時間變化情況，L組的產(chǎn)甲烷性能優(yōu)于M組。由圖2a可知，L組的日揮發(fā)性固體甲烷產(chǎn)率在發(fā)酵前期快速升高，至第11天時達到相對穩(wěn)定狀態(tài)（3.1 mL/g）。而M組日揮發(fā)性固體甲烷產(chǎn)率在第2天達到1.0 mL/g后明顯降低，之后呈現(xiàn)緩慢升高趨勢，在發(fā)酵的第74天達到0.7 mL/g。相較于L組，M組的甲烷產(chǎn)率較低且穩(wěn)定時間較短，這表明產(chǎn)氣受到嚴重抑制。在厭氧發(fā)酵過程中，產(chǎn)甲烷菌的繁殖周期（10～15 d）比水解菌（24～36 h）和產(chǎn)酸菌（80～90 h）的周期長[15]，混合接種方式下接種物與底物完全混合，產(chǎn)甲烷菌不能及時轉化利用體系內(nèi)的有機酸，因此更易受酸抑制的影響，進而影響產(chǎn)氣效率。

沼氣中甲烷含量達到最高水平所經(jīng)歷的時間可以反映底物被產(chǎn)甲烷菌群利用的難易程度[16]。圖2中2試驗組的最高甲烷質量分數(shù)均在59%附近，但經(jīng)歷的時間有明顯的差異。L組在第20天達到59.0%，而后甲烷質量分數(shù)在54.0%～66.0%范圍內(nèi)波動。而M組的甲烷質量分數(shù)在前58 d低于34.9%，至發(fā)酵結束（第78天）時M組的甲烷質量分數(shù)為58.1%，較L組延遲了58 d。該差異表明分層接種能夠促進微生物對發(fā)酵底物的碳素利用程度，從而提高甲烷產(chǎn)率。

表2為不同接種方式下采用修正的Gompertz模型對累積VS甲烷產(chǎn)率的擬合結果。從表可知，L組和M組的2分別為0.998和0.991，表明擬合度較好。L組的遲滯期為10.9 d，較M組遲滯期減少了86.3%，這表明分層接種不僅可實現(xiàn)豬糞厭氧干發(fā)酵的快速啟動，還能夠有效減少發(fā)酵時間[17]。在產(chǎn)甲烷速率方面，L組的最大揮發(fā)性固體產(chǎn)甲烷速率和實際累積揮發(fā)性固體甲烷產(chǎn)率分別為3.8和211.5 mL/g，分別是M組的2.5倍和6.1倍。其中，累積揮發(fā)性固體甲烷產(chǎn)率高于齊利格娃等的研究結果[18]（198.1 mL/g）。本試驗為常溫發(fā)酵，且接種比僅為25%，低于上述研究[18]中40%的接種比，由此可見，分層接種即使在較低的接種比下，仍能縮短厭氧干發(fā)酵的遲滯期，提高甲烷產(chǎn)率。

表2 修正的Gompertz方程參數(shù)

2.2 發(fā)酵過程VFAs變化情況

VFAs是發(fā)酵體系中C源的主要存在形式，也是甲烷形成的前體物質，其質量濃度變化動態(tài)反映了原料水解酸化與消耗程度[19]。如圖3所示反應初期，發(fā)酵底物中易降解的大分子有機物，比如蛋白質和脂類等，在水解產(chǎn)酸菌作用下不斷降解，體系中的VFAs質量濃度不斷升高。L組在第15天達到第一個TVFAs質量濃度峰值（33.0 mg/g）后明顯降低，在51 d后趨于平穩(wěn)，至結束時（第78天）體系內(nèi)的VFAs基本被消耗完。而M組在第15天時TVFAs質量濃度為29.2 mg/g，此后不斷升高并在29.2～38.5 mg/g范圍內(nèi)波動。通常，發(fā)酵體系內(nèi)VFAs濃度超過10 000 mg/L時，會導致體系內(nèi)pH值降低，當pH值低于5.5時，產(chǎn)甲烷菌的活性將完全受抑制[20]。本試驗中，L組和M組的TVFAs質量濃度分別在發(fā)酵的4～36和4～78 d超過文獻中的抑制濃度（10 000 mg/L），但L組產(chǎn)甲烷過程未受明顯抑制。這是因為，分層接種方式使局部產(chǎn)甲烷微生物占絕對優(yōu)勢，分層處的接種物可迅速消耗底物層產(chǎn)生的VFAs。

乙酸、丙酸和丁酸是VFAs中3種典型的揮發(fā)性脂肪酸，其質量濃度變化情況見圖3。由圖3a可知，L組的乙酸和丁酸的變化趨勢與TVFAs相似，在第15天達到質量濃度峰值（6.9和12.0 mg/g）后不斷降低，表明分層接種能夠促進乙酸和丁酸的分解轉化，降低其質量濃度。在發(fā)酵的4～45 d，L組的丙酸質量濃度維持在3.3～6.1 mg/g，其后迅速降低，至發(fā)酵結束時基本轉化完全（0.2 mg/g）。M組的丙酸質量濃度在10 d后一直維持在4.6～7.3 mg/g，表明發(fā)生了較嚴重的丙酸積累。在厭氧發(fā)酵中，丙酸轉化速率慢，易發(fā)生積累，最適濃度范圍為800～3 000 mg/L，超過此范圍不利于產(chǎn)甲烷菌降解利用[21]。本試驗中，L組和M組的丙酸質量濃度分別在發(fā)酵的4～45 和10～78 d超出文獻中報道的抑制濃度（3 000 mg/L），但只有M組產(chǎn)氣受到明顯抑制（圖2b）。這可能是因為，分層接種方式在加快有機物水解酸化進程的同時，能夠提高體系內(nèi)產(chǎn)甲烷菌的丙酸耐受濃度，在高丙酸質量濃度下依然可正常產(chǎn)氣。這進一步表明在本研究中酸抑制的主體可能是乙酸，而并非更高質量濃度的丙酸，即使丙酸對產(chǎn)甲烷菌更具毒性，也解釋了L組在高丙酸濃度、低乙酸濃度下情況下產(chǎn)氣效率較好（圖2a）。

2.3 發(fā)酵過程中微生物群落多樣性與結構的變化

2.3.1 微生物群落多樣性

不同接種方式下細菌和古菌的豐富度及多樣性指數(shù)如表3所示。由Chao和ACE指數(shù)可知，2組發(fā)酵體系中細菌群落的豐富度隨著發(fā)酵的進行均呈先增加后減少的趨勢。L組的古菌群落豐富度呈增加的趨勢，這可能是由于分層接種發(fā)酵體系內(nèi)，接種物（種子體區(qū)）和底物（底物區(qū)）接觸處提供了較多的營養(yǎng)物質，使得分層處微生物生長速率較快，進而促進了該組細菌和古菌的豐富度提高[12]。M組由于體系內(nèi)酸積累嚴重，細菌在前期（I～II階段）的生長活動受到抑制，豐富度較少，后期（III～IV階段）隨著微生物逐漸適應體系內(nèi)的環(huán)境，豐富度逐漸升高，這也是圖3a中M組的TVFAs質量濃度處于較高水平的原因。而M組的古菌豐富度在整個發(fā)酵過程中變化不明顯，值得注意的是在I～III階段內(nèi)古菌的豐富度有小幅度上升，這是由于酸化期能夠促進古菌的豐富度提高[22]。Shannon指數(shù)反映的是群落多樣性?？傮w來看，兩組的細菌多樣性均呈升高的趨勢，其中L組的細菌多樣性較高。L組的古菌多樣性與細菌呈現(xiàn)相同的變化趨勢。在厭氧發(fā)酵體系中，微生物群落多樣性越高，產(chǎn)沼氣性能越好。本試驗中分層接種方式增加了細菌的多樣性，使群落的復雜程度整體升高，加快有機物水解酸化的進程。由此可得，分層接種能提高發(fā)酵體系內(nèi)微生物的豐富度和多樣性，促進水解酸化速率，為提高甲烷產(chǎn)率創(chuàng)造有利條件，這也與圖2a的結果一致。

表3 細菌和古菌的豐富度和多樣性指數(shù)

注：0表示的L組與M組第0天的發(fā)酵樣品，CK。羅馬數(shù)字代表發(fā)酵階段。下同。

Note: 0 represents the fermentation samples of group L and group M on the day 0, CK, the Roman number behind capital is digestion stage. The same as below.

2.3.2 微生物群落結構變化

發(fā)酵過程中微生物群落結構變化見圖4。在門分類水平上，發(fā)酵系統(tǒng)中細菌主要以厚壁菌門（56.2%～91.5%）和擬桿菌門（1.0%～20.6%）為主（圖4a）。2組的相對豐度在0～II階段內(nèi)較高且變化不明顯（82.6%～92.0%），主要因為是有機物厭氧發(fā)酵水解酸化階段的主要菌群，對不利環(huán)境的耐受能力較強[23]。隨著發(fā)酵的進行相對豐度逐漸減少，L組和M組的相對豐度從86.6%（階段0）分別降低至56.2%和73.5%（階段IV），則是因為發(fā)酵后期水解酸化作用減弱所致。試驗中M組在I～II階段內(nèi)乙酸濃度整體處于較高的質量濃度（7.5～9.0 mg/g），對應的相對豐度91.5%～92%，表明高豐度期與高水平的乙酸質量濃度相對應，這與蔣滔等[20]在玉米秸稈厭氧發(fā)酵中的結果相似。是富氮底物厭氧發(fā)酵的關鍵菌，能夠加速分解畜禽糞便中不易降解的有機物[24]，在兩種接種方式的發(fā)酵系統(tǒng)中，相對豐度隨發(fā)酵的進行呈上升的趨勢。與細菌相比，產(chǎn)甲烷古菌在門水平上群落結構較單一，廣古菌門占絕對優(yōu)勢，相對豐度在86.3%～99.5%范圍內(nèi)變化（圖4b）。

在屬分類水平上的細菌群落結構如圖4c所示，主要由狹義梭菌屬（25.5%～55.4%）、熒光甲烷球菌屬（2.4%～15.0%）和未分類的細菌（1.8%～22.7%）等構成。是一類典型的纖維素分解菌，能夠促進體系內(nèi)有機酸的生成[25]。2組的相對豐度呈先增加后降低的趨勢，其中L組下降幅度更大（從階段0：41.0%減少至階段IV：25.5%）。的相對豐度在兩試驗組呈現(xiàn)不同的變化趨勢，M組的相對豐度隨著發(fā)酵進行從3.1%（階段0）逐漸上升到12.7%（階段IV），而在L組中則呈現(xiàn)先增加后減少的變化過程。隨著發(fā)酵的進行，L組菌屬相對豐度逐漸增加，階段IV達到22.7%，而且明顯高于M組（8.2%），值得后續(xù)深入研究。

2種接種方式的發(fā)酵系統(tǒng)中古菌在屬水平（圖4d）上的差異較明顯，甲烷微菌屬（21.5%～60.1%）甲烷絲菌屬（12.7%～38.3%）和甲烷球形菌屬（2.0%～23.2%）為優(yōu)勢菌群。L組的相對豐度隨著發(fā)酵時間增加呈先增加后減少的趨勢，而M組相反。Hinsby等[26]研究發(fā)現(xiàn)當相對豐度增加時，能夠促進厭氧干發(fā)酵產(chǎn)甲烷過程，結合圖2可知，相對豐度與日VS甲烷產(chǎn)率呈正相關的關系。兩發(fā)酵組的相對豐度隨發(fā)酵時間增加均呈先增加后減少的趨勢，與相對豐度變化相一致，這是由于可將體系內(nèi)乙酸轉化為甲烷[27]。結合圖3可知，階段I～II對應的TVFAs質量濃度處于較高水平范圍內(nèi)（L組：17.4～33.0 mg/g；M組：27.0～32.3 mg/g），此時對應的相對豐度處于較高的占比（L組：17.6%～23.2%；M組：37.1%～38.3%），表明的相對豐度與TVFAs質量濃度呈正相關。L組和M組的相對豐度從20.7%（階段0）分別降低至2.0%和5.6%（階段IV），表明隨著發(fā)酵時間的延長的相對豐度逐漸降低。甲烷八疊球菌屬是已知的唯一能夠利用所有產(chǎn)甲烷途徑的產(chǎn)甲烷菌，Zhi等[28]研究發(fā)現(xiàn)與甲烷產(chǎn)量有密切關系。L組的相對豐度在整個發(fā)酵過程中處于較高的占比，其中階段II的相對豐度最高（15.5%），與第33 d的日VS甲烷產(chǎn)率3.2 mL/g相對應；而M組的相對豐度在整個發(fā)酵過程中處于較低的范圍（0.7%～5.7%），這與該組的累積VS甲烷產(chǎn)率（表2）較低相一致。

在本研究中發(fā)現(xiàn)，L組和M組中氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌（，，甲烷短桿菌屬，甲烷囊菌屬和第七產(chǎn)甲烷古菌屬）占比由78.4%（階段0）分別降低至68.9%和66.6%（階段IV），這表明2種接種方式下產(chǎn)甲烷途徑菌以氫營養(yǎng)型為主，且分層接種發(fā)酵體系中群落結構更加穩(wěn)定。Zhou等[29]研究發(fā)現(xiàn)在豬糞厭氧干發(fā)酵中，較乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷而言，氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌是主導的產(chǎn)甲烷途徑，具有較高的活性，這可能是導致L組產(chǎn)甲烷性能較好的主要原因。

2.3.3 微生物群落結構的差異性分析

圖5為2種接種方式下的各發(fā)酵階段細菌和古菌樣品的物種豐度熱圖。對于細菌群落，在不同樣品中占絕對優(yōu)勢。而在古菌群落中，在L組（I和II階段）和M組（0，III和IV階段）占絕對優(yōu)勢，在M組（I和II階段）占絕對優(yōu)勢。另外在熱圖中對樣本做了聚類分析可得，2組在階段I～II和階段III～IV的細菌和古菌樣品中均表現(xiàn)出較好的相似度。

2.4 冗余分析

采用冗余分析分別對2種接種方式發(fā)酵體系的環(huán)境因子與微生物群落結構進行分析，結果見圖6。對于L組發(fā)酵體系（圖6a），Axis1軸和Axis2軸分別解釋了72.3%和17.3%的變異性，總體上微生物群落演變解釋度由大到小分別是乙酸、pH值、丙酸，影響分層接種微生態(tài)結構的主要環(huán)境因子為乙酸，其對微生物群落結構演替的解釋度為69.1%。物種與環(huán)境因子的相關性表明，、與乙酸、丙酸呈明顯正相關，說明和是該發(fā)酵體系內(nèi)參與水解、產(chǎn)酸和乙酸化的關鍵微生物。乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌、氫營養(yǎng)產(chǎn)甲烷菌與乙酸質量濃度呈正相關、與pH值呈負相關，表明正常產(chǎn)氣下適當范圍內(nèi)的乙酸和較低的pH值促進了和生長代謝。

在M組體系內(nèi)（圖6b），Axis1軸和Axis2軸分別解釋了65.1%和12.4%的變異性，總體上微生物群落演變解釋度由大到小分別是pH值、丙酸、乙酸，影響混合接種微生態(tài)結構的主要環(huán)境因子為pH值，其對微生物群落結構演替的解釋度為45.9%。M組產(chǎn)甲烷優(yōu)勢菌中只有與乙酸呈正相關，但相關性系數(shù)為0.477 8低于L組（=0.919 9），表明即使在酸抑制情況下仍能發(fā)揮代謝乙酸產(chǎn)甲烷功能，但相對豐度較低。與乙酸、丙酸呈負相關，表明對酸積累耐受能力較弱。

3 結 論

本文以豬糞和玉米秸稈為發(fā)酵底物，對比分層接種和混合接種方式下厭氧干發(fā)酵產(chǎn)氣性能，結合高通量測序技術分析發(fā)酵系統(tǒng)的微生物群落多樣性及演替規(guī)律，得出如下結論。

1）分層接種累積甲烷產(chǎn)率達到211.5 mL/g，較混合接種提高，遲滯期縮短至10.9 d。

2）混合接種發(fā)酵體系內(nèi)揮發(fā)性脂肪酸積累嚴重，揮發(fā)性脂肪酸質量濃度維持在29.2～38.5 mg/g（15～78 d），抑制產(chǎn)甲烷作用。分層接種中即使揮發(fā)性脂肪酸發(fā)生積累，但表現(xiàn)出較高的轉化效率，對產(chǎn)甲烷過程未構成抑制。

3）氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷途徑在厭氧干發(fā)酵中占主導（66.6%～78.4%），但分層接種能夠增加發(fā)酵體系內(nèi)的微生物的豐富度和多樣性。

4）與兩種菌相對豐度呈正相關，的相對豐度提高加快了揮發(fā)性脂肪酸生成，為乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌，可進一步促進發(fā)酵體系內(nèi)底物分解轉化效率的提高。

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Influences of layer inoculation on biogas production and microbial community in solid-state anaerobic fermentation of pig manure

Li Danni1, Gao Wenxuan1, Zhang Keqiang1, Kong Dewang2, Wang Siqi1, Du Lianzhu1※

(1.,,300191,;2.,310020,)

China is a large agricultural country, livestock manure is both agricultural waste and resources. Among the many treatment processes, Solid-State Anaerobic Digestion to produce biogas is one of the effective measures to realize its resource utilization and solve environmental pollution. While high Total Solid (TS) content causing a reduction of methane yieldsor failure of digestion process because the accumulation of Volatile Fatty Acids (VFAs) resulted in the inhibition of methanogens. At present, the research on VFAs mainly focuses on the aspects of co-substrate for digestion, leachate recirculation and external buffer material to increase biogas production. The inoculum has an important impact on the tolerance of intermediate metabolites and the start-up time of anaerobic fermentation. Previous research mainly focuses on microbial acclimation and feedstock/inoculum ratio under the premixing inoculation method (fermentation after mixing the inoculum and substrate), while the exploration of different inoculation methods for SS-AD and the correlation between the dynamic changes of microbial community structure and metabolites (such as VFAs) need to be studied in depth. In this paper, the biogas production performance and micro-ecological succession law of pig manure and maize straw in layer inoculation and premixing inoculation fermentation were compared. A pilot-scale laboratory experiment was performed in a self-made vertical plexiglass reactor with a total volume of 11 L under feedstock/inoculum ratio=25% in SS-AD process (TS=20%). The result showed that, the first peak of TVFAs mass concentration in layer inoculation system reached 33.0 mg/g on the day 15, and had a greater decline until the end of fermentation. The mass concentration of TVFAs in premixing inoculation system was varied in the range of 29.2-38.5 mg/g on days 15-78. The cumulative Specific Methane Yield of layer inoculation fermentation reached 211.5 mL/g is the highest. CH4yield in layer inoculation system was mucher higher than in premixing inoculation even with the same substrate, which indicated that layer inoculation can lead to the comsuption of VFAs over time, make the process run effectively, and reduce the startup time. The SMY of premixing inoculation was under 1.0 mL/g-VS during the whole experiment. In layer inoculation system, the biogas CH4content ranged from 54.0% to 66.0% after day 20. The CH4content in premixing inoculation fermentation showed a rapid increase after 52 days of digestion and reached 58.1% on day 78. High-throughput sequencing results showed that hydrogenotrophic methanogen was the dominant methane production pathway during SS-AD of different inoculation methods. Layer inoculation can increase the richness and diversity of microorganisms in the fermentation system, and the community structure is more stable than premixing inoculation.The results of cluster analysis on microbial diversity showed that the difference both layer inoculation and premixing inoculation systemshowed good similarity in the bacteria and archaea samples of stage I~II and stage III~IV. Further analysis showed that the main environmental factor affecting layer inoculation and premixing inoculation are acetic acid and pH value, respectively. The results of this study provide a scientific basis for alleviating the VFAs inhibition of SS-AD of livestock and poultry farming waste and increasing methane yield.

fermentation; manure; microbial community; layer inoculation; premixing inoculation

李丹妮，高文萱，張克強，等. 分層接種對豬糞厭氧干發(fā)酵產(chǎn)氣性能及微生物群落結構的影響[J]. 農(nóng)業(yè)工程學報，2021，37(1)：251-258.doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2021.01.030 http://www.tcsae.org

Li Danni, Gao Wenxuan, Zhang Keqiang, et al. Influences of layer inoculation on biogas production and microbial community in solid-state anaerobic fermentation of pig manure[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2021, 37(1): 251-258. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2021.01.030 http://www.tcsae.org

2020-08-25

2020-12-18

國家重點研發(fā)計劃項目（2017YFD0800800）；中國農(nóng)業(yè)科學院協(xié)同創(chuàng)新任務（CAAS-XTCX2016015）

李丹妮，研究方向為農(nóng)業(yè)廢棄物資源化利用。Email：18788857190@163.com

杜連柱，研究員，研究方向為農(nóng)業(yè)廢棄物資源化處理與利用。Email：dulianzhu99@163.com

10.11975/j.issn.1002-6819.2021.01.030

X705

A

1002-6819(2021)-01-0251-08