祝 霞，趙丹丹，李俊娥，韓舜愈，楊學(xué)山

河西走廊產(chǎn)區(qū)酒球菌酯酶活性對葡萄酒酯類香氣物質(zhì)的影響

祝 霞1,2，趙丹丹1，李俊娥1，韓舜愈1,2，楊學(xué)山1,2※

（1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州 730070； 2. 甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點實驗室，蘭州 730070）

試驗以2株本土GF-2、ZX-1和商業(yè)菌株VP41為供試菌株，在模擬酒中動態(tài)監(jiān)測蘋果酸-乳酸發(fā)酵過程中菌株的C2、C4、C6酯酶活性，分析比較不同初始pH值、乙醇濃度、SO2添加量和發(fā)酵溫度對菌株產(chǎn)酶規(guī)律的影響；通過微釀試驗探討供試菌株對霞多麗干白葡萄酒香氣品質(zhì)的影響。結(jié)果表明，在不同pH值條件下，本土菌株的酯酶活性明顯高于商業(yè)菌株VP41，其中ZX-1的最大酯酶活性比VP41的高出約63.42%；乙醇濃度8%時，所有供試菌株均具有最大酯酶活性，且本土菌株具有更強的產(chǎn)酶能力；在不同SO2添加量影響下，2株本土的酯酶累積活性均顯著高于VP41（<0.05）；18、22 ℃發(fā)酵溫度下，GF-2的酯酶活性顯著高于菌株VP41（<0.05）。供試菌株的總酯酶活性依次為ZX-1、GF-2、VP41；最佳產(chǎn)酶條件均為乙醇濃度12%、pH值3.6、SO2添加量30 mg/L、發(fā)酵溫度22 ℃，其中以ZX-1的酯酶活性累計量最高（620.97 mU/mL）。與商業(yè)菌株VP41相比，經(jīng)本土GF-2、ZX-1菌株發(fā)酵的酒樣具有更濃郁的果香和良好的余香持久性。綜合分析，本土與商業(yè)菌株均可以成功完成蘋果酸-乳酸發(fā)酵，尤其是ZX-1菌株具有較強的產(chǎn)酯酶能力，可有效提升霞多麗干白葡萄酒中的果香和花香類化合物含量，明顯增強酒體的地域風(fēng)格和典型性。

酶；活性；葡萄酒；酒酒球菌；蘋果酸-乳酸發(fā)酵；酯類化合物

0 引 言

釀酒葡萄在發(fā)酵微生物的作用下發(fā)生一系列復(fù)雜生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)，形成種類豐富、特征各異的揮發(fā)性香氣化合物，是賦予葡萄酒風(fēng)格和典型性的關(guān)鍵因素[1]。由觸發(fā)的蘋果酸-乳酸發(fā)酵（Malolactic Fermentation，MLF）具有降低酸度[2]、增加生物穩(wěn)定性[3]、改善酒體色澤[4]、修飾葡萄酒風(fēng)味等作用，是釀造優(yōu)質(zhì)干紅和部分干白葡萄酒的必要生產(chǎn)工藝[5]。受種植和栽培條件影響，河西走廊產(chǎn)區(qū)葡萄酒普遍存在香氣強度低，余香持久性差的質(zhì)量缺陷。優(yōu)良的微生物菌株不但能順利啟動并完成發(fā)酵，而且還能合成和釋放促進(jìn)香氣化合物生物轉(zhuǎn)化的糖苷酶、酯酶等風(fēng)味酶，提升葡萄酒的香氣品質(zhì)[6-7]。已有研究表明酯類化合物具有較低的閾值和濃郁的水果香味，其濃度的變化對葡萄酒香氣的濃郁度和持久性具有重要影響[8]。葡萄酒發(fā)酵過程中酯酶的潛在底物特異性決定了酯類化合物的種類和含量，對葡萄酒特征香氣的形成具有重要貢獻(xiàn)[9]。與釀酒酵母（）相比，合成的酯酶在高糖、高酒精度及低pH值的葡萄酒生境中可保持更高的催化活性[10]。然而的生長和代謝受到葡萄酒發(fā)酵條件（溫度、pH值、SO2濃度和乙醇濃度）的直接影響，且的抗脅迫能力因菌株而異。Sico等[11]的研究表明溫度和乙醇濃度對菌株酯酶活性的影響不同，供試菌株在30～40 ℃之間的酯酶活性最大，的生長隨著乙醇濃度的升高呈線性下降。此外，葡萄酒中富含多種酯酶作用的底物，這些底物的種類和數(shù)量也決定著酯酶活性的強弱。Sumby等[9]對C2～C10酯酶活性研究發(fā)現(xiàn)，其對不同碳鏈長度的底物反應(yīng)具有特異性。酯酶的潛在底物特異性決定了葡萄酒中酯類化合物的構(gòu)成，且其含量與碳鏈長度成反比[12]；同時脂溶性酯類物質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運會隨著碳鏈長度的增加而大幅下降，其中己酸乙酯可以100%釋放到細(xì)胞外，而癸酸乙酯只有8%～17%被轉(zhuǎn)移[13]。由于只有被高效釋放到細(xì)胞外的酯類才可被消費者感知，因此，在MLF過程中主要通過C2～C6酯酶影響酯類香氣物質(zhì)的合成。此外，菌株間代謝能力的差異會影響合成酯酶的活性及底物特異性，進(jìn)而影響葡萄酒的香氣特征[14]。目前，國內(nèi)相關(guān)研究主要集中在對不同商業(yè)在MLF中的降酸作用以及對葡萄酒香氣品質(zhì)的影響，但對于本土菌株的發(fā)酵特性及其在干白葡萄酒中的應(yīng)用，尤其是菌株對酯類香氣化合物的修飾機制還鮮有報道。本試驗通過在模擬酒中動態(tài)監(jiān)測MLF中2株本土和1株商業(yè)菌株對不同碳鏈長度底物（C2～C6）的酯酶活性，分析供試菌株在不同釀造因子影響下的產(chǎn)酶規(guī)律特征，探索酯類化合物與菌株酯酶活性的響應(yīng)機制，以期為生產(chǎn)代表河西走廊產(chǎn)區(qū)風(fēng)土的典型葡萄酒提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本土酒酒球菌菌株：GF-2、ZX-1、QL-11、MG-1由甘肅省葡萄與葡萄酒重點實驗室分離鑒定并保存。商業(yè)酒酒球菌：VP41，購自上海杰兔責(zé)任有限公司。商業(yè)釀酒酵母：ES488，購自意大利Enartis公司。霞多麗釀酒葡萄：2019年產(chǎn)自甘肅莫高酒業(yè)有限公司葡萄種植基地，含糖量約為21.3 °Brix，總酸6.87 g/L（以酒石酸計），pH值3.36。

1.2 培養(yǎng)基與試劑

ATB培養(yǎng)基配制參考Sumby等[4]的方法配制：葡萄糖10 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，MnSO4·4H2O 0.05 g/L，鹽酸半胱氨酸0.5 g/L，番茄汁質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%。液體培養(yǎng)基使用1 mol/L NaOH調(diào)pH值至4.8，固體培養(yǎng)基加20 g/L的瓊脂，121 ℃滅菌20 min。

參考Sico等[11]方法進(jìn)行模擬酒培養(yǎng)基的配制：葡萄糖1 g/L、果糖1 g/L、L-蘋果酸2 g/L、海藻糖1 g/L、酒石酸1 g/L、檸檬酸1 g/L、乙酸鈉0.14 g/L、酵母浸粉4.0 g/L、水解酪蛋白2.5 g/L、KH2PO40.3 g/L、KCl 0.22 g/L、L-型半胱氨酸鹽酸0.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.065 g/L、MnSO4·4H2O 0.015 g/L、CaCl20.065 g/L、甘油3 mL/L。

香氣標(biāo)準(zhǔn)品：乙酸戊酯、乙酸庚酯、3-羥基丁酸乙酯、己酸甲酯、苯乙酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸己酯、乙酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯等香氣標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)物2-辛醇均購自美國Sigma公司。

其他試劑：4-硝基苯基乙酸酯（-nitrophenyl acetate，-NPA）、4-硝基苯基己酸酯（-nitrophenyl butyrate，-NPB）、4-硝基苯基丁酸酯（-Nitrophenyl hexanoate，-NPH），購自上海源葉有限責(zé)任公司；氫氧化鈉、檸檬酸、磷酸二氫鉀、碳酸鈉，均為分析純試劑，購自甘肅中瑞化工有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

SPX-150-Ⅱ生化培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司），PHS-3CpH計（上海雷磁責(zé)任有限公司），TU-1810可見分光光度計（上海元析儀器有限公司），SW-CJ-2FD超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），LDZX-50KBS高壓蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠），H2050R高速冷凍離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司），TRACE 1310-ISQ 氣相色譜質(zhì)譜儀（美國Thermo Scientific公司），ISQ 型單四級桿質(zhì)譜儀（美國Thermo Scientific 公司）。

1.4 試驗方法

1.4.1 高產(chǎn)酯酶本土酒酒球菌菌株篩選

挑取斜面保存的菌種接種于ATB培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)至OD600約為1.1（菌落數(shù)約為107CFU/mL）時，轉(zhuǎn)接于模擬酒體系，28 ℃發(fā)酵14 d，每隔48 h取樣。為便于直觀比較各菌株不同酯酶活性，參考李婷等[13]方法，采用酶活性累積量（mU/mL），即同一菌株、同一種酶的7次測定結(jié)果逐次相加，表征比較4株本土及1株商業(yè)菌株酯酶活性的差異。各樣重復(fù)3次。

為提高樣品酶活性測定效率、縮短反應(yīng)時間，參照Matthews等[12]方法并進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化后酶活性測定體系為：分別將80L 25 mmol/L的-NPA、-NPB和-NPH，與200L菌懸液、1 820L pH值為5.0的檸檬酸-磷酸緩沖液混合均勻，50 ℃反應(yīng)30 min，再加入200L Na2CO3溶液（0.5 mol/L）終止反應(yīng)，400 nm波長測定處吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線（=2.264 9–0.006 2，2=0.999 1）計算最終酶活性。酶活性單位的定義（U）：50 ℃條件下，每mL菌體細(xì)胞每min釋放1mol對硝基苯酚所需的酶量（mol/(min·mL)）。

1.4.2 不同發(fā)酵因子對菌株酯酶活性的影響

將菌株經(jīng)ATB培養(yǎng)基活化、擴培后，以1×107CFU/mL，依次接種于同一因子的不同處理水平組模擬酒中，其中初始pH值為3.0、3.2、3.4、3.6、3.8（HCl或NaOH調(diào)整），乙醇體積分?jǐn)?shù)為6%、8%、10%、12%、14%（無水乙醇調(diào)節(jié)），SO2添加量為15、30、45、60、75 mg/L（用Na2S2O5調(diào)節(jié)），發(fā)酵溫度為18、20、22、25、28 ℃。每隔48 h取樣，分別測定發(fā)酵液中C2、C4、C6酯酶活性，以各處理水平條件下C2、C4、C6酯酶的總和為依據(jù)，篩選較佳產(chǎn)酶條件。試驗重復(fù)3次。

1.4.3 正交試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，并結(jié)合葡萄酒MLF過程中pH值、乙醇濃度、SO2添加量、發(fā)酵溫度等的實際參數(shù)水平，采用L9(34)正交試驗（表1），分析供試菌株的總酯酶活性（C2、C4、C6酯酶之和）的變化規(guī)律。

表1 L9(34)正交試驗因素水平

1.4.4 微釀試驗

1）菌株活化

ES488釀酒酵母菌株參考劉琦[14]方法，按推薦用量（0.2 g/L）加入等體積的葡萄汁于28 ℃活化25 min后接種，酒酒球菌菌株活化同1.4.1。

2）酵母菌菌株活化

參照干白葡萄酒生產(chǎn)工藝[15]，在除梗、破碎的霞多麗葡萄中加入果膠酶（20 mg/L）和60 mg/L SO2后，對其進(jìn)行壓榨、皮渣分離，裝入5 L發(fā)酵瓶中4 ℃澄清，按0.2 g/L接種釀酒酵母ES488，在試驗優(yōu)化的最優(yōu)產(chǎn)酶條件下進(jìn)行酒精發(fā)酵（Alcoholic Fermentation，AF）至殘?zhí)琴|(zhì)量濃度4.0 g/L時，進(jìn)行倒罐處理去酒泥，將菌株ZX-1、GF-2按1×107CFU/mL進(jìn)行接種，以商業(yè)菌株VP41作為參考。自接入菌株開始，每隔48 h取樣，測定-蘋果酸質(zhì)量濃度＜0.2 g/L時結(jié)束MLF發(fā)酵。取樣測定理化指標(biāo)和揮發(fā)性香氣化合物。

3）-蘋果酸和干白葡萄酒理化指標(biāo)測定

-蘋果酸含量檢測參考試劑盒說明書進(jìn)行。參照《葡萄酒分析檢驗》及GB/T 15038-2006[16]中的方法進(jìn)行殘?zhí)恰⒕凭?、pH值、總酸、揮發(fā)酸、總SO2等指標(biāo)測定。

4）揮發(fā)性香氣化合物測定

參照劉琦[14]香氣物質(zhì)萃取方法及氣相色譜-質(zhì)譜（Gas Chromatography-Mass Spectrometry）GC-MS條件，于15 mL的頂空瓶中加入2.5 g氯化鈉、8 mL酒樣、20L 2-辛醇（濃度81.06 mg/L），加磁力攪拌轉(zhuǎn)子后封口，放入恒溫加熱磁力攪拌器中，40 ℃水浴平衡30 min后，頂空萃取30 min。

GC-MS條件：色譜柱DB-WAX 60 m×2.5 mm× 0.25m，不分流進(jìn)樣。載氣（He）流速1 mL/min，進(jìn)樣口溫度240 ℃，解析時間5 min；柱溫升溫程序：50 ℃保持5 min，以3.5 ℃/min升至180 ℃，保持15 min；質(zhì)譜為電子轟擊離子源（Electron Impact，EI），電子能量70 eV，傳輸線溫度180 ℃，離子源溫度200 ℃，掃描范圍50～350 m/z。

定性與定量分析：采用與標(biāo)準(zhǔn)香氣成分保留指數(shù)（Retention Index，RI）對比的方法結(jié)合NIST-11、Wiley及香精香料標(biāo)準(zhǔn)譜庫檢索比對結(jié)果進(jìn)行揮發(fā)性香氣化合物的定性分析。對于已有標(biāo)準(zhǔn)品的香氣化合物通過內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行定量，其他香氣化合物含量利用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行相對定量分析，內(nèi)標(biāo)物為2-辛醇。

1.4.5 感官評價

參照Englezos等[17]的方法。9名經(jīng)過葡萄酒品鑒培訓(xùn)的人員（5女，4男）對隨機編號的各酒樣進(jìn)行3輪盲品。根據(jù)評價標(biāo)準(zhǔn)從外觀、香氣和口感3個方面，使用10分結(jié)構(gòu)化數(shù)值尺度來量化（表2）。0～10表示感覺強烈程度逐漸增大。

表2 葡萄酒感官評價標(biāo)準(zhǔn)

1.4.6 試驗數(shù)據(jù)處理

對試驗所得數(shù)據(jù)采用Microsoft Office Excel 2010，Origin 2018進(jìn)行基本處理和作圖，IBM SPSS Statistics 19.0 軟件進(jìn)行多重比較（Duncan法，＜0.05）及差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)酯酶本土酒酒球菌菌株篩選

由表3可知，對4株供試本土的3種酯酶活性比較發(fā)現(xiàn)，菌株GF-2、ZX-1的C2、C4、C6酯酶活性均顯著高于菌株QL-11、MG-1的酶活性（＜0.05）。與商業(yè)菌株VP41相比，菌株GF-2、ZX-1的酯酶活性明顯較高（＜0.05），QL-11、MG-1的酯酶活性則低于菌株VP41。因此，選擇菌株GF-2、ZX-1為后續(xù)供試菌株。

表3 5株O.oeni（4株本土菌株+1株商業(yè)菌株）酯酶活性測定

注：字母A～E表示在<0.05水平下組間具有顯著性差異，下同。

Notes: Alphabet A to E indicate significant differences between groups at the<0.05 level, the same below.

2.2 不同發(fā)酵條件對本土酒酒球菌酯酶活性的影響

由圖1a可知，pH值對供試菌株的3種酯酶活性影響顯著。本土菌株（GF-2、ZX-1）均在pH 值3.6時具有最大酯酶累積活性，而商業(yè)菌株VP41產(chǎn)生最大酯酶活性的pH值為3.8；在不同pH值條件下，本土菌株的酯酶活性明顯高于VP41，其中ZX-1的最大酯酶活性（1 099.97 mU/mL）比VP41的（673.06 mU/mL）高出約63.42%。pH值較低時（3.0），菌株GF-2比ZX-1具有更好的產(chǎn)酯酶能力；但隨pH值升高，ZX-1的酯酶活性上升更快。乙醇濃度與菌株酯酶累積活性呈負(fù)相關(guān)變化（圖1b）。供試菌株均在乙醇濃度8%時均產(chǎn)生了最大酯酶活性，分別為1 076.17 mU/mL（ZX-1）、1 001.96 mU/mL（GF-2）、647.58 mU/mL（VP41），且相互間差異顯著（＜0.05）。在不同乙醇濃度梯度下，本土的酯酶活性均顯著高于商業(yè)菌株VP41。

如圖1c所示，隨著SO2添加量的增加，供試菌株的酯酶活性均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在SO2添加量為30 mg/L時，所有菌株均表現(xiàn)出最大酶活性。當(dāng)SO2添加量在15～75 mg/L范圍內(nèi)時，本土的酯酶累積活性均顯著高于VP41的酶活性（<0.05）。在SO2添加量為75 mg/L條件下，菌株ZX-1、GF-2的酯酶累積活性分別是商業(yè)菌株VP41的1、1.3倍。不適宜的發(fā)酵溫度會導(dǎo)致雜菌的生長或發(fā)酵延遲，從而破壞葡萄酒的感官質(zhì)量[18]。的最適生長溫度是25～28 ℃，而葡萄酒的MLF溫度一般為18～22 ℃，因此，選擇在18～28 ℃不同溫度下，對菌株酯酶活性變化情況進(jìn)行測定分析。由圖1d可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，菌株VP41的酯酶累積活性逐漸升高，且在28 ℃時產(chǎn)生最大酶活性（830.86 mU/mL），而本土在18 ℃時有最大酯酶活性，分別為661.20 mU/mL（ZX-1）、794.88 mU/mL（GF-2）。其中在18、22 ℃發(fā)酵溫度下，GF-2的酯酶活性顯著高于菌株VP41（<0.05）。

2.2 復(fù)合發(fā)酵條件下菌株酯酶活性

在葡萄酒中的生長代謝，不僅受到葡萄酒復(fù)雜基質(zhì)的影響，還與發(fā)酵參數(shù)間的協(xié)同作用有關(guān)[19]。因此，分析復(fù)合發(fā)酵條件下各菌株的酯酶活性，可反應(yīng)葡萄酒釀造過程中的實際發(fā)酵行為。

由表4可知，不同復(fù)合發(fā)酵條件下各菌株的酯酶活性累積量不同，而在相同發(fā)酵參數(shù)下菌株間的酶活性也存在差異，供試菌株總酯酶活性依次為ZX-1>GF-2>VP41。從極差可知，不同發(fā)酵因素對菌株ZX-1酯酶活性累積量影響的主次順序為：SO2添加量、pH值、乙醇濃度、發(fā)酵溫度；影響菌株GF-2產(chǎn)酶活性的主次因素為：SO2添加量、乙醇濃度、pH值、發(fā)酵溫度；菌株VP41影響因素的主次順序為：SO2添加量、發(fā)酵溫度、pH值、乙醇濃度。所有供試菌株的最優(yōu)產(chǎn)酶條件均為：乙醇濃度12%、pH值3.6、SO2添加量30 mg/L、發(fā)酵溫度22 ℃。

表4 酯酶活性累積量測定的正交試驗結(jié)果

由表5可知，SO2添加量對所有供試菌株的酯酶活性有極顯著影響（<0.01）。pH值、乙醇濃度對菌株ZX-1、GF-2的酯酶活性有顯著影響（<0.05）；發(fā)酵溫度、pH值對菌株VP41的酯酶活性有顯著影響（<0.05）。

表5 酯酶活性正交試驗方差分析

注：“**”表示影響極顯著（<0.01），“*”表示影響顯著（<0.05）。

Notes: The sign “**” means the impact is extremely significant (<0.01), and “*” means the impact is significant (<0.05).

2.3 微釀試驗結(jié)果

根據(jù)正交試驗結(jié)果，在最優(yōu)產(chǎn)酯酶條件下對霞多麗干白葡萄酒進(jìn)行MLF，分析酯類物質(zhì)的變化特征，比較驗證各菌株對葡萄酒香氣品質(zhì)的影響作用。

2.3.1 葡萄酒理化指標(biāo)

由表6可知，各酒樣中-蘋果酸質(zhì)量濃度均<0.2 g/L，表明MLF成功完成，且主要理化指標(biāo)均符合國標(biāo)（GB/T15037-2006）要求。與對照未接種MLF組（CK）相比，MLF發(fā)酵后，霞多麗干白葡萄酒pH值升高0.11～0.16，總酸質(zhì)量濃度降低2.48～2.62 g/L。雖然酒樣中揮發(fā)酸含量有所升高，但最大值為0.42 g/L（<1.2 g/L），符合國標(biāo)要求。此外，本土菌株在第12 d就可完成MLF，而商業(yè)菌株則需14 d，因此本土菌株可更快地適應(yīng)葡萄酒生境，具有更高的發(fā)酵效率。

表6 蘋果酸-乳酸發(fā)酵前后干白葡萄酒樣理化指標(biāo)

2.3.2 葡萄酒樣中酯類化合物分析

1）酯類化合物GC-MS檢測結(jié)果

氣味活性值（Odor Activity Value，OAV）是評價單一香氣化合物對整體香氣的貢獻(xiàn)程度的指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)，OAV值>0.1的香氣成分通過疊加作用，也對葡萄酒香氣特征具有積極貢獻(xiàn)。表7為不同處理條件下，各酒樣中主要酯類物質(zhì)（OAV>0.1）的總含量依次為ZX-1>GF-2>VP41>CK。菌株VP41的酯類化合物含量顯著低于本土菌株（<0.05），與酶活性累積量測定結(jié)果一致。尤其是ZX-1處理組的乙酸異戊酯、乙酸己酯、乙酸辛酯、乙酸苯乙酯等具有潛在花香和果香味的物質(zhì)含量顯著增加（<0.05）?？傮w而言，雖然商業(yè)與本土菌株發(fā)酵后酒樣中的主要酯類物質(zhì)種類差別不大，但其含量卻存在顯著差異（<0.05）。總體而言，本土菌株更有利于酯類香氣的合成釋放。

表7 各處理酒樣中主要酯類物質(zhì)的變化

2）主成分分析

對檢測到的17種主要酯類化合物進(jìn)行主成分分析，得到PC1和PC2的方差貢獻(xiàn)率分別為79.592%、15.376%，累積方差貢獻(xiàn)率為94.968%。各酯類化合物在PC1和PC2上的因子載荷圖見圖2。由圖2可知，PC1正半軸上除了得分較高的乙酸己酯（蘋果、櫻桃）、乙酸異戊酯（香蕉，果香）、己酸乙酯（香蕉，青蘋果）、辛酸乙酯（水果香，白蘭地）等，乙酸苯乙酯（花香）、癸酸乙酯（果香，脂肪味）、乙酸乙酯（菠蘿，清漆，香脂）等得分也較高，即PC1正半軸除了酯類化合物的特有水果香外還帶有花香、脂香。同理，PC1負(fù)半軸包括乙酸異丁酯（甜香，果香）、丁酸乙酯（香蕉，草莓）、棕櫚酸乙酯（蘋果，菠蘿）等果香，同時，丁二酸二乙酯（青草，葡萄，水果香）、辛酸戊酯（青草香，脂肪香，水果香）等具有特殊的青草香氣特征。

圖2得到PC1和PC2的累積方差為94.968%。GF-2、ZX-1分布在PC1正半軸，CK、VP41兩個處理組處于PC1負(fù)半軸，這與具有果香味的化合物（乙酸己酯、乙酸異戊酯、乙酸苯乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯）的含量有關(guān)。分布于PC1正半軸的GF-2、ZX-1處理組的上述香氣化合物含量明顯高于處于負(fù)半軸的CK和VP41。表明接種進(jìn)行MLF對酒樣酯類揮發(fā)性香氣化合物的影響顯著。且3株供試菌株在PCA圖中呈分散型分布，特別是商業(yè)與本土菌株發(fā)酵酒樣間的酯類物質(zhì)構(gòu)成特征存在明顯差異，而本土菌株ZX-1與GF-2間的差異較小。

3）葡萄酒樣感官分析

對發(fā)酵酒樣中的感官特征進(jìn)行分析（圖3）后表明經(jīng)過MLF后的霞多麗干白葡萄酒果香、花香味更突出。ZX-1組最典型，其次為GF-2、VP41組，與未接種MLF組（CK）差異較大，這主要是由于各菌株所具有的酯酶活性不同，進(jìn)而導(dǎo)致了酯類香氣物質(zhì)的水解平衡差異，最終形成風(fēng)格各異的香氣品質(zhì)。與CK相比，MLF后3個處理組酒樣在外觀（色澤、澄清度）方面均無明顯變化；本土菌株GF-2、ZX-1發(fā)酵酒樣的典型性、余味長短無明顯差異，但均高于商業(yè)菌株VP41和CK處理組。綜合分析，利用本土進(jìn)行MLF后的葡萄酒花果香突出，酒體協(xié)調(diào)性、典型性較強。

3 討 論

Betteridge等[24]研究發(fā)現(xiàn)，對葡萄酒生境具有良好的耐脅迫能力，是進(jìn)行MLF的主導(dǎo)菌，可產(chǎn)生一系列具有潛在底物特異性的酯酶。的酯酶活性受多種因素的影響，如溫度[20]、pH值[2]、乙醇等[17]。本研究發(fā)現(xiàn)pH值對所有供試菌株的酯酶活性影響均較顯著，低pH值（3.0～3.2）明顯抑制菌株酶活性。低濃度乙醇可提高膜的滲透性，使細(xì)胞內(nèi)酯酶和底物之間更易接觸，進(jìn)而釋放出更多產(chǎn)物。試驗表明當(dāng)乙醇濃度為8%時，供試菌株有最大酯酶活性，然而隨著乙醇濃度的增加，膜結(jié)構(gòu)被破壞，致使菌株的酯酶活性降低[4]。但這與Rodríguez等[25]認(rèn)為不同乙醇濃度可影響菌株的生長參數(shù)，卻不影響酯酶活性的研究結(jié)果存在差異，這可能是因為試驗菌株間的特性差異及選取乙醇濃度范圍不同導(dǎo)致的。SO2分子可穿過細(xì)胞膜，擴散進(jìn)入細(xì)胞，影響生長和其產(chǎn)酶能力[26]，因此隨著SO2濃度的增加，供試菌株的酯酶累積活性也有所降低，但對SO2的敏感性取決于菌株和培養(yǎng)條件[27]。通常情況下，釀酒過程中面臨著多個釀造因子的協(xié)同作用，與單一因素作用相比，復(fù)合條件下菌株的酯酶活性顯著降低[28]。因此，釀造因子之間的交互作用及其對菌株合成分泌酯酶的內(nèi)在作用機制，有待進(jìn)一步研究。

酯類化合物對葡萄酒香氣品質(zhì)的形成具有重要作用，賦予酒體濃郁的果香和花香氣味[29-31]。González-Centeno等[22]分別將霞多麗葡萄酒置于橡木桶和不銹鋼桶中進(jìn)行MLF，結(jié)果顯示，在橡木桶中進(jìn)行MLF的葡萄酒堅果味更濃郁，而在不銹鋼桶中進(jìn)行MLF的霞多麗葡萄酒柑橘味和花香味更突出。Gambetta等[23]報道指出，霞多麗葡萄酒進(jìn)行MLF后，在直鏈脂肪酸乙酯中，辛酸乙酯、癸酸乙酯、己酸乙酯等物質(zhì)的含量高于閾值，使葡萄酒呈現(xiàn)了梨、蘋果、菠蘿或花香等香氣特征。曲昆生等[32]對比了MLF發(fā)酵前后“威代爾”冰白葡萄酒的香氣化合物差異，與只進(jìn)行酒精發(fā)酵的酒樣相比，經(jīng)過MLF處理的酒樣中蘋果酸含量有所下降，脂肪酸乙酯類物質(zhì)含量提高了34.71%，葡萄酒的果香味強度增加，這與本試驗結(jié)果一致。影響葡萄酒中酯類化合物種類和數(shù)量因素很多（葡萄品種、酵母菌和乳酸菌的選擇），其凈積累量決定于酵母菌和乳酸菌的酯酶催化合成與水解能力之間的平衡[33]。我們的工作進(jìn)一步證實，葡萄酒中表達(dá)的酯酶活性水平具有菌株依賴性。因此，可以通過酶基因結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和動力學(xué)等方面的研究，深入探討葡萄酒MLF條件下酯類物質(zhì)產(chǎn)生差異的原因。

4 結(jié) 論

1）供試菌株在不同釀造因子下呈現(xiàn)出不同的酯酶活性，其中SO2添加量對菌株產(chǎn)酶能力影響極顯著（<0.01），pH值影響顯著（<0.05），乙醇濃度與發(fā)酵溫度分別對本土和商業(yè)菌株影響顯著（<0.05）。復(fù)合發(fā)酵試驗結(jié)果表明：供試菌株總酯酶活性依次為ZX-1、GF-2、VP41，影響ZX-1酯酶活性累積量的主次因素順序為：SO2添加量、pH值、乙醇濃度、發(fā)酵溫度；最優(yōu)的產(chǎn)酶條件為：乙醇濃度12%、pH值3.6、SO2添加量30 mg/L、發(fā)酵溫度22 ℃，此條件下ZX-1的酯酶活性可達(dá)620.97 mU/mL，表現(xiàn)出較強的葡萄酒生境適應(yīng)能力。

2）霞多麗干白葡萄酒微釀試驗結(jié)果表明，供試菌株具有較好的-蘋果酸降解能力，能夠順利完成蘋果酸-乳酸發(fā)酵，且各酒樣的理化指標(biāo)均符合國標(biāo)要求。氣質(zhì)聯(lián)用及主成分分析顯示，蘋果酸-乳酸發(fā)酵對酒樣的酯類香氣物質(zhì)影響顯著，且經(jīng)不同菌株發(fā)酵酒樣間的酯類化合物種類及含量也不相同，特別是本土與商業(yè)菌株間的差異顯著（<0.05）。因此，使用具有較高酯酶活性的本土菌株進(jìn)行蘋果酸-乳酸發(fā)酵，更有利于河西走廊產(chǎn)區(qū)高品質(zhì)葡萄酒的釀造生產(chǎn)。

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Effects of esterase activity of alcoholicus in Hexi Corridor production areas on ester aroma compounds in wine

Zhu Xia1,2, Zhao Dandan1, Li Jun’e1, Han Shunyu1,2, Yang Xueshan1,2※

(1.,,730070,; 2.,730070,)

The aim of this study was to evaluate the effects of fermentation conditions on the cumulative esterase activity of(.) autochthonous strains in the Hexi Corridor region, particularly in the aromaticesters of Chardonnay dry white wine during the Malolactic Fermentation (MLF). Twoautochthonous strains, such as GF-2 and ZX-1, were preserved by the Gansu Key Lab Viticulture and Enology, and one commercial strain VP41 was used to test strains. The esterase activities of various carbon chain length substrates (C2, C4, C6) were detected in the simulated wine during MLF process. The fermentation conditions were selected to analyze the esterase characteristics produced by thestrains, including the initial pH value, ethanol concentration, SO2addition, and fermentation temperature. A microvinification experiment was performed to explore the modification effect of the tested strains on the aroma quality of Chardonnay dry white wine. The esterase activities ofautochthonous strains were significantly higher than those of commercial strain VP41 under different pH values, where the maximum esterase activity of ZX-1 was about 63.42% higher than that of VP41. When the concentration of ethanol was 8%, all the tested strains produced the maximum esterase activity, indicating theautochthonous strain had strong esterase producing ability. Under the different SO2additions, the cumulative esterase activities of twoautochthonous strains were significantly higher than that of VP41 (<0.05), while, the esterase activity of GF-2 was significantly higher than those of strain VP41 at 18 and 22 ℃ (<0.05). Results of compound fermentation showed that the total esterase activity originated from ZX-1 was the highest, followed by GF-2 and VP41. There were different effects of the major and secondary factors on the esterase activity of each strain. An optimum condition was obtained for the esterase production of all tested strains: the ethanol concentration of 12%, pH value of 3.6, SO2addition of 30 mg/L, and the fermentation temperature of 22 ℃. The highest esterase activity of ZX-1 was 620.97 mU/mL, indicating that a strong adaptability to wine habitat. In the microvinification of chardonnay dry white wine, esters were identified in the wine samples after MLF. There were richer variety aroma and better fragrance persistence in the wines that fermented by autochthonous strains GF-2 and ZX-1, compared with the commercial strain VP41. Bothautochthonous and commercial strains can successfully complete MLF, especially ZX-1 has strong esterase production capability, depending mainly on the fermentation conditions. Therefore, the ZX-1 can be used to effectively improve the content of fruit and floral aroma compounds in the Chardonnay dry white wine, thereby to enhance the regional microbial terroir characteristics of wines. Theautochthonous strain ZX-1 was more suitable to be used as the MLF starter of dry white wine in the Hexi Corridor of Gansu Province.

ezymes; activity; wine;; malolactic fermentation; ester compound

祝霞，趙丹丹，李俊娥，等. 河西走廊產(chǎn)區(qū)酒球菌酯酶活性對葡萄酒酯類香氣物質(zhì)的影響[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報，2021，37(1)：315-322.doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2021.01.037 http://www.tcsae.org

Zhu Xia, Zhao Dandan, Li Jun’e, et al. Effects of esterase activity of alcoholicus in Hexi Corridor production areas on ester aroma compounds in wine[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2021, 37(1): 315-322. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2021.01.037 http://www.tcsae.org

2020-08-17

2020-12-15

國家自然科學(xué)基金地區(qū)基金項目（31760454，32060581）；甘肅省重點研發(fā)計劃項目（17YF1NA060）；甘肅省葡萄酒產(chǎn)業(yè)發(fā)展基金項目（20180820-07，20180820-08）

祝霞，副教授，主要從事葡萄與葡萄酒風(fēng)味品質(zhì)調(diào)控研究。Email：zhux@gsau.edu.cn

楊學(xué)山，副教授，主要從事葡萄酒釀造微生物及風(fēng)味品質(zhì)調(diào)控研究。Email：yangxs@gsau.edu.cn

10.11975/j.issn.1002-6819.2021.01.037

TS261

A

1002-6819(2021)-01-0315-08