薛伶俐 曾艷 方川 程維 李雅冬

(重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院頜面外科,重慶 400016)

化療藥物是治療惡性腫瘤的方法之一[1]，但是療效不理想[2]。因此仍需我們繼續(xù)尋找更為有效的藥物，而篩選出有效藥物的第一步就是體外藥敏試驗[3-4]。我們在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，微管蛋白酪氨酸連接酶類似物12(tubulin tyrosine ligase like 12，TTLL12)可以抑制微管蛋白和硝基化酪氨酸的結合，從而抑制硝基化酪氨酸的細胞清除作用，使得頭頸鱗癌Hep-2細胞可以繼續(xù)存活下去。因此TTLL12具備潛在癌基因的功能[5]。假設我們能夠發(fā)現(xiàn)某種藥物可以抑制TTLL12的功能，那么硝基化酪氨酸就可以順利地與微管蛋白結合在一起，形成的硝基化酪氨酸微管蛋白可以促使腫瘤細胞死亡。目前已知能夠影響細胞微管功能，且具有抗癌作用的臨床常用的藥物是紫杉醇(paclitaxel)[6]，其作用是使微管聚合，妨礙微管的解聚[7]。紫杉醇已經(jīng)應用于臨床，并對頭頸鱗癌有較好的治療效果，因此我們將紫杉醇做為對腫瘤有效的陽性對照。隨機選取一種化合物噻丙烯(Thiirene)，在Pubmed及維普、萬方等數(shù)據(jù)庫未查到噻丙烯與腫瘤相關的研究，因此我們將噻丙烯作為對腫瘤無作用的陰性對照。本研究基于這一思路，建立了一種既可以篩選出有效的抗癌藥物，又可以明確藥物具有以上作用機制的體外藥敏試驗方法，具體試驗方法如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑 TTLL12過表達Hep-2細胞株，MEM培養(yǎng)液，紫杉醇，噻丙烯，硝基化酪氨酸，辣根過氧化物酶標記硝基化酪氨酸抗體(Anti-Nitrotyrosine, clone 1A6, HRP conjugate，默克密理博 Merck Millipore )，細胞骨架隔離緩沖液(90mM Mes pH 6.7; 1 mM EGTA；1 mM MgCl2；10%甘油, 0.5% Triton X-100。

1.2 實驗方法的建立

1.2.1 Western Blot檢測噻丙烯和紫杉醇對硝基化酪氨酸微管蛋白的影響 在6孔板內(nèi)，每孔利用含50 μM硝基化酪氨酸的培養(yǎng)液培養(yǎng)2×105個TTLL12高表達Hep-2，試驗組加入100 μM噻丙烯或紫杉醇，對照組不加化合物，重復3孔；48 h后更新1次培養(yǎng)液，60 h后提取細胞總蛋白進行Western Blot試驗，檢測硝基化酪氨酸微管蛋白(N-tub)，α微管蛋白(α-tubulin)和TBP。

1.2.2 確定硝基化酪氨酸的最適濃度及藥物的最適濃度 利用96孔板，每孔80 μL MEM培養(yǎng)液，內(nèi)含10 000個TTLL12過表達Hep-2細胞，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)6 h后，每孔分別加入終濃度為800、400、200、100、50 μM的硝基化酪氨酸，共10 μL，由于酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)較Western Blot檢測敏感，因此噻丙烯與紫杉醇的用量均小于100 μM(Western Blot用量)，每孔分別加入終濃度為40、20、10、5 μM 4個稀釋度，共10 μL，將它們和硝基化酪氨酸不同的稀釋濃度進行方陣滴定[8]，然后在37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)24 h后，去除培養(yǎng)液，每孔滴加100 μL細胞骨架隔離緩沖液，培養(yǎng)3 min，吸去緩沖液，滴加100 μL含有3.7%甲醛和0.05%Tween-20的PBS固定10 min，吸除固定液，滴加100 μL PBS稀釋的辣根過氧化物酶標記硝基化酪氨酸抗體(Anti-Nitrotyrosine, clone 1A6, HRP conjugate，默克密理博 Merck Millipore)1∶1000，在室溫下與細胞作用1 h，吸去抗體溶液，用含有0.05%Tween-20的PBS 200 μL沖洗小孔，然后每孔滴加100 μL的OPD(鄰苯二胺)-H2O2顯色3 min，再滴加50 μL的2 moL/L H2SO4終止反應，最后利用檢測儀在450 nm處讀數(shù)。

1.2.3 檢測新的體外藥敏試驗方法的靈敏性 分別將80、40、20、10、5、2.5 μM濃度的紫杉醇MEM培養(yǎng)液加入96孔板，每孔滴加10 μL，按照以上建立的新體外藥敏試驗方法檢測其OD450 nm值。

1.2.4 檢測新的體外藥敏試驗方法的特異性 按照已建立的新體外藥敏試驗方法，把紫杉醇看作陽性對照，把噻丙烯看作陰性對照，利用目前已知對微管無作用的有效抗癌藥物：環(huán)磷酰胺(CTX)，氟尿嘧啶(5-Fu)，甲氨蝶呤(MTX)，卡鉑(carboplatin)4種待測藥物進行試驗，將10 μM化合物溶于10 μL MEM培養(yǎng)液中，利用96孔板進行已建立的新體外藥敏試驗，檢測OD 450nm值。

1.2.5 檢測新的體外藥敏試驗方法的重復性 利用96孔板，利用陽性對照紫杉醇，陰性對照噻丙烯，抗癌藥物卡鉑，氟尿嘧啶和環(huán)磷酰胺進行已建立的新體外藥敏試驗。在同一批試驗中每份樣品平行設 6個重復，進行批內(nèi)重復試驗。另外在4個不同試驗日重復新體外藥敏試驗,進行批間重復試驗。計算其變異系數(shù)。變異系數(shù)=標準差/平均數(shù)×100%。

1.2.6 利用新的體外藥敏試驗篩選抗癌藥物 在sigma公司的化合物中隨機抽取40例化合物，名稱如下：1為育亨烷，2為麥角它曼 ，3為白堅木米定 ，4為1H-吡咯里嗪 ，5為麥角林 ，6為1H-苯并氮雜卓，7為苉，8為咔唑，9為芴，10為夾二氮蒽，11為夾二硫蒽，12為9H-夾氧蒽，13為蒽，14為噻氨酯噠唑，15為螺戊烷，16為8-氮雜螺[4.5]癸烷，17為1,4-二氧雜螺[4.5]癸烷，18為2,7,9-三氮雜菲，19為1,7-菲咯啉 ，20為菲啶 ，21為埃博霉素B，22為次黃嘌呤核苷，23為胞嘧啶核苷，24為腺嘌呤核苷，25為蒄，26為苝，27為多西紫杉醇，28為芘，29為苊，30為氧環(huán)丁烯，31為噁丙烯，32為1-吖丙因，33為環(huán)硫乙烷，34為環(huán)氧乙烷，35為環(huán)氮乙烷，36為環(huán)丙烷，37為噻丁環(huán)，38為噁丁環(huán)，39為吖丁啶，40為環(huán)丁烷。按照我們已建立的新體外藥敏試驗方法進行試驗：在96孔板的每孔內(nèi)注入含有10 000個TTLL12過表達Hep-2細胞的MEM培養(yǎng)液80 uL，在37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)6 h后，每孔加入終濃度是400 μM的硝基化酪氨酸，和終濃度為10uM的待測藥物或紫杉醇，重復6孔，培養(yǎng)24 h后，吸去培養(yǎng)液，每孔滴加100 μL細胞骨架隔離緩沖液，培養(yǎng)3 min，去除緩沖液，滴加100 μL含有3.7%甲醛和0.05%Tween-20的PBS固定10 min，吸除固定液，滴加100 μL PBS稀釋的辣根過氧化物酶標記硝基化酪氨酸抗體(1∶1000)，在室溫下與細胞作用1 h，吸去抗體溶液，用含有0.05%Tween-20的PBS200 μL沖洗小孔，然后滴加100 μL的OPD(鄰苯二胺)-H2O2顯色3 min，最后每孔滴加50 μL的2 moL/L H2SO4終止反應，利用檢測儀測定OD 450 nm處讀數(shù)。

1.2.7 利用試驗所得的敏感藥物噻氨酯噠唑進行Western Blot試驗 噻氨酯噠唑可促進微管的聚合，并且可抑制微管的解聚，延長有絲分裂，最終促使細胞死亡[9]。在6孔板內(nèi)，每孔利用含50 μM硝基化酪氨酸的培養(yǎng)液培養(yǎng)2×105個TTLL12高表達Hep-2，加入100 μM噻氨酯噠唑，重復3孔；48 h后更新1次培養(yǎng)液，60 h后提取細胞總蛋白進行Western Blot試驗，檢測硝基化酪氨酸微管蛋白(N- tub)，α微管蛋白(α-tubulin)和TBP。

2 結果

2.1 紫杉醇和噻丙烯對硝基化酪氨酸微管蛋白的影響 Western Blot結果顯示，加入紫杉醇的細胞可明顯發(fā)現(xiàn)硝基化酪氨酸微管蛋白條帶，而沒有加入紫杉醇的細胞未發(fā)現(xiàn)硝基化酪氨酸微管蛋白條帶，未加入和加入噻丙烯的細胞均未發(fā)現(xiàn)硝基化酪氨酸微管蛋白條帶，見圖1。表明紫杉醇可促進硝基化酪氨酸和微管蛋白的結合，產(chǎn)生硝基化酪氨酸微管蛋白，因此具有抑制TTLL12功能的作用，可以用作陽性對照。而噻丙烯未形成硝基化酪氨酸微管蛋白，不具有抑制TTLL12功能的作用，可以用作陰性對照。

圖1 紫杉醇和噻丙烯對硝基化酪氨酸微管蛋白的影響

2.2 硝基化酪氨酸最適濃度和待測藥物最適濃度的確定 方陣試驗結果顯示，400 μM的硝基化酪氨酸，10 μM的待測藥物，陽性對照紫杉醇的OD450nm值在1.0左右，且陰性對照噻丙烯的OD450 nm值較低，兩者的比值(P/N值)最高，見表1。因此我們確定400 μM是硝基化酪氨酸最適濃度，10 μM是待測藥物最適濃度。

表1 硝基化酪氨酸和待測藥物濃度的確定

2.3 新的體外藥敏試驗方法的靈敏性試驗 新的體外藥敏試驗方法的靈敏性試驗結果顯示，最低濃度為2.5 μM的紫杉醇的OD450 nm值0.681仍>10 μM的陰性對照噻丙烯的OD450 nm值0.122，見表2。表明新的體外藥敏試驗的靈敏性較好。

表2 新的體外藥敏試驗方法的靈敏性

2.4 新的體外藥敏試驗方法的特異性試驗 新的體外藥敏試驗方法的特異性試驗結果顯示其他藥物的OD450 nm均小于陽性對照值，見表3。表明新的體外藥敏試驗方法特異性好。另外由于本試驗待測樣品為化合物，不含其他蛋白類物質，不會與硝基化酪氨酸抗體反應，因此其特異性好。

表3 新的體外藥敏試驗方法的特異性試驗

2.5 新的體外藥敏試驗方法的重復性試驗 新的體外藥敏試驗方法的重復性試驗結果顯示批內(nèi)變異系數(shù)在 3.5%～7.87%，批間變異系數(shù)在 2.86%～6.99%，均小于10%，見表4。因此，新的體外藥敏試驗方法具有較好的重復性。

2.6 新的體外藥敏試驗的應用 新的體外藥敏試驗結果顯示大部分檢測樣品的OD450 nm值都小于0.452，只有14號樣品的OD450 nm值大于1，14號樣品化學名稱為噻氨酯噠唑，見表5。

表4 批內(nèi)、批間重復性試驗結果

表5 試驗結果

2.7 噻氨酯噠唑對硝基化酪氨酸微管蛋白的影響 Western Blot結果顯示加入噻氨酯噠唑的細胞可看到硝基化酪氨酸微管蛋白條帶，見圖2。表明噻氨酯噠唑可促進硝基化酪氨酸和微管蛋白的結合，生成硝基化酪氨酸微管蛋白，因此具有抑制TTLL12功能的作用。

圖2 噻氨酯噠唑對硝基化酪氨酸微管蛋白的影響

3 討論

由于腫瘤存在異質性，導致不同的個體對同一藥物的反應不同，從而影響了臨床的化療效果[10]。針對這一問題，上世紀有研究者提出利用藥敏實驗進行個體化治療[11]，以期提高臨床療效。由于體外藥敏實驗具有簡單、快速等優(yōu)點[12]，因此得到廣泛應用。但是體內(nèi)微環(huán)境的變化有可能導致耐藥現(xiàn)象的出現(xiàn)[13]，這就降低了體外藥敏實驗指導臨床個體化治療的療效。但是利用體外藥敏實驗尋找潛在的有效抗癌藥物，仍然是一種有效方法[14-19]。

微管蛋白和硝基化酪氨酸在微管蛋白酪氨酸連接酶的作用下結合，產(chǎn)生硝基化酪氨酸微管蛋白。而硝基化酪氨酸微管蛋白的形成會明顯改變細胞內(nèi)微管的結構，影響微管的正常功能，使得細胞內(nèi)運輸障礙、黏附能力下降、有絲分裂受阻以及變形等等，最后致使細胞死亡[20]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)硝基化酪氨酸微管蛋白會導致頭頸鱗癌細胞凋亡，從而阻礙其繼續(xù)生長，而TTLL12能夠抑制細胞內(nèi)形成硝基化酪氨酸微管蛋白，避免癌細胞受到硝基化酪氨酸微管蛋白的死亡打擊，使癌細胞繼續(xù)存活下去[5]。這一發(fā)現(xiàn)讓我們想到，如果有藥物能夠抑制TTLL12的功能，消除其對硝基化酪氨酸微管蛋白生成的抑制作用，那么其就可以通過生成硝基化酪氨酸微管蛋白，殺死癌細胞。鑒于酶聯(lián)免疫吸附試驗具有快速、敏感、簡便等優(yōu)點[21]，我們利用酶聯(lián)免疫吸附試驗結合我們的發(fā)現(xiàn)，建立了一種靶向TTLL12的新的體外藥敏實驗方法。這種新的體外藥敏實驗方法是利用TTLL12過表達細胞株與硝基化酪氨酸和待測藥物共同培養(yǎng)，然后通過ELISA檢測硝基化酪氨酸微管蛋白的多少，待測藥物的試驗結果與陽性對照紫杉醇比較，從而判定待測藥物是否具有更好的抗癌效果，并了解其抗癌機制。本研究結果顯示，新的體外藥敏試驗可篩選出影響微管，抑制TTLL12功能，抗癌效果較好的藥物。

這種新的體外藥敏實驗方法具有以下特點：①方法簡單，靈敏度高，快捷，特異性好，便宜，穩(wěn)定，易于推廣。本法步驟較少，所需技術比較簡單，只要掌握了細胞培養(yǎng)和ELISA技術，就掌握了本法，因此比較簡單；本實驗方法中使用了酶的高效生物催化作用，使得含量極低的硝基化酪氨酸微管蛋白也可被識別出來，因此其靈敏度高；本實驗方法完成檢測1個96孔板共需約32 h，耗時比較短，因此本法比較快捷；本實驗方法中，硝基化酪氨酸抗體和硝基化酪氨酸微管蛋白結合，屬于抗體和抗原的結合，因此特異性好；本實驗方法用到的材料均為細胞培養(yǎng)和ELISA技術常用材料，并不涉及到特殊或貴重材料，因此易于購買，價格便宜；本實驗方法的步驟較少，試劑較少，變異因素較少，因此試驗結果具有較好的可重復性，比較穩(wěn)定。②可進行大規(guī)模的篩查。本實驗方法步驟較少，方法簡單，全程可自動機械化同時進行多個96孔板同時檢測，1個96孔板1次可檢測16種藥物，如果同時連續(xù)檢測多個96孔板，在32小時內(nèi)就可檢測上百種藥物，這種高通量試驗，可以進行大規(guī)模的篩查。③試驗結果在顯示藥物抗癌效果的同時，也揭示了藥物的作用機制。待檢藥物如果參與了細胞的微管修飾過程，能夠使得硝基化酪氨酸和微管結合在一起，形成硝基化酪氨酸微管蛋白，從而使腫瘤細胞凋亡，同時硝基化酪氨酸微管蛋白會與抗體結合，最終致使試驗結果讀數(shù)增高，若高于陽性對照值，我們就得到了有研發(fā)前景的抗癌藥物。這樣的藥物可殺死癌細胞，抗癌效果甚至可能比紫杉醇更好；其作用機制為該藥物參與了細胞的微管修飾過程，抑制了TTLL12的功能，使得硝基化酪氨酸和微管結合在一起，形成了硝基化酪氨酸微管蛋白，從而致使腫瘤細胞凋亡。利用本試驗可同時獲得以上兩種信息，這加快了待測藥物應用于臨床的速度，有望挽救更多患者的生命。本研究報告利用TTLL12過表達細胞株來篩選抗癌藥物，為尋找針對微管系統(tǒng)的新的抗癌藥物打下了堅實的基礎。

4 結論

本研究為篩選抗癌藥物提供了一種以TTLL12為靶點的簡單、快捷、穩(wěn)定、敏感的實驗方法，對于抗癌藥物的基礎研究具有良好的應用價值。