景富春 景璇 張軍 王進(jìn)海 馮 胡浩 孫曉明 鄭建云 尹曉然

(1. 西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科·陜西省胃腸動(dòng)力疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710004；2.延安大學(xué)附屬寶雞市人民醫(yī)院消化內(nèi)科，陜西 寶雞 721000；3.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)2018級(jí)3班，新疆 石河子 832000；4.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥理學(xué)系，陜西 西安710068；5.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，陜西 西安 710068；6.西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科，陜西 西安 710077)

功能性消化不良(functional dyspepsia, FD)是以胃十二指腸癥狀如上腹脹、上腹痛、早飽及上腹燒灼感等為主而又排除器質(zhì)性病變的一種臨床綜合癥，胃敏感性增高(gastric hypersensitivity, GHS)是其出現(xiàn)上述癥狀的主要病理生理改變和特征性發(fā)病機(jī)制之一[1]，也是FD治療效果差且易于復(fù)發(fā)的重要原因。焦慮是臨床常見(jiàn)的精神心理障礙， 在FD患者中發(fā)生率高達(dá)40%～90%[2]，其通過(guò)影響人體的神經(jīng)體液調(diào)節(jié)對(duì)FD的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生重要作用，是GHS形成的關(guān)鍵誘因之一。一些神經(jīng)調(diào)節(jié)因子如5羥色胺(5-HT)[3]、γ-氨基丁酸(GABA)[4]、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF)[5]和nesfatin-1[6-7]等同時(shí)參與了焦慮抑郁等精神心理活動(dòng)和胃感受性等內(nèi)臟感覺(jué)的調(diào)節(jié)，是FD患者腦和胃共有的神經(jīng)生化調(diào)節(jié)物質(zhì)，其在腦、血液和胃組織內(nèi)的含量變化對(duì)伴焦慮癥狀并以GHS為主要病理生理改變的FD患者具有顯著影響。天麻素(gastrodin, Gas)是從中藥天麻中提取的一種有效成分，具有抗焦慮、鎮(zhèn)靜催眠及治療神經(jīng)衰弱等作用[8]，對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠紋狀體內(nèi)的GABA[9]、損傷后脊髓中的BDNF[10]及慢性輕度應(yīng)激大鼠腦內(nèi)5-HT等單胺類神經(jīng)遞質(zhì)有調(diào)節(jié)作用[11]。我們將Gas試用于臨床FD患者，發(fā)現(xiàn)其對(duì)FD伴隨的焦慮和上腹痛等消化不良癥狀有一定改善作用[12]。然而，Gas是否通過(guò)影響腦胃共有的神經(jīng)生化調(diào)節(jié)因子產(chǎn)生上述作用尚不清楚。我們前期已利用神經(jīng)藥理學(xué)方法和消化病學(xué)造模技術(shù)，成功建立了焦慮樣GHS大鼠FD模型[13]，并應(yīng)用該模型初步觀察了Gas對(duì)大鼠焦慮樣行為和胃敏感性的作用[1]。在此基礎(chǔ)上，本研究擬通過(guò)觀察天麻素對(duì)大鼠海馬、胃壁及血漿中5-HT、GABA、BDNF和nesfatin-1含量變化的影響，探討其調(diào)節(jié)FD大鼠焦慮癥狀和GHS的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組 40只1日齡SPF級(jí)雄性Sprague-Dawley仔鼠，體質(zhì)量3～5 g，購(gòu)自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(陜)2014-002。隨機(jī)分為5組：對(duì)照組、模型組、丁螺環(huán)酮組、Gas小劑量組和Gas大劑量組，每組8只。母嬰同籠飼養(yǎng)于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部機(jī)能實(shí)驗(yàn)中心，室溫(24±1)℃，相對(duì)濕度(50±20)%，按12:12小時(shí)明暗循環(huán)，母鼠自由進(jìn)食和飲水。研究經(jīng)西安交通大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 試劑和儀器 碘乙酰胺(iodoacetamide，IA)購(gòu)自上海麥克林公司，蔗糖購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)，戊巴比妥鈉購(gòu)自德國(guó)Merck公司，5羥色胺(5-HT)、γ氨基丁酸(GABA)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)和nesfatin-1酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒購(gòu)自上海閎巨公司。Gas購(gòu)自昆明制藥集團(tuán)公司(批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20013046)，丁螺環(huán)酮購(gòu)自江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司(批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H19991024)。酶標(biāo)儀為美國(guó)Molecular Devices (VERSAmax)公司生產(chǎn)。

1.3 造模方法和給藥

1.3.1 母嬰分離法[14]對(duì)照組母嬰同籠常規(guī)飼養(yǎng)。其余各組乳鼠自出生后第2日起，每日與母鼠分離3小時(shí)，時(shí)間為上午9∶00～12∶00，至第21日結(jié)束。所有幼鼠自出生后第22日斷奶，與母鼠完全分離，單籠飼養(yǎng)至生后第8周進(jìn)入束縛應(yīng)激試驗(yàn)。

1.3.2 急性胃應(yīng)激法[15]接受母嬰分離的乳鼠于出生后第10日起，每日采用含0.1%碘乙酰胺的2%蔗糖溶液灌胃0.2 mL，對(duì)照組僅用等容積2%蔗糖溶液灌胃，連續(xù)6天。

1.3.3 束縛應(yīng)激法[16]經(jīng)母嬰分離和急性胃應(yīng)激實(shí)驗(yàn)發(fā)育而成的大鼠，于出生后第8周接受束縛應(yīng)激試驗(yàn)。每只大鼠每日被置于自制的長(zhǎng)15 cm、直徑6 cm通風(fēng)良好的塑料圓筒束縛應(yīng)激裝置內(nèi)，持續(xù)90 min后放回原籠，連續(xù)1周。

1.3.4 給藥 于第8周束縛應(yīng)激試驗(yàn)結(jié)束后，立即開(kāi)始腹腔內(nèi)注射給藥，每天1次，連續(xù)7天。其中對(duì)照組和模型組分別給予等容積0.9%氯化鈉溶液2.0 mL/kg，Gas小劑量組和大劑量組分別給予Gas 62.5 mg/kg和125 mg/kg，丁螺環(huán)酮組給予丁螺環(huán)酮 3.125 mg/kg。

1.4 腦、胃相關(guān)神經(jīng)調(diào)節(jié)因子檢測(cè) 第8周束縛應(yīng)激試驗(yàn)結(jié)束后，每只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，然后在戊巴比妥鈉麻醉下，采尾靜脈血1.0 mL，3000 rpm離心15 min后取上清液300 μL，置于-80℃冰箱保存，擇日測(cè)定。采血后大鼠被迅速斷頭處死，取腦并分離海馬、取胃體部組織塊，勻漿器制作海馬及胃組織勻漿，3000 rpm低溫離心30 min后取上清液，分別置于-80℃冰箱保存待測(cè)。樣品中5-HT、BDNF、GABA和nesfatin-1等的含量測(cè)定均采用ELISA法，測(cè)定日按照試劑操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 天麻素對(duì)焦慮樣胃高敏感性FD模型大鼠海馬、胃和血漿中5-HT含量的影響 模型組大鼠海馬、胃和血漿中5-HT的濃度均低于對(duì)照組，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組相比，Gas小劑量組、Gas大劑量組和丁螺環(huán)酮組各部位5-HT濃度均明顯增加(P<0.01)，且不同部位間5-HT濃度呈現(xiàn)同步變化趨勢(shì)，見(jiàn)圖1。表明天麻素可對(duì)模型大鼠不同部位5-HT含量產(chǎn)生影響。

圖1 各組大鼠海馬、血漿和胃組織內(nèi)5-HT含量

2.2 天麻素對(duì)焦慮樣胃高敏感性FD模型大鼠海馬內(nèi)GABA含量的影響 模型組大鼠海馬內(nèi)GABA的濃度低于對(duì)照組，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組相比， Gas小劑量組、Gas大劑量組和丁螺環(huán)酮組海馬內(nèi)GABA濃度明顯增加(P<0.01)，見(jiàn)圖2。提示天麻素可通過(guò)影響腦內(nèi)GABA含量產(chǎn)生相應(yīng)作用。

2.3 天麻素對(duì)焦慮樣胃高敏感性FD模型大鼠海馬、胃和血漿中BDNF含量的影響 模型組大鼠海馬、胃和血漿中BDNF的濃度均低于對(duì)照組，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組相比，Gas小劑量組、Gas大劑量組和丁螺環(huán)酮組各部位BDNF濃度均明顯增加(P<0.01)，且不同部位間BDNF濃度呈現(xiàn)同步變化趨勢(shì)，見(jiàn)圖3。提示天麻素亦可通過(guò)影響B(tài)DNF發(fā)揮調(diào)節(jié)焦慮樣行為和胃敏感性的作用。

圖2 各組大鼠海馬內(nèi)GABA含量

圖3 各組大鼠海馬、血漿和胃組織內(nèi)BDNF含量

2.4 天麻素對(duì)焦慮樣胃高敏感性FD模型大鼠海馬、胃和血漿中nesfatin-1含量的影響 模型組大鼠海馬、胃和血漿中nesfatin-1的濃度均高于對(duì)照組，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組相比， Gas小、大劑量組和丁螺環(huán)酮組各部位nesfatin-1濃度均明顯下降(P<0.01)，且不同部位間nesfatin-1濃度呈現(xiàn)出同步變化的趨勢(shì)；但Gas的作用未表現(xiàn)出明顯量效關(guān)系，見(jiàn)圖4。表明海馬、胃和血漿中的nesfatin-1也是天麻素作用靶點(diǎn)之一。

圖4 各組大鼠海馬、血漿和胃組織內(nèi)nesfatin-1含量

3 討論

Gas是天麻中的一種有效成分，具有抗焦慮、鎮(zhèn)靜催眠及治療神經(jīng)衰弱等作用[8]，可提高腦缺血再灌注損傷大鼠紋狀體內(nèi)的GABA[9]、損傷后脊髓中的BDNF[10]及慢性輕度應(yīng)激大鼠腦內(nèi)5-HT等神經(jīng)活性物質(zhì)的含量[11]，但其是否對(duì)焦慮樣胃高敏感FD模型大鼠海馬、胃和血漿中的前述腦胃共有神經(jīng)調(diào)節(jié)因子產(chǎn)生影響尚不清楚。本研究通過(guò)將Gas用于焦慮樣胃高敏感FD模型大鼠，初步證實(shí)了Gas對(duì)模型大鼠海馬、胃及血漿中的5-HT、BDNF、GABA和nesfatin-1含量具有調(diào)節(jié)作用。

腦內(nèi)5-HT能神經(jīng)元突觸前膜對(duì)5-HT的釋放減少或突觸間隙內(nèi)5-HT的濃度降低可引起焦慮樣情緒和行為，而抑制突觸前膜對(duì)5-HT的再攝取、增加突觸間隙中5-HT的濃度則能使焦慮障礙減輕[5,17]。但尚不清楚海馬及胃黏膜內(nèi)5-HT受體的具體種類、分布及作用，也不明確腦、胃和血液中5-HT變化是否存在一致性。目前僅知胃腸道主要有5-HT1、5-HT2、5-HT3、5-HT4、5-HT7五種受體亞型，其中5-HT2、5-HT3、5-HT4受體可介導(dǎo)胃腸道平滑肌收縮[3]，5-HT1、5-HT7受體則介導(dǎo)胃腸道平滑肌松弛[18]。本研究發(fā)現(xiàn)焦慮樣GHS模型組大鼠海馬、血漿和胃組織內(nèi)的5-HT水平較對(duì)照組明顯降低，且具同步性，提示上述三個(gè)部位的5-HT均參與了模型大鼠焦慮及消化不良癥狀的形成。Gas小劑量組、Gas大劑量組和丁螺環(huán)酮組大鼠三個(gè)部位的5-HT含量則均明顯高于模型組，表明Gas和丁螺環(huán)酮均有提高海馬、血漿和胃組織內(nèi)5-HT含量，從而改善焦慮樣GHS模型大鼠的焦慮行為和FD癥狀的作用。

GABA是一種中樞抑制性遞質(zhì)，缺乏時(shí)人和動(dòng)物會(huì)表現(xiàn)出焦慮、失眠、情緒激動(dòng)等精神心理反應(yīng)。焦慮狀態(tài)下動(dòng)物由于海馬內(nèi)缺乏GABA或GABA受體可致內(nèi)臟痛閾降低、內(nèi)臟痛覺(jué)及敏感性增加[4]。本研究顯示，在焦慮樣GHS模型大鼠海馬內(nèi)GABA的含量明顯減少。而Gas小劑量組、Gas大劑量組和丁螺環(huán)酮組大鼠海馬內(nèi)GABA含量則較模型組明顯升高，表明Gas和丁螺環(huán)酮均可通過(guò)調(diào)節(jié)海馬內(nèi)GABA濃度而產(chǎn)生一定的抗焦慮和調(diào)節(jié)內(nèi)臟敏感性作用。

BDNF是腦內(nèi)含量最多的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，其不僅與GABA能神經(jīng)功能的維持有關(guān)，而且參與了焦慮的形成。海馬區(qū)BDNF表達(dá)下降或基因敲除后，動(dòng)物表現(xiàn)出明顯的焦慮情緒與行為，而向相應(yīng)腦區(qū)注射BDNF則有利于緩解焦慮狀態(tài)。有研究[5]還揭示某些部位BDNF的含量變化尚與胃和結(jié)腸的敏感性呈正相關(guān)關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)焦慮樣GHS模型FD大鼠海馬、血清和胃內(nèi)的BDNF含量同步性減少，與前述研究結(jié)果部位不同、結(jié)論不完全一致。推測(cè)在這一模型大鼠體內(nèi)BDNF參與了焦慮樣精神心理和行為的調(diào)節(jié)，但對(duì)胃敏感性的調(diào)節(jié)則不是單一因素，而是受到其他幾種生物活性分子的共同作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Gas對(duì)焦慮樣GHS模型FD大鼠海馬、血清和胃內(nèi)的BDNF含量均有升高作用，丁螺環(huán)酮亦表現(xiàn)出相似的作用，提示Gas可以通過(guò)影響B(tài)DNF而影響焦慮樣GHS模型大鼠的腦胃生物學(xué)行為。

Nesfatin-1是一種肽類激素，具有抑制攝食和誘導(dǎo)焦慮反應(yīng)的作用[19]。神經(jīng)性厭食癥伴焦慮患者血漿中的nesfatin-1濃度升高[6]，而腦室內(nèi)注射nesfatin-1可使胃排空延遲[20]。nesfatin-1尚可影響內(nèi)臟感覺(jué)、增加內(nèi)臟敏感性[7]。本研究結(jié)果顯示焦慮樣GHS模型FD大鼠海馬、血清和胃內(nèi)的nesfatin-1含量明顯增多，推測(cè)其為伴焦慮癥狀GHS的FD患者腦胃軸的重要調(diào)節(jié)激素之一。與之相比較，Gas組可明顯下調(diào)海馬、血漿和胃組織內(nèi)nesfatin-1的含量，這一作用與丁螺環(huán)酮類似，提示Gas本身具有影響中樞和外周相關(guān)部位nesfatin-1水平，進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)動(dòng)物精神心理和胃敏感性的雙重作用。

4 結(jié)論

Gas能明顯增加序貫應(yīng)激所致焦虛樣胃高敏感FD模型大鼠海馬、血漿和胃組織中的5-HT、BDNF、GABA的含量，減少nesfatin-1的含量。