許明星 鄭傳東 楊鵬 楊娜

(成都市第三人民醫(yī)院 1.麻醉科；2.病理科，四川 成都 610031)

心肌缺血是指心臟的血液灌注減少導(dǎo)致心臟的供氧減少，心肌能量代謝不正常，不能支持心臟正常工作的一種病理狀態(tài)；心肌缺血與多種心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，嚴(yán)重危害人類身體健康[1-2]。研究[3]表明麻醉藥對(duì)心肌細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，如七氟醚對(duì)心肌具有保護(hù)作用；丙泊酚可減輕高糖缺氧對(duì)心肌細(xì)胞的損傷[4]。硫噴妥鈉可減輕缺血后大鼠海馬腦片神經(jīng)元的損傷[5]，也可減輕再灌注心律失常[6]，但具體機(jī)制尚不清楚。miRNAs在心血管系統(tǒng)疾病如心肌梗死、肥大、纖維化、心力衰竭、心律失常、炎癥和動(dòng)脈粥樣硬化等病變組織中有差異表達(dá)，可能影響疾病的進(jìn)程[7-8]。研究[9]顯示，miR-664-1-5p在缺氧預(yù)處理大鼠心肌細(xì)胞中表達(dá)水平降低，可能參與缺氧介導(dǎo)的心肌細(xì)胞保護(hù)作用?；谝陨涎芯拷Y(jié)果，本研究假設(shè)，硫噴妥鈉通過調(diào)控miR-664-1-5p在缺氧大鼠心肌細(xì)胞損傷中發(fā)揮保護(hù)作用。本課題以大鼠心肌細(xì)胞H9c2為研究對(duì)象，建立氯化鈷(CoCl2)缺氧模型，研究硫噴妥鈉對(duì)CoCl2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞存活、凋亡的作用，及miR-664-1-5p在該保護(hù)機(jī)制中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠心肌細(xì)胞H9c2購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)和高糖DMEM培養(yǎng)基購自美國(guó)Gibco公司，硫噴妥鈉、氯化鈷(CoCl2)、胰蛋白酶、購自Sigma-Aldrich公司，BCA蛋白檢測(cè)試劑盒和CCK8檢測(cè)試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，雙染色流式法細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自BD公司，丙二醛(malondialdehyde,MDA) 和超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase,SOD) 檢測(cè)試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，miR-664-1-5p的模擬物(miR-664-1-5p)、miR-664-1-5p的干擾物(anti-miR-664-1-5p)、陰性對(duì)照(miR-NC、anti-miR-NC)和引物購自上海吉瑪制藥有限公司，Total RNA提取試劑盒、 real-time PCR 試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RT-PCR)購自寶生物工程(大連)有限公司，P21、Caspase-3和GAPDH抗體購自英國(guó)Abcam公司，流式細(xì)胞儀購自BD公司，Real-time PCR儀購自美國(guó)Bio-rad公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將H9c2細(xì)胞接種在含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2恒溫密閉培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，洗滌消化傳代。

1.2.2 細(xì)胞氯化鈷缺氧模型構(gòu)建和實(shí)驗(yàn)分組 氯化鈷模型建立：根據(jù)文獻(xiàn)[10]的方法，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9c2以1×104個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到80%左右時(shí)，棄培養(yǎng)液，加入含終濃度600 μmol/LCoCl2的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h即為模型組，對(duì)照組加入不含CoCl2的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h。將缺氧模型組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，加入含硫噴妥鈉終濃度125、250、500 nmol/L的DMEM培養(yǎng)液，置于37 ℃ 5%、CO2恒溫密閉培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min，根據(jù)濃度分別分為藥物1、2、3組。

1.2.3 CCK8法測(cè)定細(xì)胞存活率 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9c2以1×l04個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到80%時(shí)加入含600 μmol/L CoCl2培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h建立模型組，加入10 μLCCK8溶液，培養(yǎng)2 h后于450 nm處測(cè)定吸光度(A)值。細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值×100%。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞存活率和凋亡率 收集培養(yǎng)好的各組H9c2細(xì)胞，PBS緩沖液洗滌2次，稀釋細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL，根據(jù)凋亡試劑盒說明書進(jìn)行操作，取100 μL Binding buffer重懸細(xì)胞，然后加入5 μL膜聯(lián)蛋白V-FITC(Annexin V-FITC)和10 μL碘化丙啶(propidium iodide，PI)，室溫避光20 min，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 Western blot檢測(cè)P21和Caspase-3凋亡相關(guān)蛋白水平 收集培養(yǎng)好的各組H9c2細(xì)胞，裂解細(xì)胞，收集蛋白，用BCA法檢測(cè)蛋白濃度，進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，室溫封閉2 h，加入一抗(P21抗體1∶1000，Caspase-3抗體1∶1000，GAPDH抗體 1∶2000)，4 ℃孵育過夜，PBST洗膜2次，加入稀釋的二抗,室溫孵育2 h，分析蛋白水平，以GAPDH為內(nèi)參照。

1.2.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9c2細(xì)胞，以每孔2×l05個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，細(xì)胞融合為一層時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，用無血清OptiMEM培養(yǎng)液稀釋Lipofectamine 2000、miR-664-1-5p、miR-NC、anti-miR-NC、anti-miR-664-1-5p，分別記為miR-664-1-5p組、miR-NC組、anti-miR-NC組、anti-miR-664-1-5p組，將各組載體轉(zhuǎn)染入培養(yǎng)好的細(xì)胞中，培養(yǎng)6 h后換成完全培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)染48 h，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.7 Real-time PCR檢測(cè)miR-664-1-5p的表達(dá)水平 收集模型組、加藥組和/或轉(zhuǎn)染的各組H9c2細(xì)胞，用試劑盒提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，取cDNA按照 Real-time PCR的說明書進(jìn)行反應(yīng)檢測(cè)miR-664-1-5p的含量。用2-ΔΔCt方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 硫噴妥鈉對(duì)CoCl2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的細(xì)胞存活率和凋亡的影響 與對(duì)照組相比，模型組心肌細(xì)胞H9c2中P21和Caspase-3含量升高，細(xì)胞存活率降低，凋亡率升高(P<0.05)；與模型組相比，藥物2組和藥物3組H9c2細(xì)胞P21和Caspase-3含量降低，細(xì)胞存活率升高，凋亡率降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1和表1。

圖1 凋亡及P21、Caspase-3蛋白的表達(dá)

表1 硫噴妥鈉對(duì)CoCl2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的細(xì)胞存活率和凋亡的影響

2.2 硫噴妥鈉對(duì)CoCl2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中miR-664-1-5p、SOD、MDA表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，模型組H9c2細(xì)胞中miR-664-1-5p含量下降(P<0.05)，MDA含量增多(P<0.05)，SOD活性降低(均P<0.05)；與模型組相比，藥物2組和藥物3組H9c2細(xì)胞的miR-664-1-5p含量升高，細(xì)胞中MDA含量減少，SOD活性升高(均P<0.05)，見表2。提示CoCl2可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞miR-664-1-5p含量降低，抗氧化能力減弱；硫噴妥鈉可減輕CoCl2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2損傷，提高心肌細(xì)胞的抗氧化能力。綜上，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇藥物3組濃度進(jìn)行。

表2 硫噴妥鈉對(duì)CoCl2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中miR-664-1-5p、SOD、MDA表達(dá)的影響

2.3 過表達(dá)miR-664-1-5p對(duì)CoCl2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的細(xì)胞存活率和凋亡及SOD、MDA的影響 Westernblot和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與miR-NC組相比，miR-664-1-5p組H9c2細(xì)胞中miR-664-1-5p含量升高，細(xì)胞存活率升高，凋亡率降低，細(xì)胞中MDA、P21和Caspase-3含量減少，SOD活性升高(均P<0.05)，見圖2和表3。

2.4 抑制miR-664-1-5p能減弱硫噴妥鈉對(duì)CoCl2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的細(xì)胞存活率和凋亡的影響 與anti-miR-NC組相比，anti-miR-664-1-5p組的miR-664-1-5p含量降低，細(xì)胞存活率降低，凋亡率升高，細(xì)胞中P21和Caspase-3含量增多，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3和表4。

圖2 凋亡及P21、Caspase-3蛋白的表達(dá)

表3 過表達(dá)miR-664-1-5p對(duì)CoCl2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的細(xì)胞存活率和凋亡及SOD、MDA的影響

圖3 凋亡及P21、Caspase-3蛋白的表達(dá)

表4 抑制miR-664-1-5p能減弱硫噴妥鈉對(duì)CoCl2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的細(xì)胞存活率和凋亡的影響

2.5 抑制miR-664-1-5p能減弱硫噴妥鈉對(duì)CoCl2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞中SOD、MDA的影響 與anti-miR-NC組相比，anti-miR-664-1-5p組的H9c2細(xì)胞中MDA含量增多，SOD活性降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見表5。

表5 抑制miR-664-1-5p能減弱硫噴妥鈉對(duì)CoCl2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中SOD、MDA的影響

3 討論

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)及時(shí)進(jìn)行再灌注治療恢復(fù)缺血心肌的血液供應(yīng)，被認(rèn)為是阻止心肌壞死最有效的治療手段，但其又會(huì)引發(fā)心肌缺血再灌注損傷[11-12]。減少心肌細(xì)胞凋亡是減輕心肌損傷的重要途徑之一[13-14]。研究[15]表明，硫噴妥鈉等麻醉劑可能通過鈣鉀通道電流減輕心肌缺氧損傷。miRNA可與心肌細(xì)胞損傷的過程，且miRNA在胎兒心肌細(xì)胞、心臟成熟和成人心臟病中均發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，可能是促進(jìn)損傷后心臟修復(fù)的有價(jià)值靶點(diǎn)[16-17]。韓正怡[18]發(fā)現(xiàn)，miR-664-1-5p在嗎啡預(yù)處理的缺氧/復(fù)氧H9c2心肌細(xì)胞中表達(dá)減少。miR-664-1-5p在缺氧預(yù)處理和嗎啡預(yù)處理的慢性心力衰竭模型細(xì)胞中也表達(dá)下調(diào)，可能通過調(diào)節(jié)靶基因Fas在嗎啡預(yù)處理的心臟保護(hù)作用中起著重要作用[9]。

SOD是細(xì)胞內(nèi)氧自由基清除劑，可降低細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激水平[19]；MDA是脂質(zhì)過氧化物的終產(chǎn)物，其水平可間接反映細(xì)胞氧化損傷程度[20]。本研究通過建立大鼠心肌細(xì)胞H9c2的CoCl2化學(xué)缺氧模型，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，H9c2經(jīng)CoCl2化學(xué)缺氧處理后，細(xì)胞存活率降低，凋亡率升高，SOD含量降低，MDA及P21和Caspase-3蛋白含量升高；miR-664-1-5p在CoCl2處理后的H9c2細(xì)胞中表達(dá)下降，與上述研究結(jié)果一致。模型組H9c2細(xì)胞經(jīng)過125、250、500 nmol/L的硫噴妥鈉處理后，細(xì)胞中miR-664-1-5p水平升高，細(xì)胞存活率升高，凋亡率降低，SOD含量升高，MDA含量降低。

為了確認(rèn)硫噴妥鈉通過miR-664-1-5p發(fā)揮對(duì)缺氧H9c2細(xì)胞存活和凋亡的調(diào)控作用，轉(zhuǎn)染實(shí)現(xiàn)過表達(dá)和抑制miR-664-1-5p。本研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-664-1-5p可抑制CoCl2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞存活率，提高SOD含量，降低MDA及P21和Caspase-3蛋白含量；抑制miR-664-1-5p則結(jié)果相反，減弱硫噴妥鈉對(duì)CoCl2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的細(xì)胞存活率、凋亡及細(xì)胞中SOD和MDA含量的影響。

4 結(jié)論

硫噴妥鈉可能通過上調(diào)miR-664-1-5p在CoCl2誘導(dǎo)的大鼠心肌H9c2細(xì)胞損傷中發(fā)揮保護(hù)作用，抑制細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞存活率，減輕細(xì)胞損傷，對(duì)心肌細(xì)胞缺氧損傷具有潛在的保護(hù)作用。