孔建強(qiáng) 邴淼 汪瓊 汪建勝

(上海市寶山區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院麻醉科, 上海 寶山 201999)

糖尿病是臨床常見的疾病之一，其中大部分患者均伴有心血管疾病，而氧化應(yīng)激損傷在糖尿病所致的心血管疾病中發(fā)揮重要作用，因而減輕心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷有助于提高糖尿病性心血管疾病的治療效果[1-2]。目前關(guān)于糖尿病性心血管疾病尚無理想治療藥物，因而尋找安全性高且毒性較小的藥物已然成為研究重點[3-4]。有研究[5]表明右美托咪定(Dexmedetomidine，DEX)可抑制燙傷大鼠心肌細(xì)胞凋亡。但DEX在糖尿病性心血管疾病中的治療效果及作用機(jī)制尚未完全闡明。孟佩盈等[6]研究顯示微小RNA-126(microRNA-126，miR-126)在2型糖尿病伴冠心病患者中呈低表達(dá)，其表達(dá)量與冠狀動脈病變嚴(yán)重程度密切相關(guān)。因此，本研究采用高糖處理心肌細(xì)胞，探討DEX對心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激及凋亡的影響，分析其對miR-126的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 大鼠心肌細(xì)胞H9C2購自美國ATCC公司，DEX購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，葡萄糖購自山東祥瑞藥業(yè)有限公司，杜氏改良培養(yǎng)基(DMEM)、胎牛血清購自美國Gibco公司，胰蛋白酶、Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司，乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所，膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)細(xì)胞凋亡試劑盒購自北京博邁斯科技發(fā)展有限公司，Trizol試劑購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒與實時熒光定量PCR試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，miR-126寡核苷酸模擬物(miR-126 mimics)及陰性對照mimic NC序列(miR-NC)、miR-126特異性寡核苷酸抑制劑(anti-miR-126)及其陰性對照(anti-miR-NC)購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，RIPA裂解液購自上海士鋒生物科技有限公司，二喹啉甲酸(bicinchoninicacid，BCA)蛋白定量檢測試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，兔抗鼠半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶3的前體蛋白(pro-caspase-3)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cl-caspase-3)抗體購自美國Santa Cruz公司，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗購自美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 取對數(shù)期心肌細(xì)胞接種于6孔板中，分別用葡萄糖濃度為5.5、35 mmol/L的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，分別記為對照組、高糖損傷模型組。分別使用不同濃度(5、10、20 μg/L )DEX處理心肌細(xì)胞，置于含有葡萄糖濃度為35 mmol/L的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，分別記作實驗1組、實驗2組、實驗3組。參照Lipofectamine2000試劑說明書分別將miR-NC、miR-126 mimics轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞，使用含有葡萄糖濃度為35 mmol/L的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，分別記為miR-NC組、miR-126組。參照Lipofectamine 2000試劑說明書分別將miR-NC、miR-126 mimcis、anti-miR-NC、anti-miR-126轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞，使用含有葡萄糖濃度為35 mmol/L與DEX濃度為20 μg/L的 DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，分別記作實驗3+miR-NC組、實驗3+miR-126組、實驗3+anti-miR-NC組、實驗3+anti-miR-126組。

1.2.2 檢測LDH、MDA、SOD的含量 取對數(shù)期心肌細(xì)胞(3×104個/mL)接種于96孔板(100 μL/孔)，按照“1.2.1”實驗分組處理后，收集細(xì)胞，按照試劑盒說明書檢測LDH、MDA、SOD的含量，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 收集各組對數(shù)期心肌細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌，4 ℃條件下經(jīng)1000 r/min離心10 min，加入500 μL結(jié)合緩沖液，依次加入5 μL Annexin V-FITC與5 μL PI，充分混勻，室溫振蕩搖晃孵育10 min，應(yīng)用FACS Calibur流式細(xì)胞儀及Cellauest軟件檢測各組細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)檢測細(xì)胞中miR-126的表達(dá)水平 收集各組對數(shù)期心肌細(xì)胞，采用Trizol法提取細(xì)胞中的總RNA。應(yīng)用Nanodrop2000c超微量分光光度計檢測RNA濃度與純度，RNA OD260/OD280處于1.8～2.0。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，miR-126正向引物5′-GGCTTCGTACCG TGAGTAAT-3′，反向引物5′-GTGCAGGGTCCGA GGT-3′；U6正向引物5′-GCTTCGGCAGCACATA TACT-3′，反向引物5′-GTGCAGGGTCCGAGGTA TTC-3′。引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計合成。以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 2.5 μL，MgSO42.5 μL，dNTPs 2.5 μL，正反向引物各0.5 μL，cDNA 2 μL，RNase-Free ddH2O補(bǔ)足體系至25 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40次循環(huán)。miR-126以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算miR-126相對表達(dá)量。

1.2.5 蛋白免疫印跡(Western blot)檢測pro-caspase-3、cl-caspase-3蛋白水平 收集各組對數(shù)期心肌細(xì)胞，加入適量RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白。采用BCA法測定蛋白濃度，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，將分離的蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜，室溫封閉2 h，加入一抗稀釋液(pro-caspase-3稀釋比1:1000、cl-caspase-3稀釋比1∶1000，內(nèi)參GAPDH1∶1000)，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌，加入二抗稀釋液(1∶5000)，室溫孵育1 h，TBST洗滌，暗室內(nèi)曝光顯影，應(yīng)用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 右美托咪定對高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響 與對照組比較，高糖損傷模型組LDH、MDA含量顯著升高(P<0.05)，SOD含量顯著降低(P<0.05)；與高糖損傷模型組比較，實驗1組、實驗2組、實驗3組LDH、MDA含量顯著降低(P<0.05)，SOD含量顯著升高(P<0.05)，實驗1組、實驗2組、實驗3組間LDH、MDA、SOD的含量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 LDH、MDA、SOD的含量

2.2 右美托咪定對高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡及miR-126表達(dá)的影響 與對照組比較，高糖損傷模型組miR-126的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，cl-caspase-3蛋白水平顯著升高(P<0.05)，pro-caspase-3蛋白水平顯著降低(P<0.05)；與高糖損傷模型組比較，實驗1組、實驗2組、實驗3組miR-126的表達(dá)水平升高(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，cl-caspase-3蛋白水平顯著降低(P<0.05)，pro-caspase-3蛋白水平顯著升高(P<0.05)，實驗1組、實驗2組、實驗3組間各指標(biāo)比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2、圖1。

表2 右美托咪定對高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的影響

圖1 右美托咪定對高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡及蛋白表達(dá)的影響

2.3 過表達(dá)miR-126對高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的影響 與miR-NC組比較，miR-126組LDH、MDA含量顯著降低(P<0.05)，SOD含量顯著升高(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，cl-caspase-3蛋白水平顯著降低(P<0.05)，pro-caspase-3蛋白水平顯著升高(P<0.05)，見圖2、表3。

圖2 miR-126對高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡及蛋白表達(dá)的影響

表3 miR-126對高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的影響

2.4 miR-126對右美托咪定作用的高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激、凋亡的影響 與實驗3+miR-NC組比較，實驗3+miR-126組LDH、MDA含量顯著降低(P<0.05)，SOD含量顯著升高(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，cl-caspase-3蛋白水平顯著降低(P<0.05)，pro-caspase-3蛋白水平顯著升高(P<0.05)；與實驗3+anti-miR-NC組比較，實驗3+anti-miR-126組LDH、MDA含量顯著升高(P<0.05)，SOD含量顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，cl-caspase-3蛋白水平顯著升高(P<0.05)，pro-caspase-3蛋白水平顯著降低(P<0.05)，見圖3、表4。

圖3 miR-126對右美托咪定作用的高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡及蛋白表達(dá)的影響

表4 miR-126對右美托咪定作用的高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激、凋亡的影響

3 討論

糖尿病患者體內(nèi)持續(xù)的高血糖水平可增加心血管疾病的發(fā)生風(fēng)險，高血糖可通過氧化應(yīng)激及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡從而對心肌組織造成損傷。既往研究[7-8]顯示miRNA在高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中表達(dá)異常并可能參與心肌細(xì)胞損傷過程。目前關(guān)于糖尿病性心血管疾病的治療藥物成為重點研究，因此本研究積極探尋新型治療藥物并分析其可能作用機(jī)制。

DEX可抑制LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)從而減輕心肌損傷[9]。有研究[10]表明DEX可通過抑制心肌細(xì)胞凋亡從而改善大鼠心肌缺血-再灌注損傷后的心室功能。另有相關(guān)報道[11]指出DEX可抑制抗鏈尿佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠心肌氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡。氧化應(yīng)激指標(biāo)主要包括LDH、MDA、SOD，心肌細(xì)胞氧化損傷時LDH含量增加，SOD屬于抗氧化酶類，并可通過協(xié)調(diào)氧化與抗氧化平衡從而保護(hù)心肌細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷，MDA屬于氧化酶類并可作為脂質(zhì)過氧化的標(biāo)志物，還可反應(yīng)細(xì)胞氧自由基損傷的嚴(yán)重程度[12-17]。本研究結(jié)果顯示高糖處理后心肌細(xì)胞中LDH、MDA含量顯著升高，SOD含量顯著降低，不同濃度的DEX處理后LDH、MDA含量顯著降低，SOD含量顯著升高，提示DEX可減輕高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化損傷，且呈劑量依賴效應(yīng)。

細(xì)胞接受凋亡信號時，caspase級聯(lián)反應(yīng)被激活后可促進(jìn)caspase-3活化形成cl-caspase-3，cl-caspase-3表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而pro-caspase-3表達(dá)上調(diào)可抑制細(xì)胞凋亡[8-19]。本研究結(jié)果顯示高糖處理后心肌細(xì)胞凋亡率顯著升高，cl-caspase-3表達(dá)上調(diào)，pro-caspase-3表達(dá)下調(diào)，而不同濃度的DEX處理后心肌細(xì)胞凋亡率顯著減低，cl-caspase-3表達(dá)下調(diào)，pro-caspase-3表達(dá)上調(diào)，提示DEX可能通過調(diào)控細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)從而抑制高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。

研究[20]表明miR-126可抑制急性心肌梗死大鼠心肌細(xì)胞凋亡。miR-126表達(dá)量降低與心肌缺血再灌注損傷發(fā)生密切相關(guān)[21]。本研究結(jié)果顯示高糖處理后心肌細(xì)胞中miR-126的表達(dá)下調(diào)，DEX處理后可明顯促進(jìn)miR-126的表達(dá)，且呈劑量依賴效應(yīng)，進(jìn)一步研究顯示miR-126過表達(dá)后LDH、MDA含量降低，SOD含量升高，細(xì)胞凋亡率降低，cl-caspase-3表達(dá)下調(diào)，pro-caspase-3表達(dá)上調(diào)，提示miR-126過表達(dá)可增強(qiáng)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞抗氧化能力并抑制心肌細(xì)胞凋亡。為探究DEX是否通過調(diào)控miR-126的表達(dá)從而影響高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激、凋亡。本研究分別將miR-126 mimics、anti-miR-126轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞，使用DEX與高糖共同處理，結(jié)果顯示miR-126過表達(dá)能增強(qiáng)DEX對高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激、凋亡的作用，抑制miR-126表達(dá)能減弱DEX對高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激、凋亡的作用，提示DEX可能通過上調(diào)miR-126表達(dá)從而抑制高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡。但本研究仍需通過體內(nèi)實驗驗證DEX對心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷及細(xì)胞凋亡的作用及分子機(jī)制。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，DEX可通過調(diào)控miR-126表達(dá)保護(hù)心肌細(xì)胞免受高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷，可為糖尿病性心血管疾病的治療提供了新方向。