程虎 陳婷婷 亞力·亞森 吳建江

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科，新疆 烏魯木齊830054)

七氟醚(sevoflurane，Sev)具有快速誘導(dǎo)麻醉，對(duì)肝、腎功能影響小及穩(wěn)定的血液動(dòng)力學(xué)等特點(diǎn)，在麻醉中廣泛使用；Sev后處理對(duì)心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用，其對(duì)糖尿病(diabetic mellitus，DM)患者心肌細(xì)胞的保護(hù)作用顯著減弱[1-2]。線粒體動(dòng)力相關(guān)蛋白1(dynamin-related protein 1，Drp1)被激活后募集在線粒體表面，并促進(jìn)線粒體分裂。研究[3]發(fā)現(xiàn)，抑制Drp1可以減輕DM小鼠心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷。磷脂酰肌醇激酶3(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)相關(guān)通路在I/R中發(fā)揮重要作用。研究[4]顯示促進(jìn)PI3K/AKT通路可以保護(hù)DM大鼠的心肌細(xì)胞。本文主要分析Drp1通過(guò)PI3K/AKT通路對(duì)DM大鼠Sev后處理心肌細(xì)胞凋亡的影響，并探究其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器 健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(12周，220～250 g，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，中國(guó))。鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)(Sigma公司，美國(guó))。Drp1 抑制劑 Mdivi-1 (Med Chem Expres公司，美國(guó))。生化試劑盒、酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒和TDT介導(dǎo)的dUTP-生物素缺口末端標(biāo)記(TUNEL)試劑盒(碧云天公司，中國(guó))。小動(dòng)物呼吸機(jī)(Inspira ASV，哈佛儀器公司，美國(guó))。BL-420F小動(dòng)物生物功能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司，中國(guó))。Mayer's蘇木精和0.5%曙紅水溶液(H8070，DH0050，北京Solarbio公司，中國(guó))。RIPA裂解緩沖液(中國(guó)，北京，Beyotime)、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)試劑盒(武漢博斯特生物技術(shù)有限公司，中國(guó))、抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司、聚偏氟乙烯(PVDF)膜(Bio-Rad公司，美國(guó))、顯微鏡(Olympus 公司，日本)。

1.2 大鼠分組、建模和干預(yù)方法 將60只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)(Sham)、I/R、I/R+DM、I/R+DM+Sev、I/R+DM+Sev+Mdivi-1、I/R+DM+Mdivi-1組6組。其中I/R+DM、I/R+DM+Sev、I/R+DM+Sev+Mdivi-1、I/R+DM+Mdivi-1組通過(guò)腹腔注射STZ(60 mg·kg-1，pH=4.5)建立糖尿病模型，Sham組僅接受等量檸檬酸鹽緩沖液(0.1 mol·L-1)腹腔注射。在STZ注射后第72 h后用生化試劑盒測(cè)量血糖，72 h時(shí)尾靜脈空腹血糖(FBG)水平高于16.7 mmol·L-1證明DM模型建立成功。I/R、I/R+DM、I/R+DM+Sev、I/R+DM+Sev+Mdivi-1、I/R+DM+Mdivi-1組在DM建模后(或注射檸檬酸鹽緩沖液)后進(jìn)行結(jié)扎建立心肌I/R模型[5]：①腹腔注射1%戊巴比妥(3 mL/kg)麻醉大鼠，通過(guò)心電圖四肢導(dǎo)聯(lián)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。在第三和第四肋間隙做切口并將大鼠插管連接呼吸機(jī)(潮氣量：3 mL/kg，呼吸頻率：60～70 次/min)。②打開(kāi)心包，然后使用6/0線結(jié)扎左前降支冠狀動(dòng)脈，此時(shí)心臟表面立即變?yōu)榘咨⑶倚碾妶DST段抬高。保持結(jié)扎15 min，然后取出絲線進(jìn)行再灌注，縫合胸腔。③手術(shù)后肌肉注射80萬(wàn)單位的青霉素預(yù)防感染。Sham組的大鼠在進(jìn)行相同的操作但不結(jié)扎。建模24 h后，I/R+DM+Sev+Mdivi-1、I/R+DM+Mdivi-1組在結(jié)扎15 min后腹膜內(nèi)注射Drp1 抑制劑 Mdivi-1共0.1 mL，總劑量為1.2 mg/kg，其余組注射等量的溶劑[6]。I/R+DM+Sev、I/R+DM+Sev+Mdivi-1組大鼠根據(jù)參考文獻(xiàn)[7]在建立在結(jié)扎15 min后吸入Sev，Sev濃度為1%。

1.3 觀察指標(biāo)和檢測(cè)方法

1.3.1 HE染色以及檢測(cè)心肌梗死面積 大鼠斷頭處死，取出心臟，沿結(jié)扎線分為兩半，以保留結(jié)扎線和心尖之間的區(qū)域。將組織用4%的多聚甲醛固定并用梯度醇脫水，然后包埋在石蠟中，切成厚度為4 μm的組織做成玻片標(biāo)本。用Mayer’s蘇木精在室溫下染色10 min，然后用0.5%曙紅水溶液室溫下染色3 min。根據(jù)HE染色結(jié)果，使用Image Pro Plus 6.0軟件計(jì)算心肌梗死面積。梗死面積 =(內(nèi)膜的弧長(zhǎng)+外膜的弧長(zhǎng))/(疤痕的內(nèi)周+疤痕的外周)×100%。

1.3.2 ELISA檢測(cè)cTnI和CK-MB水平 通過(guò)ELISA檢測(cè)心肌指標(biāo)肌鈣蛋白I(cTnI)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)，大鼠處死后采集血液樣本，離心(2000 rpm，20 min)收集上層血清。然后使用ELISA試劑盒檢測(cè)cTnI和CK-MB根據(jù)制造商說(shuō)明書(shū)加入抗體，然后通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的吸光度，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度。

1.3.3 TUNEL染色檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡 利用1.3.1中固定的大鼠心臟乳頭肌的石蠟切片進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，經(jīng)過(guò)常規(guī)脫蠟、抗原修復(fù)處理，并用密封液封閉并修復(fù)，然后加入50 μL 的TUNEL溶液在37 ℃下孵育1 h，洗滌后加入100 μL的二氨基聯(lián)苯胺在37 ℃下孵育30 min，在顯微鏡下觀察樣品。隨機(jī)選擇每個(gè)組織的四個(gè)視野進(jìn)行計(jì)算，并收集平均值。凋亡指數(shù)=凋亡核數(shù)/(凋亡核數(shù)+正常細(xì)胞核數(shù))×100%。

1.3.4 Western blot檢測(cè)PI3K、AKT蛋白水平 在梗塞區(qū)獲得心肌組織樣本，將組織勻漿、研磨獲得總蛋白，蛋白濃度通過(guò)BCA試劑盒測(cè)量。使用10%的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳(PAGE)(80～120 V，90 min)分離40μg的總蛋白。在100 mV的恒定電壓下與PVDF膜進(jìn)行濕轉(zhuǎn)移。在5%牛血清白蛋白中于室溫孵育1 h，然后將1∶500稀釋的anti-Drp1、anti-PI3K和anti-AKT添加到PVDF膜中，并在4 ℃下孵育過(guò)夜。洗滌后在室溫下添加二抗孵育1 h。然后加入化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯影。 GAPDH用作內(nèi)部參考。用Image J軟件分析目標(biāo)條帶的灰度值。

2 結(jié)果

2.1 抑制Drp1對(duì)DM大鼠I/R心肌梗死的影響 Sham組無(wú)心肌梗死，I/R+DM組梗死面積和心肌組織損傷程度顯著大于I/R組(P<0.05)，I/R+DM+Sev組和I/R+DM+Mdivi-1組梗死面積和心肌組織損傷程度顯著小于I/R+DM組(P<0.05)，I/R+DM+Sev+Mdivi-1組梗死面積和心肌組織損傷程度顯著小于I/R+DM+Sev組和I/R+DM+Mdivi-1組(P<0.05)，見(jiàn)表1和圖1。

表1 各組心肌梗死面積比較

圖1 HE染色檢測(cè)心肌損傷和梗死面積

2.2 抑制Drp1對(duì)DM大鼠I/R心肌損傷標(biāo)志因子的影響 I/R組cTnI和CK-MB水平顯著高于Sham組(P<0.05)，I/R+DM組cTnI和CK-MB水平顯著高于I/R組(P<0.05)，I/R+DM+Sev組和I/R+DM+Mdivi-1組的cTnI和CK-MB水平顯著低于I/R+DM組(P<0.05)，I/R+DM+Sev+Mdivi-1組的cTnI和CK-MB水平顯著低于I/R+DM+Sev組和I/R+DM+Mdivi-1組(P<0.05)，見(jiàn)表2。

2.3 抑制Drp1對(duì)DM大鼠I/R心肌細(xì)胞凋亡的影響 I/R組凋亡指數(shù)顯著高于Sham組(P<0.05)，I/R+DM組凋亡指數(shù)顯著高于I/R組(P<0.05)，I/R+DM+Sev組和I/R+DM+Mdivi-1組凋亡指數(shù)顯著低于I/R+DM組(P<0.05)，I/R+DM+Sev+Mdivi-1組凋亡指數(shù)顯著低于I/R+DM+Sev組和I/R+DM+Mdivi-1組(P<0.05)，見(jiàn)表3、圖2。

表2 各組cTnI和CK-MB水平比較

2.4 抑制Drp1對(duì)DM大鼠I/R心肌細(xì)胞中PI3K/AKT的影響 I/R組PI3K和AKT蛋白水平低于Sham組(P<0.05)，I/R+DM組PI3K和AKT蛋白水平低于I/R組(P<0.05)，I/R+DM+Sev組和I/R+DM+Mdivi-1組PI3K和AKT蛋白水平顯著高于I/R+DM組(P<0.05)，I/R+DM+Sev+Mdivi-1組PI3K和AKT蛋白水平顯著高于I/R+DM+Sev組和I/R+DM+Mdivi-1組(P<0.05)，見(jiàn)圖3和表4。

表3 各組凋亡指數(shù)比較

圖2 TUNEL染色檢測(cè)各組心肌細(xì)胞凋亡情況

圖3 TUNEL染色檢測(cè)抑制Drp1對(duì)DM大鼠I/R心肌細(xì)胞中PI3K/AKT的影響

表4 各組PI3K/AKT通路蛋白水平比較

3 討論

心臟在缺血時(shí)會(huì)損傷心肌細(xì)胞，在再灌注階段，心肌細(xì)胞會(huì)在血流恢復(fù)時(shí)再次受到損傷，此過(guò)程被稱為I/R損傷。揮發(fā)性麻醉藥Sev在再灌注開(kāi)始時(shí)給藥能改善缺血后的心臟功能并減少損傷，這被稱為麻醉后處理，Sev可以緩解心肌細(xì)胞的I/R損傷[8]。七氟醚等藥物進(jìn)行麻醉后處理是減輕心肌損傷的有效策略，但其確切機(jī)制尚未完全闡明。近年研究[9]發(fā)現(xiàn)，Sev對(duì)DM患者心肌I/R的保護(hù)作用有顯著的影響。

Drp1具有促進(jìn)線粒體裂變促進(jìn)活性氧物質(zhì)表達(dá)的作用[10]。在心肌I/R模型中，Drp1易位至線粒體，導(dǎo)致線粒體裂變和功能障礙，并且抑制線粒體裂變可減少I(mǎi)/R后的心肌損傷并改善心臟功能[11]。DM對(duì)線粒體動(dòng)力學(xué)有直接影響，高血糖情況下線粒體變短且變小，并由Drp1介導(dǎo)線粒體快速分裂，在DM小鼠的冠狀內(nèi)皮細(xì)胞或心肌細(xì)胞中觀察到與激活的Drp1相關(guān)的線粒體裂變?cè)黾覽12]。據(jù)此，我們推測(cè)Drp1可能是將DM與I/R損傷聯(lián)系起來(lái)的一種關(guān)鍵分子。本研究結(jié)果顯示DM會(huì)加劇大鼠I/R心肌損傷誘導(dǎo)凋亡，而Sev后處理和Drp1抑制劑Mdivi-1均可緩解I/R心肌損傷并抑制凋亡，并且Sev聯(lián)合Mdivi-1可進(jìn)一步的緩解I/R心肌損傷并抑制凋亡，抑制Drp1可以進(jìn)一步提高Sev后處理對(duì)DM大鼠I/R的保護(hù)作用。Zheng等[13]的研究顯示抑制Drp1可以緩解I/R引起的心肌損傷，而Sev也具有一定的抑制Drp1的功能抑制凋亡。體外研究[14]顯示抑制Drp1可以通過(guò)促進(jìn)線粒體形態(tài)恢復(fù)，促進(jìn)Sev對(duì)缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。這提示DM大鼠I/R心肌組織中Drp1的升高可阻礙Sev對(duì)心肌保護(hù)作用，抑制Drp1可促進(jìn)Sev對(duì)DM大鼠I/R心肌損傷的保護(hù)作用。

研究[15]顯示DM可導(dǎo)致PI3K/AKT通路受損，會(huì)阻礙后處理對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。而Drp1可通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/AKT通路改變細(xì)胞中葡萄糖代謝過(guò)程[16]。本研究結(jié)果顯示I/R 組的PI3K和AKT蛋白水平顯著低于Sham組，I/R+DM組的PI3K和AKT蛋白水平顯著低于I/R組，這與上述研究結(jié)果一致，提示PI3K/AKT通路受到抑制會(huì)加重DM大鼠的心肌I/R損傷。Drp1可以通過(guò)抑制AKT相關(guān)通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[17]。也有研究[18]顯示七氟醚可以通過(guò)促進(jìn)AKT通路緩解I/R損傷；Sev可以通過(guò)Drp1緩解抑制氧化應(yīng)激并調(diào)節(jié)自噬，緩解心臟I/R并保護(hù)心肌細(xì)胞[19]。I/R+DM+Sev組和I/R+DM+Mdivi-1組PI3K和AKT蛋白水平顯著高于I/R+DM組，并且I/R+DM+Sev+Mdivi-1組PI3K和AKT蛋白水平顯著高于I/R+DM+Sev組和I/R+DM+Mdivi-1組，提示Sev和抑制Drp1均可以通過(guò)促進(jìn)PI3K/AKT通路抑制心肌細(xì)胞凋亡，保護(hù)心肌I/R損傷。但是關(guān)于Sev、Drp1以及PI3K/AKT通路之間的作用機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

抑制Drp1可以通過(guò)促進(jìn)PI3K/AKT通路抑制DM大鼠心肌I/R模型的心肌細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)Sev對(duì)DM大鼠心肌I/R損傷的保護(hù)作用。