盧玉潤(rùn) 李英 胡濤 唐宇帆 何秋蓉

(1.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院老年內(nèi)科，四川 成都 610072；2.四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院·四川大學(xué)華西第四醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川 成都 610041)

缺血性心臟病是一種高發(fā)病率和高死亡率的臨床常見(jiàn)疾病，心肌供氧不足所導(dǎo)致的心肌損傷是缺血性心臟病發(fā)生的重要因素之一，降低心肌耗氧量和/或增加心肌供氧的抗缺血療法被證實(shí)是治療缺血性心臟病的重要策略[1-4]。因此，尋找和開(kāi)發(fā)有效的保護(hù)心肌細(xì)胞免受缺氧損傷藥物對(duì)缺血性心臟病的治療和預(yù)防具有重要意義。蒽醌類化合物大黃酚提取自中藥大黃，具有抗炎、抗氧化和抗癌的藥理作用[5-7]。研究[8-9]顯示，大黃酚對(duì)缺血再灌注損傷的小鼠腦組織和缺血缺氧刺激的海馬神經(jīng)元等具有保護(hù)作用。然而，大黃酚在缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中是否具有保護(hù)作用及其機(jī)制并不清楚。氯化鈷(CoCl2)是體外模擬心肌缺氧損傷常用的誘導(dǎo)劑[10-11]。本研究構(gòu)建CoCl2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞系H9c2缺氧損傷模型，旨在闡述大黃酚對(duì)缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料 大鼠心肌細(xì)胞系H9c2(上海美軒生物科技有限公司)，大黃酚(四川省維克奇生物科技有限公司，純度≥98%)。DMEM/F12培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)，MTT試劑和二甲基亞砜(美國(guó)Sigma公司)，LDH試劑盒(南京建成生物工程研究所)，Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)。兔抗鼠Bax、Bcl-2和GAPDH抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)，兔抗鼠Cleaved caspase-3抗體(英國(guó)Abcam公司)，HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體(北京中杉金橋生物公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 采用含10%胎牛血清和100 U/mL青鏈霉素雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基在37 ℃、濕度飽和的5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)H9c2細(xì)胞。待細(xì)胞貼壁80%左右時(shí)，以0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.3 缺氧細(xì)胞模型的構(gòu)建、分組與處理 參照文獻(xiàn)[1]以 1200 μmol/L CoCl2處理H9c2細(xì)胞24 h，構(gòu)建缺氧細(xì)胞模型。將長(zhǎng)勢(shì)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期H9c2細(xì)胞分為對(duì)照組(正常培養(yǎng))、缺氧組(建立缺氧細(xì)胞模型)及1、10和20 μmol/L大黃酚處理組(分別加入終濃度為1、10和20 μmol/L大黃酚預(yù)處理細(xì)胞后，再給予缺氧處理)。其中，大黃酚濃度的選取參照文獻(xiàn)[12]。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.4 LDH試劑盒檢測(cè)細(xì)胞上清液中LDH釋放量 取處理結(jié)束后的各組細(xì)胞上清液100 μL，參照LDH試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中LDH釋放量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 將處理結(jié)束后的各組細(xì)胞以每孔104個(gè)接種至6孔細(xì)胞板上，并將不含細(xì)胞的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，置于37 ℃、濕度飽和的5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)過(guò)夜。次日，棄培養(yǎng)液，加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)。孵育4 h后，棄上清液，再以150 μL二甲基亞楓震蕩反應(yīng)10 min。采用酶標(biāo)儀檢測(cè)各組細(xì)胞在490 nm處的OD值，并按照存活率=(實(shí)驗(yàn)組OD-空白組OD)/(對(duì)照組OD-空白組OD)×100%計(jì)算各組細(xì)胞存活率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 胰蛋白酶消化收集處理結(jié)束后的各組細(xì)胞，以預(yù)冷的磷酸緩沖液洗滌細(xì)胞后，參照Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟檢測(cè)各組細(xì)胞的存活率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 Western blot檢測(cè)Bcl-2、Bax和Cleaved caspase-3蛋白水平 胰酶消化收集各組細(xì)胞后加入細(xì)胞裂解液抽提細(xì)胞總蛋白，采用BCA法檢測(cè)總蛋白的濃度。將蛋白樣品與等體積的上樣緩沖液混勻后，置于沸水浴中煮沸5 min。采用12% SDS-PAGE凝膠將熱變性后的蛋白樣品以每孔60 μg電泳分離后，半干法轉(zhuǎn)膜。經(jīng)5%脫脂奶粉封膜2 h后，浸入Bcl-2(1∶500)、Bax(1∶1000)、Cleaved caspase-3(1∶1000)和GAPDH(1∶1000)一抗工作液中在4 ℃下孵育過(guò)夜。次日，再轉(zhuǎn)入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(1∶2000)工作液室溫孵育1 h。暗室內(nèi)顯影曝光后，以GAPDH為內(nèi)參，采用凝膠成像系統(tǒng)掃描分析各組細(xì)胞中Bcl-2、Bax和Cleaved caspase-3蛋白水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 大黃酚對(duì)缺氧心肌細(xì)胞上清液中LDH釋放量的影響 與對(duì)照組相比，缺氧組細(xì)胞上清液中LDH釋放量明顯增多(P<0.05)；與缺氧組相比，1 μmol/L 大黃酚組LDH釋放量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；但10、20 μmol/L大黃酚處理組中LDH釋放量較缺氧組或1 μmol/L 大黃酚組明顯減少(P<0.05)，且20 μmol/L大黃酚組LDH釋放量明顯低于10 μmol/L大黃酚組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組細(xì)胞上清液中LDH含量的比較

2.2 大黃酚對(duì)缺氧心肌細(xì)胞活力的影響 與對(duì)照組相比，缺氧組細(xì)胞存活率明顯降低(P<0.05)；與缺氧組相比，1 μmol/L大黃酚處理組細(xì)胞活力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但給予10、20μmol/L大黃酚處理后細(xì)胞活力較缺氧組或1μmol/L大黃酚處理組明顯升高(P<0.05)，且大黃酚濃度越高作用效果越顯著(P>0.05)，見(jiàn)表2。

2.3 大黃酚對(duì)缺氧心肌細(xì)胞凋亡的影響 與對(duì)照組相比，缺氧組細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)；與缺氧組相比，10、20 μmol/L大黃酚處理組細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05)，且有一定的濃度依賴性；但1 μmol/L大黃酚處理組細(xì)胞凋亡與缺氧組心肌細(xì)胞凋亡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖1和表2。

表2 各組細(xì)胞存活率和凋亡率的比較

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡

2.4 大黃酚對(duì)缺氧心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，缺氧組細(xì)胞中Bcl-2/Bax水平明顯降低，而Cleaved caspase-3蛋白水平明顯升高(P<0.05)；與缺氧組相比，1 μmol/L大黃酚組細(xì)胞中Bcl-2/Bax升高，Cleaved caspase-3蛋白水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但10、20 μmol/L大黃酚處理組細(xì)胞中Bcl-2/Bax明顯高于缺氧組或1 μmol/L大黃酚組，而Cleaved caspase-3蛋白水平明顯低于缺氧組或1μmol/L大黃酚組(P<0.05)。同時(shí)，20 μmol/L大黃酚處理組的作用效果明顯大于10 μmol/L大黃酚處理組(P>0.05)，見(jiàn)圖2和表3。

圖2 各組細(xì)胞中Bcl-2、Bax和Cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)

3 討論

心肌缺血損傷的分子機(jī)制十分復(fù)雜，涉及炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、能量代謝異常等，而這些最終會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡[13-15]。CoCl2是一種非常重要的低氧誘導(dǎo)因子，可通過(guò)促進(jìn)LDH釋放、降低細(xì)胞存活率和誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡等使心肌細(xì)胞發(fā)生缺氧損傷[16]。LDH是一種重要的糖酵解酶，其水平的升高常常被作為心肌細(xì)胞損傷的重要指標(biāo)[17]。

表3 各組細(xì)胞中Bcl-2/Bax和Cleaved caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較

大黃酚又名大黃根酸、1,8-二羥基-3-甲基-蒽醌，主要來(lái)自蓼科植物掌葉大黃的干燥根，對(duì)肝、腎和腦等多種組織損傷具有重要的保護(hù)作用[18-20]。現(xiàn)代藥理研究[21]表明，大黃酚具有廣泛的藥理作用，包括抗癌，抗氧化，神經(jīng)保護(hù)，抗菌和抗病毒以及調(diào)節(jié)血脂。在小鼠腦缺血/再灌注損傷的研究中發(fā)現(xiàn)，大黃酚可通過(guò)抗缺氧作用和抗凋亡作用發(fā)揮保護(hù)效應(yīng)[22]。有研究[12,23]指出大黃酚可通過(guò)減輕阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡、線粒體損傷和心臟功能障礙發(fā)揮心肌保護(hù)作用；還能夠改善異丙腎上腺素注射誘導(dǎo)的心肌肥大大鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能，進(jìn)而發(fā)揮心肌保護(hù)作用。然而大黃酚對(duì)缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的作用和機(jī)制尚不明確。本研究以CoCl2模擬心肌細(xì)胞缺氧損傷，發(fā)現(xiàn)大黃酚對(duì)缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷具有一定的保護(hù)作用。

Xue等[24]研究顯示大黃酚治療可顯著抑制糖尿病小鼠血清中LDH的活性，減輕糖尿病小鼠的心臟損傷。李俊杰等[9]報(bào)告指出，大黃酚可抑制缺血缺氧引起的大鼠海馬組織細(xì)胞凋亡，保護(hù)缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷。這與本研究結(jié)果相吻合，提示大黃酚可通過(guò)拮抗缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞存活率，進(jìn)而保護(hù)缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。但本研究?jī)H對(duì)大黃酚的心肌保護(hù)作用與機(jī)制進(jìn)行初步探索，將來(lái)有必要在分子水平上進(jìn)一步研究大黃酚的心肌損傷保護(hù)機(jī)制。

4 結(jié)論

大黃酚對(duì)缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制與拮抗缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)；這為改善缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷及缺血性心臟病的防治提供了新線索。