姚亞文，趙其平，朱順海，黃 兵，董 輝，黃文浩,2，劉 展，于 鈺，韓紅玉

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲(chóng)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200241; 2.上海師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海 200234)

雞球蟲(chóng)病是由艾美耳屬的幾種艾美耳球蟲(chóng)寄生雞腸道引起的一種危害嚴(yán)重的寄生蟲(chóng)病.臨床表現(xiàn)為感染的雞腹瀉、營(yíng)養(yǎng)吸收不良、飼料轉(zhuǎn)化低、腸道出血和死亡等，對(duì)全世界養(yǎng)雞業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1].目前控制球蟲(chóng)病的主要方法包括化學(xué)藥物防治和疫苗免疫預(yù)防.現(xiàn)有疫苗主要是由雞球蟲(chóng)活蟲(chóng)種(株)制備的強(qiáng)毒疫苗和弱毒疫苗，并在產(chǎn)蛋雞場(chǎng)和部分肉雞場(chǎng)中應(yīng)用，但活疫苗存在保存難、散毒及潛在的致病威脅等缺點(diǎn)，使其未能在雞場(chǎng)得到廣泛使用，因此，防治雞球蟲(chóng)病主要還是依靠藥物[2].目前，臨床常用的抗球蟲(chóng)藥物主要分為離子載體類(lèi)和化學(xué)合成類(lèi).離子載體類(lèi)藥物主要包括馬杜拉霉素、鹽霉素和莫能菌素等，化學(xué)合成藥物主要包括地克珠利、托曲珠利和氨丙啉等[3].由于藥物的長(zhǎng)期廣泛使用導(dǎo)致雞球蟲(chóng)對(duì)藥物產(chǎn)生嚴(yán)重的耐藥性[4].目前，幾乎從現(xiàn)場(chǎng)分離到對(duì)所有使用的抗球蟲(chóng)藥產(chǎn)生耐藥性的蟲(chóng)株，而且出現(xiàn)了多重或交叉耐藥性蟲(chóng)株，隨著耐藥性的產(chǎn)生，抗球蟲(chóng)藥的使用年限大為縮短，防治效果逐漸降低甚至失效[5].因此，研究了解雞球蟲(chóng)耐藥性的產(chǎn)生機(jī)制及建立耐藥性快速檢測(cè)方法，是急需解決的重要問(wèn)題.自發(fā)現(xiàn)雞球蟲(chóng)對(duì)抗球蟲(chóng)藥產(chǎn)生耐藥性以來(lái)，各國(guó)學(xué)者對(duì)雞球蟲(chóng)產(chǎn)生耐藥性的原因機(jī)制進(jìn)行了研究，但至今尚未弄清楚雞球蟲(chóng)耐藥性產(chǎn)生的分子機(jī)理，也未找到控制球蟲(chóng)產(chǎn)生耐藥性的靶基因，無(wú)法解釋雞球蟲(chóng)耐藥性產(chǎn)生的分子機(jī)制.

研究發(fā)現(xiàn)雞球蟲(chóng)耐藥性的發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜，可能與核苷酸堿基序列的突變、基因表達(dá)水平的變化以及表觀(guān)遺傳學(xué)如甲基化修飾等有關(guān)[6].在對(duì)其它頂復(fù)們?cè)x(chóng)和雞球蟲(chóng)耐藥性的研究發(fā)現(xiàn)，與敏感株相比，耐藥株的部分基因出現(xiàn)顯著的上調(diào)或下調(diào).如研究發(fā)現(xiàn)臨床分離的對(duì)銻耐受的杜氏利什曼原蟲(chóng)(Leishmaniadonovani)，其體內(nèi)表面抗原2基因的表達(dá)量升高[7].Thabet等采用LC-MS/MS相對(duì)蛋白組學(xué)定量方法對(duì)柔嫩艾美耳球蟲(chóng)(Eimeriatenella,Et)敏感株和田間分離的莫能霉素耐藥株進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)97個(gè)差異蛋白，其中25個(gè)蛋白在耐藥株表達(dá)上調(diào)[8].同樣，利用cDNA微陣列技術(shù)對(duì)柔嫩艾美耳球蟲(chóng)莫能霉素耐藥株和馬杜拉霉素耐藥株與敏感株進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)敏感株和耐藥株基因的轉(zhuǎn)錄存在差異[9].

為研究雞球蟲(chóng)耐藥性產(chǎn)生的分子機(jī)制，實(shí)驗(yàn)室前期采用藥物濃度遞增法從柔嫩艾美耳球蟲(chóng)敏感株誘導(dǎo)出柔嫩艾美耳球蟲(chóng)地克珠利耐藥株和柔嫩艾美耳球蟲(chóng)馬杜拉霉素耐藥株.之后對(duì)兩株耐藥株和敏感株進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，獲得耐藥株與敏感株的差異表達(dá)基因，其中柔嫩艾美耳球蟲(chóng)保守蛋白40(Conserved hypothetical protein, EtCHP40；基因號(hào)：ETH_00025040)在馬杜拉霉素耐藥株中轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)[10].本文對(duì)該保守蛋白基因進(jìn)行克隆，成功構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，并在大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白，通過(guò)熒光定量PCR和間接免疫熒光等實(shí)驗(yàn)，對(duì)該蛋白分子特性進(jìn)行初步分析，為進(jìn)一步研究其功能及與雞球蟲(chóng)耐藥產(chǎn)生的關(guān)系提供基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物和細(xì)胞

試驗(yàn)所用三黃雞購(gòu)自上海奉賢區(qū)某種雞場(chǎng)，新西蘭大白兔購(gòu)自上海嘉根生物公司.雞胚成纖維細(xì)胞系(DF-1)來(lái)源于東蘭辛系(EL-0)雞胚，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所動(dòng)物原蟲(chóng)病創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)球蟲(chóng)組傳代并保存.

1.2 蟲(chóng)株

試驗(yàn)所用雞球蟲(chóng)蟲(chóng)株均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所動(dòng)物原蟲(chóng)病創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)球蟲(chóng)組分離傳代并保存.分別為柔嫩艾美耳球蟲(chóng)藥物敏感株(DS)，柔嫩艾美耳球蟲(chóng)地克珠利耐藥株(DZR)，柔嫩艾美耳球蟲(chóng)馬杜拉霉素耐藥株(MRR)，柔嫩艾美耳球蟲(chóng)鹽霉素不同濃度耐藥株(15ppm，30ppm，45ppm，60ppm，SMR)，田間雞球蟲(chóng)混合株(A1)和單卵囊分離的田間柔嫩艾美耳球蟲(chóng)鹽霉素耐藥株(S2，S3，S4，S5)[11-12].

將1日齡三黃雞，在無(wú)球蟲(chóng)環(huán)境下飼養(yǎng)7天，檢查無(wú)球蟲(chóng)感染后，經(jīng)口服的方式接種柔嫩艾美耳球蟲(chóng)孢子化卵囊(5萬(wàn)/雞)，一周后收集盲腸，收集純化未孢子化卵囊(Unsporulated Oocysts, UO)和孢子化卵囊(Sporulated Oocysts, SO)[13-14].通過(guò)對(duì)純化的孢子化卵囊體外脫囊，消化，純化和回收子孢子(Sporozoites, SZ)[15].第二代裂殖子(second generation Merozoite, ME)在雞接種孢子化卵囊后112h從雞的盲腸粘膜中收集和純化[16].

1.3 試劑

RNA提取試劑TRIzol和M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司.DL2000 DNA Marker、PCR Master Mix、DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒均購(gòu)自于上海天根生物科技有限公司.pGEM?-T Easy載體購(gòu)于美國(guó)Promega公司.限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ、XhoⅠ、去除基因組DNA試劑盒和DNA純化試劑盒購(gòu)自于寶生物工程(大連)有限公司.弗式完全佐劑、弗氏不完全佐劑、抗熒光猝滅劑、抗α-Tubulin單克隆抗體和蛋白酶抑制劑均購(gòu)自于美國(guó)Sigma公司.胎牛血清、細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基(DMEM)、青霉素和鏈霉素、預(yù)染蛋白Marker和SuperSignalTMWest Pico Plus化學(xué)發(fā)光底物試劑盒購(gòu)自于美國(guó)Thermo Scientific公司.BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒和DAPI(4’,6’-diamidino-2-phenylindole)購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司.硝酸纖維素膜(PVDF)購(gòu)自于Milipore公司.HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG和HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG購(gòu)自于美國(guó)Proteintech公司.FITC標(biāo)記抗兔IgG購(gòu)自Jackson Immuno Research公司.

1.4 cDNA模板的制備和基因克隆

使用RNA提取試劑TRIzol從柔嫩艾美耳球蟲(chóng)敏感株孢子化卵囊提取總RNA，經(jīng)1%核酸凝膠電泳及紫外分光光度計(jì)檢測(cè)所提總RNA的濃度和純度，用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成單鏈cDNA第一鏈.實(shí)驗(yàn)所用器具均是無(wú)核酸酶器具，所有實(shí)驗(yàn)過(guò)程均在無(wú)核酸酶環(huán)境中進(jìn)行.

根據(jù)保守蛋白EtCHP40基因(基因號(hào)：ETH_00025040)的開(kāi)放閱讀框，利用Primer6.0設(shè)計(jì)特異性引物，上游引物為：5’-GCGGATCCATGCTGTGTCCGGTAGCGACAGG-3’(BamHⅠ)；下游引物為：5’-GCCTCGAGTCACAACTCCACTCCATCATTGCG-3’(XhoⅠ).以柔嫩艾美耳球蟲(chóng)敏感株孢子化卵囊cDNA第一鏈為模板，擴(kuò)增目的片段(預(yù)計(jì)長(zhǎng)度約為519bp).將得到的PCR產(chǎn)物膠回收后克隆到pGEM?-T Easy載體上，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coliTOP10感受態(tài)細(xì)胞中，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選.挑選白色菌落進(jìn)行菌液PCR鑒定后測(cè)序.

1.5 生物信息學(xué)分析

利用NCBI上的BLAST程序(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)對(duì)EtCHP40基因序列進(jìn)行比對(duì)和分析，利用ProtParam工具(http：//cn.expasy.org/tools/protparam.html)計(jì)算編碼該保守蛋白氨基酸組成、理論分子量、等電點(diǎn)等.利用TMHMM服務(wù)器(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)和SignalP4.0(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)分析EtCHP40基因編碼的蛋白是否存在跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽序列.采用Motifscan(http：//myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motifscan)分析EtCHP40氨基酸序列含有的功能結(jié)構(gòu)域.

1.6 重組蛋白的表達(dá)、純化和多克隆抗體的制備

提取測(cè)序正確的重組克隆質(zhì)粒pGEM-EtCHP40，將pGEM-EtCHP40和pET-28a空載體經(jīng)BamⅠ和XhoⅠ雙酶切后回收目的片段，4℃連接過(guò)夜，將連接成功的重組表達(dá)質(zhì)粒命名為pET-28a-EtCHP40.PCR和測(cè)序鑒定正確后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化于大腸桿菌E.coliBL21感受態(tài)細(xì)胞中，用1.0mmol/L異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，菌液超聲后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，瞬籃染色液染色，確定重組蛋白(rEtCHP40)是否表達(dá)，且表達(dá)形式為可溶表達(dá)或包涵體.對(duì)得到的包涵體重組蛋白進(jìn)行切膠分離純化，經(jīng)BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定濃度，-20℃保存?zhèn)溆?

將0.2mg純化的rEtCHP40用等量體積的弗氏完全佐劑乳化，之后將其皮下免疫體重約2.5kg新西蘭大白兔.2周后將等量的重組蛋白和弗氏不完全佐劑乳化，每隔一周注射免疫一次，共4次.最后一次免疫后7天，采集血液，分離血清并在-20℃保存.

1.7 Western blot

將純化后的重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，并將其轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，于5%(密度)脫脂牛奶中，4℃封閉過(guò)夜.經(jīng)0.05%(體積分?jǐn)?shù))PBS-Tween20緩沖液(PBST：1% PBS中加入1‰的Tween20)洗滌3次后，分別用抗HIS單抗(1∶5000稀釋)、兔陰性血清(1∶100稀釋)和兔抗子孢子血清(1∶100稀釋)作為一抗，37℃孵育2h，PBST洗3次，每次10min，最后一次洗滌后用1∶5000比例稀釋的HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG和HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG作為二抗，常溫下孵育45min，PBST洗滌3次后，用SuperSignalTMWest Pico Plus化學(xué)發(fā)光底物試劑盒檢測(cè)結(jié)果.

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

為了研究基因EtCHP40在柔嫩艾美耳球蟲(chóng)敏感株4個(gè)不同發(fā)育階段、柔嫩艾美耳球蟲(chóng)馬杜拉霉素耐藥株、柔嫩艾美耳球蟲(chóng)地克珠利耐藥株、柔嫩艾美耳球蟲(chóng)鹽霉素不同濃度耐藥株、田間雞球蟲(chóng)混合株(A1)和單卵囊分離的田間柔嫩艾美耳球蟲(chóng)鹽霉素耐藥株的mRNA轉(zhuǎn)錄水平，分別提取這些蟲(chóng)株的總RNA，利用去除基因組DNA試劑盒去除基因組DNA后，用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒將蟲(chóng)體總RNA反轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA，再利用DNA純化試劑盒純化cDNA作為模板.利用Primer6.0設(shè)計(jì)特異性引物，上游引物為5’-GCACTGGTGGAGGGAAACTA-3’，下游引物為：5’-GGAAGTCTCTGCACCCTCAG-3’.并用18S RNA作為內(nèi)參[22-23]，其上游引物為：5’-TGTAGTGGAGTCTTGGTGATTC-3’，下游引物為：5’-CCTGCTGCCTTCCTTAGATG-3’，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)技術(shù)，對(duì)EtCHP40在柔嫩艾美耳球蟲(chóng)敏感株4個(gè)不同階段，不同耐藥株和田間株的mRNA轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行分析.每個(gè)反應(yīng)進(jìn)行3次重復(fù)，用2-ΔΔCt的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)算相對(duì)mRNA的轉(zhuǎn)錄水平.

1.9 間接免疫熒光定位

將收集純化的子孢子和裂殖子重懸于1% PBS中，稀釋為6×104個(gè)/mL，將子孢子和裂殖子均勻鋪在細(xì)胞爬片上，置于6孔板中風(fēng)干.按每孔接種2.5×105個(gè)DF-1細(xì)胞將其均勻加入到細(xì)胞培養(yǎng)6孔板中，培養(yǎng)12h.按每孔7.5×105個(gè)新鮮的子孢子加入到含DF-1細(xì)胞的6孔板中，在37℃、5%CO2下繼續(xù)培養(yǎng).分別在子孢子入侵細(xì)胞后2、24、48和72h各取出一個(gè)細(xì)胞板，用4%細(xì)胞固定液固定0.5h，將固定液洗去后加入0.1% Triton X-100通透30min；用PBST洗滌5次，每次5min，用2%牛血清白蛋白(BSA)在37℃下封閉2h，PBST洗滌5次；加入稀釋在1% PBS中的兔抗rEtCHP40抗體(1∶100稀釋)，37℃孵育1h后洗去一抗，加入FITC標(biāo)記的抗兔IgG(1∶500稀釋)，37℃孵育1h，PBST洗滌5次；用10μg/mL DAPI室溫下避光染色30min，PBST洗滌5次；用抗熒光猝滅劑封閉，熒光顯微鏡(德國(guó)Zeiss，LSM880)下觀(guān)察結(jié)果.

2 結(jié) 果

2.1 EtCHP40基因的克隆和生物信息學(xué)分析

以柔嫩艾美耳球蟲(chóng)敏感株孢子化卵囊cDNA第一鏈為模板，對(duì)EtCHP40基因的ORF序列進(jìn)行擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳顯示得到與目標(biāo)序列大小(519bp)一致的PCR擴(kuò)增條帶.將目的條帶純化后連接到克隆載體pGEM-T Easy載體構(gòu)建重組克隆質(zhì)粒pGEM-T-EtCHP40，經(jīng)PCR鑒定后測(cè)序，BLAST分析結(jié)果顯示該序列與已知的柔嫩艾美耳球蟲(chóng)EtCHP40基因(GenBank：XM_013373672.1)序列100%同源.生物信息學(xué)分析顯示該基因序列編碼172個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量為18.8kDa，理論等電點(diǎn)為4.77.對(duì)預(yù)測(cè)的氨基酸序列分析表明，該基因編碼的蛋白無(wú)信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu).蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果(圖1)表明，EtCHP40含4個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)(位置為：45～48，74～77，94～97，121～124)；2個(gè)N-豆蔻?；稽c(diǎn)(位置為：102～107，125～130)；1個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)(位置為：94～96)；1個(gè)真核生物和病毒天冬氨酸蛋白酶活性位點(diǎn)(位置為：125～136)；1個(gè)逆轉(zhuǎn)錄病毒型家族天冬氨酸蛋白酶活位點(diǎn)(位置為：123～137).

圖1 EtCHP40基因cDNA核苷酸序列及其氨基酸序列的生物信息學(xué)分析

2.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與多克隆抗體的制備

將重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-EtCHP40轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coliBL21感受態(tài)細(xì)胞中，誘導(dǎo)重組蛋白His-EtCHP40(rEtCHP40)表達(dá)，SDS-PAGE電泳結(jié)果表明成功誘導(dǎo)了重組蛋白的表達(dá)，且該重組蛋白表達(dá)形式為包涵體，切膠純化后經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)表明，得到了比較純的、分子量約30kDa的融合蛋白(圖2(a)).Western blot分析發(fā)現(xiàn)：以稀釋后的抗His標(biāo)簽單抗和抗子孢子多克隆抗體作為一抗孵育重組蛋白，均可在約30kDa處檢測(cè)到目的條帶，但是重組蛋白rEtCHP40與兔陰性血清無(wú)反應(yīng)條帶，表明不與陰性兔IgG發(fā)生反應(yīng)(圖2(b)).說(shuō)明該重組蛋白rEtCHP40具有良好的反應(yīng)原性.

圖2 重組蛋白rEtCHP40的純化及反應(yīng)原性分析

2.3 EtCHP40基因在柔嫩艾美耳球蟲(chóng)敏感株4個(gè)不同發(fā)育階段的mRNA轉(zhuǎn)錄水平

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)在柔嫩艾美耳球蟲(chóng)敏感株4個(gè)不同發(fā)育階段(未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子和第二代裂殖子)的mRNA轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行分析，結(jié)果表明EtCHP40在柔嫩艾美耳球蟲(chóng)敏感株不同發(fā)育階段中的轉(zhuǎn)錄水平存在差異，且該基因在第二代裂殖子轉(zhuǎn)錄水平最高，未孢子化卵囊階段次之；孢子化卵囊和子孢子兩個(gè)階段都比較低(圖3).

圖3 EtCHP40基因在蟲(chóng)體不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄水平

2.4 EtCHP40基因在柔嫩艾美耳球蟲(chóng)敏感株和不同耐藥株的轉(zhuǎn)錄水平

對(duì)柔嫩艾美耳球蟲(chóng)敏感株與不同耐藥株中EtCHP40基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行分析，結(jié)果顯示與敏感株相比，該基因在3個(gè)耐藥株(MRR、DZR和SMR)中mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)，其中在馬杜拉霉素耐藥株轉(zhuǎn)錄最高，差異極顯著(P<0.001)(圖4(a))

通過(guò)比對(duì)敏感株與不同濃度鹽霉素耐藥株的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)隨著藥物濃度的升高，EtCHP40的mRNA轉(zhuǎn)錄水平不斷升高，60ppm的鹽霉素耐藥株與敏感株相比存在顯著差異(P<0.001)(圖4(b)).田間混合株A1與單卵囊分離的4株柔嫩艾美耳球蟲(chóng)鹽霉素耐藥株的EtCHP40基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平與敏感株相比，均存在顯著差異(P<0.05)(圖4(c)).

圖4 (a)EtCHP40基因在不同耐藥株的轉(zhuǎn)錄水平;(b)EtCHP40基因在不同濃度鹽霉素耐藥株的轉(zhuǎn)錄水平;(c)EtCHP40基因在田間株的轉(zhuǎn)錄水平

2.5 蛋白EtCHP40在蟲(chóng)體上的定位分析

使用兔抗rEtCHP40多克隆抗體作為一抗，對(duì)柔嫩艾美耳球蟲(chóng)敏感株子孢子、裂殖子和子孢子入侵DF-1細(xì)胞后蟲(chóng)體不同發(fā)育階段的EtCHP40蛋白進(jìn)行定位分析.熒光顯微鏡觀(guān)察EtCHP40蛋白在蟲(chóng)體上的分布.結(jié)果顯示該蛋白主要位于子孢子的表面和頂部(圖5(a))；當(dāng)子孢子入侵DF-1細(xì)胞前期EtCHP40仍位于蟲(chóng)體的表面與頂部(圖5(c))；當(dāng)蟲(chóng)體發(fā)育至滋養(yǎng)體時(shí)，該蛋白主要位于細(xì)胞質(zhì)中，且熒光強(qiáng)度增強(qiáng)(圖5(d))；當(dāng)蟲(chóng)體發(fā)育至未成熟裂殖體和成熟裂殖體時(shí)，該保守蛋白EtCHP40較均勻的分布于整個(gè)蟲(chóng)體(圖5(e、f))，熒光強(qiáng)度減弱；而當(dāng)蟲(chóng)體發(fā)育至第二代裂殖子時(shí)，蛋白EtCHP40均勻的分布在整個(gè)蟲(chóng)體(圖5(b)).

圖5 EtCHP40在蟲(chóng)體上的定位

3 討 論

實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)柔嫩艾美耳球蟲(chóng)敏感株、地克珠利耐藥株和馬杜拉霉素耐藥株進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，獲得了耐藥株與敏感株的差異表達(dá)基因，這些差異表達(dá)基因可能參與了柔嫩艾美耳球蟲(chóng)對(duì)抗球蟲(chóng)藥的耐藥過(guò)程，對(duì)耐藥株與敏感株差異表達(dá)基因的特性和功能進(jìn)行分析，有助于理解球蟲(chóng)耐藥性產(chǎn)生機(jī)制和建立球蟲(chóng)耐藥性快速檢測(cè)方法.

3.1 EtCHP40蛋白含有多個(gè)功能結(jié)構(gòu)域

本研究成功克隆了EtCHP40基因，序列分析顯示EtCHP40基因編碼的蛋白含有酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)、N-豆蔻?；稽c(diǎn)、蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)、真核生物和病毒天冬氨酸蛋白酶活性位點(diǎn)和逆轉(zhuǎn)錄病毒型家族天冬氨酸蛋白酶活位點(diǎn).酪蛋白激酶Ⅱ(CKⅡ)是一種高度保守的、在各種真核生物中都廣泛存在，并且具有多種生理功能的磷酸化絲氨酸/蘇氨酸的激酶.CKⅡ主要通過(guò)T細(xì)胞受體、細(xì)胞因子受體執(zhí)行信號(hào)傳導(dǎo)功能；受體酪氨酸激酶具有跨膜結(jié)構(gòu)，可與胞外配體結(jié)合，引起結(jié)構(gòu)改變并產(chǎn)生酶催化活性，又可選擇性的與底物結(jié)合使其磷酸化，受體酪氨酸激酶及其配體很多都與腫瘤相關(guān)[17-18].蛋白激酶C是鈣離子和磷脂酰絲氨酸依賴(lài)性蛋白激酶，未受刺激的細(xì)胞中以非活化的形式存在于胞漿，活化后可介導(dǎo)跨膜信號(hào)傳導(dǎo)和增強(qiáng)特殊基因的轉(zhuǎn)錄，擁有廣泛的作用底物，可參與細(xì)胞分泌、肌肉收縮、細(xì)胞增殖和分化等眾多生理過(guò)程[19].天冬氨酸蛋白酶是一類(lèi)在酸性pH下有活性的蛋白水解酶，廣泛分布于真核生物以及微生物中，所有哺乳動(dòng)物的天冬氨酸蛋白酶都是以酶原的形式合成，然后再被激活為有功能的活性形式，主要功能是降解蛋白、抗原和促進(jìn)其他酶的活化等[20].對(duì)免疫缺陷病毒蛋白酶(HIV PR，C34.2316)的研究發(fā)現(xiàn)，HIV PR的活性發(fā)生改變能夠造成HIV復(fù)制和感染其他細(xì)胞的能力發(fā)生紊亂，這使得HIV PR在藥物治療中已成為一個(gè)首選的藥物受體[21]，這提示EtCHP40基因可能是一個(gè)雞球蟲(chóng)藥物的受體.該蛋白這些磷酸化位點(diǎn)和糖基化位點(diǎn)的存在，提示著該保守蛋白在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)過(guò)了一系列的加工修飾，可能通過(guò)蛋白的磷酸化和去磷酸化，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用.

3.2 EtCHP40可能參與了蟲(chóng)體的生長(zhǎng)發(fā)育及逃避宿主的免疫反應(yīng)

對(duì)重組蛋白rEtCHP40進(jìn)行SDS-PAGE和反應(yīng)原性分析發(fā)現(xiàn)，原核表達(dá)獲取的重組蛋白rEtCHP40分子量比我們預(yù)期大，推測(cè)可能是由于His-tag中的堿性氨基酸的作用造成蛋白在SDS-PAGE中遷移變慢，而導(dǎo)致的偏差[22]，反應(yīng)原性的結(jié)果表明該重組蛋白可用于多克隆抗體的制備.

本研究通過(guò)qPCR的方法檢測(cè)了EtCHP40基因在柔嫩艾美耳球蟲(chóng)4個(gè)不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)EtCHP40基因在第二代裂殖子與未孢子化卵囊階段的轉(zhuǎn)錄水平較高，特別是第二代裂殖子階段遠(yuǎn)高于其他階段，而孢子化卵囊和子孢子階段轉(zhuǎn)錄水平較低.第二代裂殖子與未孢子化卵囊是在雞腸道內(nèi)發(fā)育的，此時(shí)的蟲(chóng)體需要從宿主細(xì)胞內(nèi)獲取更多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來(lái)發(fā)育繁殖，同時(shí)也需要逃避宿主的免疫反應(yīng)，本文推測(cè)不同發(fā)育階段表達(dá)量的差異可能是體內(nèi)與體外不同的環(huán)境引起的.有研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境的變化，如冷、熱、化學(xué)因素與營(yíng)養(yǎng)因素等都會(huì)導(dǎo)致蛋白表達(dá)的變化[23].因此，推測(cè)EtCHP40在裂殖子階段和未孢子化卵囊的高表達(dá)可能參與了蟲(chóng)體的生長(zhǎng)發(fā)育繁殖和逃避宿主的免疫反應(yīng)，并可能參與了能量的代謝.劉桂玲等對(duì)柔嫩艾美耳球蟲(chóng)表面抗原10的研究發(fā)現(xiàn)，它在裂殖子高表達(dá)與蟲(chóng)體的生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)[24].此外，陳婷等人在對(duì)柔嫩艾美耳球蟲(chóng)3-磷酸甘油醛脫氫酶的研究中也發(fā)現(xiàn)其在裂殖子階段的高表達(dá)會(huì)為其發(fā)育提供能量支持.

通過(guò)間接免疫熒光定位研究發(fā)現(xiàn)該保守蛋白主要位于子孢子的表面和頂部，這可能與蟲(chóng)體入侵宿主細(xì)胞有關(guān).研究報(bào)道柔嫩艾美耳球蟲(chóng)頂膜抗原1(AMA1)蛋白位于子孢子的表面和頂端，針對(duì)AMA1的抗體可有效抑制子孢子對(duì)宿主細(xì)胞的入侵[25].翟頎等對(duì)分布在子孢子頂端的柔嫩艾美耳球蟲(chóng)保守蛋白EtCHP39研究發(fā)現(xiàn)，其抗體在體外也能有效抑制子孢子入侵DF-1細(xì)胞[26].同樣，本文也進(jìn)行了抗體體外抑制實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用兔抗rEtCHP40預(yù)處理子孢子并不影響入侵DF-1細(xì)胞，因此推測(cè)該蛋白可能并不直接參與子孢子入侵宿主細(xì)胞，可能參與了蟲(chóng)體與宿主的相互作用以及蟲(chóng)體逃避宿主的免疫反應(yīng).

3.3 EtCHP40與柔嫩艾美耳球蟲(chóng)耐藥的關(guān)系

通過(guò)熒光定量PCR方法檢測(cè)了EtCHP40基因在柔嫩艾美耳球蟲(chóng)敏感株與不同耐藥株和田間株的mRNA轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)該基因在耐藥株中表達(dá)顯著上調(diào)，且與鹽霉素藥物濃度呈正相關(guān)，推測(cè)其表達(dá)水平的高低可能受到藥物濃度的影響.同樣，分析野生混合種耐藥株和單卵囊分離的鹽霉素耐藥株的EtCHP40基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)與敏感株相比，不管是混合種還是分離的柔嫩艾美耳球蟲(chóng)鹽霉素耐藥株，其表達(dá)水平都是顯著上升的，盡管與實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)的對(duì)鹽霉素完全耐藥的蟲(chóng)株相比存在一定的差異，這可能是因?yàn)樘镩g分離的耐藥株對(duì)藥物的敏感性不同，導(dǎo)致了其表達(dá)水平的不一致.已有研究發(fā)現(xiàn)，在耐藥的寄生蟲(chóng)體內(nèi)有些蛋白出現(xiàn)高表達(dá).如對(duì)杜氏利什曼原蟲(chóng)耐藥性的研究發(fā)現(xiàn)對(duì)葡萄糖酸銻耐受的杜氏利什曼原蟲(chóng)蟲(chóng)體中富含半胱氨酸的蛋白高表達(dá)[27].Doliwa等利用差異凝膠電泳分析弓形蟲(chóng)磺胺嘧啶耐藥株和敏感株的蛋白差異，發(fā)現(xiàn)耐藥株中蛋白磷酸酶的表達(dá)量顯著升高[28].

造成某一特定基因表達(dá)水平出現(xiàn)差異的原因有很多，可能是基因自身位點(diǎn)突變引起的，也有可能是其上游基因或其他相關(guān)基因發(fā)生突變或者自然選擇下發(fā)生連鎖效應(yīng)使其表達(dá)水平發(fā)生變化.如在對(duì)瘧原蟲(chóng)耐藥性的研究中發(fā)現(xiàn)惡性瘧原蟲(chóng)氯喹抗性基因(Pfcrt)中某些單核苷酸突變與氯喹耐藥相關(guān).對(duì)惡性瘧原蟲(chóng)中耐青蒿素的蟲(chóng)株分析發(fā)現(xiàn)pfkelch13基因某些位點(diǎn)的突變導(dǎo)致其構(gòu)象改變，使其下游基因磷脂酰肌醇-3激酶(PfPI3K)的表達(dá)量增加，導(dǎo)致PfPI3K效應(yīng)分子磷脂酰肌醇-3-磷酸(PI3P)的水平升高，從而誘導(dǎo)其對(duì)青蒿素產(chǎn)生耐藥性[29].EtCHP40基因在柔嫩艾美耳球蟲(chóng)耐藥株中表達(dá)上調(diào)是因其自身出現(xiàn)突變引起還是由于上游基因突變引起的還需要進(jìn)一步研究.