姚 佳，朱 婷，劉 浩，張 研，丁 剛，辛美麗，聶 明

(1.復旦大學 生命科學學院 生物多樣性與生態(tài)工程教育部重點實驗室，上海 200438；2.山東省海洋生物研究院，山東青島 266104)

人工魚礁(Artificial Reefs, ARs)作為經(jīng)過地點和材料篩選后在海洋中人為放置的堆積物[1-2]，主要以商業(yè)養(yǎng)殖和生境恢復為目的[3]，在近海生態(tài)系統(tǒng)養(yǎng)護和生物資源恢復上起著至關(guān)重要的作用[4-5].人工魚礁可以通過改善棲息地質(zhì)量而吸引魚類聚集、覓食和繁殖，增加經(jīng)濟魚類的生物量[6-8]；人工魚礁對底泥的硬化可以增加底棲生物群落的豐度和多樣性[9-10]，改變?nèi)斯~礁的營養(yǎng)通量，形成新的復雜的食物網(wǎng)[11-12].但目前對人工魚礁的研究多集中在漁業(yè)資源恢復，而對海洋生態(tài)系統(tǒng)重要的組成部分——微生物的研究卻屈指可數(shù).

微生物占據(jù)了海洋90%的活體生物量[13]，其不僅是海洋微型動物的食物來源和海洋保護動物健康的重要影響者，更是地球生物化學循環(huán)的驅(qū)動者[14].微生物定植在人工魚礁的表面，形成菌膠團吸引其他微生物附著與繁殖，這些微生物包括細菌、真菌、病毒與藻類，構(gòu)成了人工魚礁生物膜的基礎[15-16].在海洋生態(tài)系統(tǒng)中，生物膜至少有3個明確的作用：(1)是各種海洋無脊椎動物幼蟲定殖、接觸和變態(tài)的基底[17]；(2)是動植物繁殖體的主要附著位點[18]；(3)是初級生產(chǎn)的主要來源與食物網(wǎng)的基礎[19].生物膜可影響人工魚礁中動物群落多樣性，其微生物結(jié)構(gòu)的輕微變化，都可能引起生態(tài)系統(tǒng)以及海洋動物健康的強烈波動[20-21].因此，研究人工魚礁生物膜微生物的組成與動態(tài)變化是海洋動物保護的關(guān)鍵.

生物膜微生物具有代時短的特點，因此對環(huán)境變化響應極為敏感[22-23].由于近海人工魚礁區(qū)漁業(yè)活動頻繁，油污污染風險較大，人工魚礁生物膜上的微生物組的結(jié)構(gòu)與功能易受油污污染干擾.海水中石油油污是大多數(shù)生物的一個應激因素，會增加自由基、過氧化氫和單線態(tài)氧等活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)的產(chǎn)生[24]，造成蛋白質(zhì)和脂類的氧化和破壞，進而損傷細胞[25].研究表明，暴露在原油和分散劑(乳化后的油滴等)中可對微生物的群落組成和多樣性產(chǎn)生持續(xù)影響[26-28].

黃渤海作為中國4大漁場之一，是重要的漁業(yè)水域[29]，其作為我國北部沿海地區(qū)許多漁業(yè)物種的產(chǎn)卵和覓食地，為超過2億人口提供了漁業(yè)資源和環(huán)境.截至2015年，黃渤海區(qū)域人工魚礁海域面積達346.7km2，擁有136個人工魚礁國家級示范區(qū)，居全國首位.廟島群島位于黃渤海交匯處，是我國重要的海洋牧場示范區(qū)之一.為了認識不同魚礁材料間生物膜微生物組(包括病毒、古菌、細菌與真菌)的差異及其對油污污染的響應，本研究以中國山東廟島海洋牧場示范區(qū)為研究區(qū)，通過宏基因組和多樣性分析等技術(shù)手段，比較了附著在金屬框架和水泥上生物膜微生物組的多樣性與功能的差異，并探究了油污污染對微生物組的影響.

1 材料和方法

1.1 實驗設計及樣品采集

本研究于2018年9月，在廟島海洋牧場示范區(qū)投放以金屬框架為支撐、水泥為主體的小型人工魚礁(以下簡稱小礁)，進行微生物生物膜富集，并以特殊浮漂為標記，便于后期打撈.小礁材質(zhì)與示范區(qū)大型人工魚礁一致，并一起投入到20m深的水底(38.16°N,120.87°E).于2020年8月28日將小礁打撈上來.采樣前一天將輕微漏油的漁船停在小礁水體附近，模擬漁業(yè)活動給人工魚礁帶來的油污污染情景.考慮到微生物生物膜對油污的強敏感性，油污處理持續(xù)時間為24h.用無菌敷料鑷在小礁金屬架和水泥材質(zhì)上分別均勻刮取生物膜，置于60mm×15mm無菌無酶小培養(yǎng)皿內(nèi)，-20℃運至實驗室，并在48h內(nèi)完成DNA提取.本研究將各處理中的重復樣本均勻混合，以期通過較低的實驗復雜性得到較高質(zhì)量的實驗結(jié)果.本研究最終得到無油污污染金屬材質(zhì)的微生物生物膜(IR1)，無油污污染水泥材質(zhì)的微生物生物膜(CE1)，油污污染金屬材質(zhì)的微生物生物膜(IR2)和油污污染水泥材質(zhì)的微生物生物膜(CE2)4份樣本.研究區(qū)域及實驗設計見圖1.

圖1 研究區(qū)域及實驗設計示意圖

1.2 測序

將生物膜4℃解凍后，用DNeasy?PowerSoil?Pro Kit(QIAGEN, GERMANY)試劑盒提取生物膜DNA，DNA濃度使用Qubit?4.0 Fluorometer(ThermoFisher Scientific, USA)進行檢測.所有提取成功的DNA樣品保存在-20℃.

使用515F和806R[30]引物擴增樣品16S rRNA基因的V3～V4可變區(qū)，使用Tedersoo等人推薦的混合引物[31]擴增樣品的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2基因(Internal Transcribed Spacer 2, ITS2).引物兩端含有Illumina測序接頭和barcode序列.使用AxyPrepTMDNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences, USA)切膠純化PCR產(chǎn)物，使用IlluminaHiseq 2500平臺分別進行擴增子和宏基因組測序.

1.3 數(shù)據(jù)分析

對擴增子測序數(shù)據(jù)使用Trimmomatic V0.33進行質(zhì)量控制，得到Clean reads.在QIIME平臺，對Clean reads進行拼接和分庫.使用UCHIME V4.2對比RDP_gold數(shù)據(jù)庫，對數(shù)據(jù)進行嵌合體去除，97%相似度可操作分類單元(Operational Taxonomic Units, OTUs)劃分和分類信息獲取.計算微生物群落Beta多樣性(非加權(quán)平均聚類(Unweighted Pair-group Method with Arithmetic Mean, UPGMA)、NMDS分析、樣品聚類熱圖及樣品PCA、PCoA，使用binary jaccard指數(shù)進行計算).

對宏基因組測序數(shù)據(jù)使用Trimmomatic軟件進行質(zhì)量控制，bowtie2進行同宿主基因組序列比對，去除宿主污染，得到Clean reads.使用MEGAHIT[32]軟件對Clean reads進行拼接組裝，過濾短于300bp的contig序列，并用QUAST[33]軟件對組裝結(jié)果進行評估.采用MetaGeneMark[34]軟件預測編碼基因，并對編碼基因進行通用數(shù)據(jù)庫和專用數(shù)據(jù)庫的功能注釋(包括KEGG[35]、eggNOG[36]、Pfam[37]、SwissProt[38]、NR、GO[39]等通用數(shù)據(jù)庫注釋和CARD[40]、CAZy[41]等特殊數(shù)據(jù)庫注釋)，統(tǒng)計樣品物種組成和豐度信息.

2 結(jié) 果

2.1 不同材質(zhì)間生物膜微生物組群落組成的差異及其對油污污染的響應

宏基因組結(jié)果表明，在4種樣本中，細菌是主要的微生物組分，平均相對豐度占整個微生物組平均相對豐度的81.47%(圖2a)，兩種材質(zhì)間生物膜微生物組群落組成無明顯差異.油污污染提高了生物膜上細菌(0.2%)、病毒(194.0%)和古菌(96.9%)的相對豐度，但減少了生物膜上真菌(-11.8%)相對豐度，且油污污染下金屬材質(zhì)上病毒相對豐度上升幅度大于水泥材質(zhì).油污污染后，金屬材質(zhì)生物膜的病毒相對豐度高于水泥材質(zhì)生物膜，古菌相對豐度低于水泥材質(zhì)生物膜，而無油污污染下的微生物組成在兩種材質(zhì)間差異較小(圖2(a)).非加權(quán)平均法(UPGMA)分析結(jié)果進一步表明，樣品微生物組間的相似性主要受到油污污染的影響，且無油污污染處理的兩種材質(zhì)間微生物組的相似性高于油污污染，說明油污污染可以增加不同材質(zhì)之間微生物組的差異(圖2(b)).

圖2 人工魚礁生物膜微生物組群落結(jié)構(gòu)

擴增子分析結(jié)果表明，兩種材質(zhì)間生物膜的細菌群落結(jié)構(gòu)相近(圖3(a)).無油污污染樣本中的藍細菌門(Cyanobacteria)占絕對優(yōu)勢，其次是變形菌門(Proteobacteria)和放線菌門(Actinobacteria)，且金屬材質(zhì)藍細菌相對豐度高于水泥材質(zhì)，放線菌相對豐度低于水泥材質(zhì).油污污染后以Epsilonbacteraeota(無譯名)和變形菌門為主，其次是放線菌門，且金屬材質(zhì)上的變形菌門和放線菌門的相對豐度遠高于水泥材質(zhì)，Epsilonbacteraeota相對豐度低于水泥材質(zhì).可以看出，油污污染導致了Epsilonbacteraeota相對豐度的增加，降低了藍細菌和放線菌的相對豐度，且水泥材質(zhì)生物膜微生物組在油污的影響下變化幅度更大.UPGMA分析顯示(圖3(b))，樣品細菌群落間的聚類主要受到油污污染的影響.細菌群落在屬水平上的分析表明(圖3(c))，油污污染使生物膜中細硫卵菌(Sulfurovum)和嗜硫單胞菌(Sulfurimonas)的相對豐度明顯增加，金屬材質(zhì)生物膜中的Thiomicrormium(無譯名)明顯增加.

圖3 人工魚礁生物膜細菌群落多樣性

真菌群落的分析結(jié)果表明，子囊菌門(Ascomycota)在4種生物膜中都具有明顯優(yōu)勢，其次為擔子菌門(Basidiomycota)，且兩種材質(zhì)間生物膜真菌群落組成差異較小(圖4(a)).油污污染降低了生物膜中子囊菌門的相對豐度，但增加了生物膜中壺菌門(Chytridiomycota)的相對豐度，這些變化在水泥材質(zhì)上更為明顯(圖4(a)).UPGMA分析結(jié)果表明，無油污污染的金屬材質(zhì)和水泥材質(zhì)生物膜有著相似的真菌群落組成，但油污污染后金屬材質(zhì)生物膜與其他類型生物膜真菌群落產(chǎn)生差異(圖4(b)).真菌屬水平上的分析表明，油污污染增加了生物膜中曲霉(Aspergillus)的相對豐度，降低了青霉(Penicillium)和鏈格孢霉(Alternaria)的相對豐度(圖4(c)).

圖4 人工魚礁生物膜真菌群落多樣性

2.2 不同材質(zhì)間生物膜微生物組功能的差異及其對油污污染的響應

宏基因組功能分析結(jié)果表明，金屬材質(zhì)生物膜功能基因相對豐度高于水泥材質(zhì)生物膜(圖5，第78頁).油污污染顯著降低了兩種材質(zhì)生物膜功能基因的相對豐度(金屬材質(zhì)：-6.8%,P<0.05；水泥材質(zhì)：-20.8%,P<0.001，圖5).金屬材質(zhì)生物膜上絕大多數(shù)功能基因的相對豐度高于水泥材質(zhì)(78.6%，圖5).在油污污染影響下，大多數(shù)功能基因呈下降趨勢(78.6%)，且水泥材質(zhì)生物膜功能基因相對豐度的下降幅度均大于金屬材質(zhì).此外，油污污染增加了金屬材質(zhì)生物膜的氨基酸(圖5[E])和輔酶(圖5[H])轉(zhuǎn)運代謝基因以及兩種材質(zhì)上能量產(chǎn)生和轉(zhuǎn)換(圖5[C])基因的相對豐度.

圖5 人工魚礁生物膜微生物組功能分析

宏基因組抗生素抗性基因分析發(fā)現(xiàn)，水泥材質(zhì)上大部分抗生素抗性基因相對豐度高于金屬材質(zhì)(80.0%，圖6，第78頁).油污污染增加了絕大多數(shù)抗性基因的相對豐度(85.0%)，水泥材質(zhì)更為明顯.油污污染僅降低了兩種材質(zhì)上微生物組頭孢霉素(Cephalosporin)基因的相對豐度，以及水泥材質(zhì)上氨基苷類抗生素(Aminoglycoside)基因的相對豐度.

圖6 抗生素抗性基因相對豐度分析

碳水化合物酶基因分析表明，油污污染增加了糖基轉(zhuǎn)移酶(GT)和碳水化合物脂酶(CE)基因的相對豐度，從而促進了糖苷類抗生素的合成(圖7，第79頁)，但各種碳水化合物酶基因的相對豐度在兩種材質(zhì)中并沒有明顯差別.

圖7 碳水化合物酶分析

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，雖然金屬材質(zhì)和水泥材質(zhì)生物膜微生物組群落結(jié)構(gòu)差異較小，但金屬材質(zhì)生物膜上變形菌門(Proteobacteria)的相對豐度遠高于水泥材質(zhì)(圖3(a))，這可能與金屬材質(zhì)里的鐵富集了較多的ζ-變形菌(Zetaproteobacteria)有關(guān).這類微生物群最初發(fā)現(xiàn)于海洋高鐵棲息地，可以產(chǎn)生各種絲狀的微米級生物氧化物鐵，為細胞提供維持生長所需的Fe(Ⅱ)和O2的通量[42-43]，影響生物膜中磷的動態(tài)[44]，并可吸收微生物產(chǎn)生的酸性多糖生物高聚物或周圍環(huán)境中的有機碳以形成穩(wěn)定的有機結(jié)構(gòu)[45].因此，生物鐵氧化物可為生物膜上的其他微生物提供穩(wěn)定的生境，形成獨特的營養(yǎng)結(jié)構(gòu)，增加鐵、磷循環(huán)相關(guān)微生物的相對豐度，使金屬材質(zhì)生物膜相關(guān)元素循環(huán)速率高于水泥材質(zhì)生物膜.

UPGMA聚類表明，油污污染可改變生物膜的物種組成.油污污染提高了金屬材質(zhì)生物膜變形菌門(Proteobacteria)的相對豐度，這可能是由于石油中烷烴和硫化物的輸入刺激了變形菌門中不動桿菌屬(Acinetobacter)和硫降解相關(guān)細菌屬(Thiomicrormium，Sulfurovum和Sulfurimonas)相對豐度的增加(圖3(c)).這與之前Pugovkin等對巴倫支海油污污染區(qū)細菌群落的研究結(jié)果相一致[46].不動桿菌可以降解多種烷烴[47]，其中一些還可利用生物表面活性劑溶解和乳化烴類[48-49]，將它們轉(zhuǎn)化為簡單的化合物供其他微生物和藻類利用[50]，從而促進生物膜的初級生產(chǎn)力.

水泥材質(zhì)和金屬材質(zhì)生物膜微生物群落對油污污染的響應強度有所差別(圖2(b)).油污污染降低了水泥材質(zhì)生物膜上變形菌門的相對豐度，這可能與水泥材質(zhì)中Epsilonbacteraeota的大幅上升相關(guān).大部分非致病性的Epsilonbacteraeota都為無機化能自養(yǎng)營養(yǎng)型初級生產(chǎn)者，可通過氧化單質(zhì)硫和硫代硫酸鹽提供能量[51-52]，進而發(fā)揮重要的生產(chǎn)功能[53].油污污染向人工魚礁中輸入的硫化物為Epsilonbacteraeota提供了大量化能合成所需的底物，促進了其相對豐度的快速上升，從而降低了變形桿菌在生物膜中的數(shù)量優(yōu)勢.此外，水泥材質(zhì)疏松多孔的結(jié)構(gòu)較金屬材質(zhì)更易吸附油污供Epsilonbacteraeota利用.因此，油污污染刺激下Epsilonbacteraeota在水泥材質(zhì)上增長更為迅速，這可能增加水泥材質(zhì)上的初級生產(chǎn)和氮硫循環(huán)通量，并通過營養(yǎng)過程使次級生產(chǎn)產(chǎn)生波動.

油污污染降低了人工魚礁生物膜上功能基因的總體相對豐度，尤其使細胞合成相關(guān)的功能基因受到抑制，但增加了能量產(chǎn)生轉(zhuǎn)換和氨基酸轉(zhuǎn)運代謝等相關(guān)基因的相對豐度(圖5).為了盡量減少油污污染帶來的氧化應激和細胞損傷，微生物可產(chǎn)生一系列酶來激活保護和恢復機制[54]，調(diào)節(jié)自身的生理和代謝活動變化[55]，并改變脂肪酸的組成[56].油污污染使大部分抗生素抗性基因和部分碳水化合物酶基因的相對豐度大幅提升(圖6，圖7)，表明油污污染后微生物會將更多的功能用于抵抗外界的生物與非生物刺激帶來的威脅.此外，油污污染增加了糖基轉(zhuǎn)移酶(GT)和碳水化合物脂酶(CE)基因的相對豐度，此類基因可促進糖苷類抗生素的合成和微生物細胞壁的降解[53]，增強對需氧菌的抗性.因此，這些功能上的轉(zhuǎn)變可以在一定程度上提高人工魚礁生物膜微生物的抗逆性.

總之，金屬材質(zhì)和水泥材質(zhì)間的生物膜微生物組在群落組成和功能上差異較小.油污污染增加了人工魚礁兩種材質(zhì)生物膜細菌、古菌和病毒的相對豐度，降低了生物膜微生物組功能基因的豐度，且水泥材質(zhì)生物膜微生物組對油污污染的響應更為敏感.由于頻繁的人類(航運)活動會強烈影響海洋生物膜微生物組群落結(jié)構(gòu)，因此油污污染可能通過營養(yǎng)級聯(lián)效應對漁業(yè)資源和海洋動物的多樣性產(chǎn)生影響.