武延生,邢翠娟,李 敏,武麗娜,牛偉濤,張鵬飛,王僧虎

(1.邢臺學院生物科學與工程學院，河北 邢臺 054001；2.邢臺學院河北省邢棗仁利用技術創(chuàng)新中心，河北 邢臺 054001；3.邢臺學院邢臺市藥用植物工程技術研究中心，河北 邢臺 054001)

酸棗(Ziziphusjujubavar.spinosa)又名野棗、山棗、棘，鼠李科(Rhamnaceae)棗屬(Zizyphus)落葉灌木或小喬木，偶見高大喬木，在我國廣泛分布，在太行山區(qū)為常見物種，可生在荒坡、溝邊、路旁、沙礫、石縫中，在水分、營養(yǎng)物質(zhì)豐富的地方生長更盛。酸棗產(chǎn)業(yè)已成為邢臺地區(qū)山區(qū)縣市的主要產(chǎn)業(yè)，作為發(fā)展國民經(jīng)濟、改善生態(tài)環(huán)境、豐富人民生活的重要戰(zhàn)略措施在各級政府和不同組織機構(gòu)得以貫徹實施。目前對酸棗的開發(fā)利用是基于已有酸棗種質(zhì)資源開展的[1-3]，有關生理生化研究多是在全株或組織器官水平上進行[4-6]。在細胞水平、細胞器水平甚至分子水平上對酸棗加以改良或深入的生理、生化研究是酸棗產(chǎn)業(yè)發(fā)展和科學研究的必然要求和重要發(fā)展趨勢。原生質(zhì)體由于去除了細胞壁，質(zhì)膜暴露在外，易于攝取細胞器、病毒、細菌和核酸，可以進行顯微注射、細胞融合[7]，為細胞轉(zhuǎn)化、品種改良、雜交品系建立以及進一步探索細胞生命活動特性有非常重要的意義。相較于其它材料，由于種子下胚軸和幼根材料易得、分化程度低、易于誘導分化、細胞壁薄，成為制備原生質(zhì)體的理想材料，世界上第一個獲得的原生質(zhì)體就是以幼根材料制備的[8-9]。通過酸棗幼根原生質(zhì)體制備方法探索，為酸棗育種、基因工程的開展和細胞生理研究奠定基礎。

圖1 酸棗種子的處理和萌發(fā)過程

表1 不同酶解液成分對酸棗幼根原生質(zhì)體制備的影響

1 材料和方法

1.1 試驗材料、藥品

“邢州10號”酸棗種子，由河北邢州棗業(yè)有限公司提供。

纖維素酶R-10、纖維素酶RS、果膠酶均為Japan Yakult 公司產(chǎn)品，甘露醇為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 酸棗萌發(fā)幼根

選擇籽粒飽滿、無機械損傷的種子，在75%酒精中浸泡5 s進行表面消毒，用無菌水洗凈[10]，然后，置于底部鋪有4～6層紗布的培養(yǎng)皿中，每皿10～15粒種子，將紗布用無菌水打濕，種子上面覆蓋一層用無菌水濕潤的濾紙。在培養(yǎng)過程中，保持濾紙紗布濕潤但不被水淹沒。用鋁箔紙包裹，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中。

2 試驗結(jié)果與分析

2.1 酸棗幼根的預處理

將酸棗種子培養(yǎng)5～8 d，待幼根生長到1 cm左右時(圖1)，切取幼根根尖下部包括分生區(qū)的根段，用濾紙吸干表面水分，在載玻片上，用刀片切成長1 mm左右的切段，放入EP管中。刀片力求鋒利，避免在切割時擠碾壓破細胞。在EP管中事先加入1 mL含0.7 mol·L-1甘露醇、pH 5.5～6.0的緩沖液，于黑暗處靜置1 h進行質(zhì)壁分離預處理。

2.2 預試驗

將幼根切塊質(zhì)壁分離處理后，加入果膠酶、纖維素酶R-10、纖維素酶RS，制成不同濃度組合的酶解液(表1)，輕搖使之混勻，置于28 ℃恒溫水浴中，酶解期間每0.5 h在顯微鏡下觀察原生質(zhì)體狀況，直到原生質(zhì)體的數(shù)目不再增加，此時可認為酶解完成。試驗結(jié)果顯示，果膠酶濃度從0.5%增加到1%時，原生質(zhì)體產(chǎn)量明顯增多，但濃度增加到2%時，原生質(zhì)體產(chǎn)量沒有明顯增加，細胞碎片開始增加；纖維素酶R-10的濃度從1%增加到3%時，原生質(zhì)體產(chǎn)量不斷增加，濃度由3%增加到4%時，原生質(zhì)體產(chǎn)量沒有明顯增加；纖維素酶RS的濃度從1%增加到3%時，原生質(zhì)體產(chǎn)量不斷增加，濃度由3%增加到4%時，原生質(zhì)體產(chǎn)量沒有明顯增加(表1)。試驗結(jié)果表明，果膠酶的最適濃度為1%左右、纖維素酶R-10的最適濃度為4%左右、纖維素酶RS的最適濃度在3%左右。

2.3 正交試驗

根據(jù)預試驗結(jié)果，繼續(xù)采用三因素三水平的正交試驗法進行深入研究。三因素為果膠酶、纖維素酶R-10、纖維素酶RS。每個因素設三個水平，分別為果膠酶濃度分別為0.5%、1%、1.5%，纖維素酶R-10的濃度分別為3%、4%、5%，纖維素酶RS的濃度分別為1%、2%、3%。酶解完成時，將酶解液放入臺式低溫離心機，4 ℃、3 000 r·min-1離心5 min，棄去上清液，加入1 mL緩沖液，重復離心洗滌3次，置于顯微鏡下觀察原生質(zhì)體狀況。根據(jù)離心后原生質(zhì)體產(chǎn)量、所需酶解時間、細胞碎片數(shù)三個指標確定最適酶濃度組合，根據(jù)L9(34)正交試驗確定最適酶濃度組合為1%果膠酶、4%纖維素酶R-10、3%纖維素酶RS(表2)。

表2 不同濃度酶解液制備酸棗幼根原生質(zhì)體的正交試驗

注：箭頭所指為原生質(zhì)體。圖2 顯微鏡下酸棗幼根細胞原生質(zhì)體(10倍)

3 討 論

3.1 材料的選擇和預處理

植物幼根根尖包括根冠、分生區(qū)、伸長區(qū)、成熟區(qū)四個部分，分生區(qū)細胞分化程度低，細胞小而核相對大、質(zhì)濃，尤為重要的是細胞壁薄，主要成分為果膠質(zhì)和纖維素，不含木質(zhì)素。而根冠、伸長區(qū)、成熟區(qū)的細胞有一定程度的分化，小液泡融合，體積增大，細胞質(zhì)所占比例降低[11]。因此，從酶解的便利性和原生質(zhì)體的可實用性上來看，分生區(qū)細胞是最為理想的原生質(zhì)體制備材料。在本研究中，格外注意截取的幼根長度，不可過長，盡量少截取伸長區(qū)，避免截取到成熟區(qū)，而根冠部分由于與分生區(qū)部分難以分清，細胞數(shù)目不多，在試驗中未予重視。

大量研究表明，進行質(zhì)壁分離處理可擴大細胞壁內(nèi)表面積，從而增加水解酶的接觸面[12]，可切斷胞間連絲[13]，提高酶解效率[14-16]。在本研究中，在酶解處理前，對切碎的幼根進行了質(zhì)壁分離預處理，在其后的酶解處理中，對質(zhì)壁分離效果未做進一步研究。

3.2 水解酶濃度的確定

果膠酶可降解連接細胞壁的中膠層，使細胞從植物組織上游離出來；纖維素酶降解細胞壁而使原生質(zhì)體釋放。因此，一般采用纖維素酶和果膠酶的混合液來降解細胞壁制備原生質(zhì)體。在一定范圍內(nèi)，酶的作用效果隨濃度的增加而增加，當酶濃度超過一定范圍時，導致細胞碎片增多，酶解效果下降[16]，所以選擇合適的酶濃度對于原生質(zhì)體的制備很重要。本研究首先結(jié)合文獻報道[7,10,17]，通過預試驗初步確定酶最適濃度范圍，再用正交法高效、準確地確定酶的最適濃度。

在一定范圍內(nèi)，原生質(zhì)體分離的速度隨酶解液濃度的增加而增加，但當酶濃度過高時，會使細胞碎片增多而影響原生質(zhì)體的質(zhì)量(表1、表2)。預試驗中，當果膠酶濃度從0.5%增加到1%時，原生質(zhì)體產(chǎn)量明顯增多，但當濃度增加到2%時，原生質(zhì)體產(chǎn)量沒有明顯增加，細胞碎片開始增加(表1)。綜上，在28 ℃水浴條件下，在含0.7 M甘露醇、pH 5.5～6.0的緩沖液中質(zhì)壁分離預處理1 h，當加入水解酶的組合為1%果膠酶+4%纖維素酶R-10+3%纖維素酶RS時，制得的酸棗幼根原生質(zhì)體產(chǎn)量較高、細胞碎片較少、速度快，為制備酸棗幼根原生質(zhì)體較合適的條件。