李風波，孫曉雷，馬劍雄，馬信龍

（天津市天津醫(yī)院骨科，天津300211）

隨著社會老齡化進展，骨質(zhì)疏松已經(jīng)成為常見的老年疾病，人群數(shù)量逐漸上升［1］。正常人骨重塑靠破骨細胞發(fā)揮骨吸收功能，以及成骨細胞發(fā)揮骨形成，兩者之間相互平衡、相互制約［2］。骨質(zhì)疏松癥病人骨重塑過程中骨吸收大于骨形成，從而造成骨量丟失［3］。目前治療骨質(zhì)疏松的藥物多數(shù)有較大副作用［4］，因此，研究者越來越看重天然藥物的開發(fā)。國內(nèi)外研究報道柚皮苷藥理作用廣泛，能夠促進成骨細胞的分化、增殖［5～7］。但尚未有報道柚皮苷對破骨細胞凋亡及其機制的研究。因此，本研究探討了柚皮苷對破骨細胞凋亡的作用，進一步揭示該藥物的作用機制。

1 資料與方法

1.1 薄骨片的制備

牛股骨干粗切獲取皮質(zhì)骨，進一步采用鋸片沿股骨縱軸切成厚度約為100 μm骨片，對骨片采用細砂紙進行打磨平滑，裁剪骨薄片（大小約為0.5 cm×0.5 cm），75%酒精浸泡30 min消毒后，采用無菌D-hank's液清洗三遍，置于培養(yǎng)基中4℃?zhèn)溆?，取出晾干薄骨片表面液體后使用。

1.2 破骨細胞誘導

將由中國協(xié)和醫(yī)科大學基礎醫(yī)學細胞中心提供的RAW264.7細胞株，分別接種于6孔板中預置的無菌玻片或上述方法制備的薄骨片之上，接種密度2×104/cm2，2 h待細胞貼壁后，更換成高糖DMEM破骨細胞誘導培養(yǎng)基，內(nèi)含10% FBS和100 ng/ml RANKL，37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中進行誘導培養(yǎng)，2天換一次破骨細胞誘導培養(yǎng)液。

1.3 柚皮苷處理

配制含柚皮苷 0 μg/ml（空白對照）、2 μg/ml、20 μg/ml和200 μg/ml的DMEM培養(yǎng)液。于破骨細胞誘導培養(yǎng)5 d后，更換為上述不同柚皮苷含量的DMEM培養(yǎng)液，在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)3 d。兩天更換一次柚皮苷DMEM培養(yǎng)液。之后收集玻片、骨薄片和細胞進行以下檢測。

1.4 檢測指標與方法

1.4.1 TRAP染色

將培養(yǎng)板中的玻片取出，按照試劑盒操作方法對誘導后的破骨細胞進行TRAP特異性染色，染色完成后封固進行光鏡觀察。計數(shù)標準：（1）顯微鏡在100倍視野下，不重復情況下隨機選取10個視野計數(shù)；（2）成熟破骨細胞漿經(jīng)TRAP染色后為玫瑰紅或粉紅色，細胞核數(shù)目≥3個。

1.4.2 骨吸收陷窩

將培養(yǎng)板中的薄骨片取出，采用EDTA和胰蛋白酶將破骨細胞從骨薄片上消化，使破骨細胞從骨薄片上脫落，采用2.5%的戊二醛對骨薄片固定半小時，超聲清洗3次，每次5 min；之后采用不同濃度乙醇進行梯度脫水（乙醇濃度依次為30%、50%、60%、70%、80%、90%、100%），醋酸異戊酯置換乙醇后，對骨薄片進行CO2臨界點干燥，噴金后采用掃描電鏡觀察。每個骨薄片隨機選取10個不重復的區(qū)域，采用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件對骨吸收面積進行分析。

1.4.3 細胞凋亡檢測

將細胞消化收集，離心1 500 rpm/min，5 min。離心后培養(yǎng)液和PBS分別對細胞進行洗滌一次；計數(shù)后，以1×106/ml細胞密度重懸細胞于結合緩沖液。取100 μl細胞加入 2 μl Annexin V-FITC 和 10 μl碘化丙啶（propidium iodide,PI）。根據(jù)不同配置分成三組：（1）不加 Annexin VFITC也不加 PI；（2）加Annexin V-FITC不加 PI； （3）加 PI不加 Annexin V-FITC。混勻后室溫下黑暗中反應15 min，補加400 μl結合緩沖液，放入流式細胞儀中檢測凋亡結果。

1.4.4 熒光定量PCR檢測相關基因表達

細胞消化、收集，加入1 ml TRIzol溶液，振蕩混勻。采用相分離技術抽提取RNA，瓊脂糖電泳法檢測基因濃度及完整性。各組檢測基因反轉(zhuǎn)錄為cD?NA，以GAPDH為內(nèi)參基因，引物由廣州復能基因有限公司設計?；蛞镄蛄校篏APDH正向引物正向引物5'-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3'，反向引物5'-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3'，擴增片段為96 bp；BCL-2正向引物5'-ACGGGGT?GAACTGGGGGAGG-3'反向引物 5'-GCATGCT?GGGGCCGTACAGT-3'，BAX正向引物 5'-GATG?GACGGGTCCGGAGA-3'反向引物 5'-CTCAGCCC ATCTTCTTCCAG-3'Caspase-3：正向引物5'-TTCA?GA GGGGATCGTTGTAGAAGTC-3'，反向引物 5'-CAAGCTTGTCGGCATACTGTTTCAG-3'； MMP-9 正向引物5'-ACGACATAGACGGCATCCA-3'，反向引物5'-GCTGTG GTTCAGTTGTGGTG-3'；逆轉(zhuǎn)錄反應體系、PCR擴增體系以及反應條件按照試劑盒說明書設定。反應完成后進行擴增曲線和熔解曲線分析?；虮磉_量以檢測基因的初始模板量以2?△△Ct表示。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法，柚皮苷濃度與各檢測值行Pearson相關分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 TRAP染色

TRAP染色及陽性細胞計數(shù)見圖1。與空白對照組比較，2 μg/ml和 20 μg/ml柚皮苷組中 TRAP-陽性細胞數(shù)顯著減少 （P＜0.05），200 μg/ml柚皮苷組中TRAP-陽性細胞數(shù)非常顯著減少（P＜0.01）。柚皮苷劑量與TRAP染色陽性細胞數(shù)呈顯著負相關（r=-0.749，P=0.001）。

圖1 各組TRAP染色所見及陽性細胞計數(shù)結果 1a:空白對照組 1b:2 μg/ml柚皮苷組 1c:20 μg/ml柚皮苷組 1d:200 μg/ml柚皮苷組 1e:直方圖顯示TRAP陽性細胞計數(shù)結果，與空白對照組相比 *P＜0.05，**P＜0.001

2.2 骨吸收陷窩

骨吸收陷窩檢測見圖2，與空白對照組比較，2 μg/ml和20 μg/ml柚皮苷組中薄骨片上骨吸收面積顯著減少（P＜0.05），200 μg/ml柚皮苷組骨吸收面積顯著減少（P＜0.001）。柚皮苷劑量與骨吸收面積呈顯著負相關（r=-0.623，P=0.009）。

圖2 各組骨吸收隱窩檢測 2a:空白對照組 2b:2 μg/ml柚皮苷組 2c:20 μg/ml柚皮苷組 2d:200 μg/ml柚皮苷組 2e:直方圖顯示骨吸收隱窩面積檢測結果，與空白對照組相比 *P＜0.05，**P＜0.001

2.3 細胞凋亡

流式細胞儀細胞凋亡檢測結果見圖3。結果四個象限中Q1（左上）象限為PI單陽性，代表細胞膜破壞而核膜存在的細胞，一般指機械損傷細胞；Q2（右上）象限為PI，V-FITC雙陽性，代表中晚期凋亡細胞和壞死細胞；Q3（右下）象限為V-FITC單陽性，代表早期凋亡細胞；Q4（左下）象限為雙陰性，代表活細胞。與對照組比較，不同濃度柚皮苷中破骨細胞凋亡率均顯著升高（P＜0.05）。

圖3 各組破骨細胞凋亡 3a:p空白對照組 3b:2 μg/ml柚皮苷組 2c:20 μg/ml柚皮苷組 3d:200 μg/ml柚皮苷組 3e:直方圖顯示細胞凋亡檢測結果，與空白對照組相比，*P＜0.05

2.4 破骨細胞凋亡過程相關基因表達

基因檢測結果見表1，與空白對照組比較，2 μg/ml和20 μg/ml柚皮苷組破骨細胞表達BCL-2 mRNA顯著下降（P＜0.05），200 μg/ml柚皮苷組破骨細胞表達BCL-2 mRNA顯著下降（P＜0.001）。與空白對照組比較，柚皮苷各組BAX表達顯著均升高（P＜0.05）。與空白對照組比較，2 μg/ml和 20 μg/ml柚皮苷組中破骨細胞表達caspase-3 mRNA顯著升高（P＜0.05）；200 μg/ml柚皮苷組破骨細胞表達caspase-3 mRNA顯著升高（P＜0.001）。與空白對照組比較，20 μg/ml柚皮苷使破骨細胞表達mmp-9 mRNA顯著降低（P＜0.05），200 μg/ml柚皮苷組使破骨細胞表達mmp-9 mRNA顯著降低（P＜0.001）。

表1 不同柚皮苷破骨細胞凋亡相關基因mRNA表達檢測結果（±s）與比較

表1 不同柚皮苷破骨細胞凋亡相關基因mRNA表達檢測結果（±s）與比較

C a s p a s e-3 M M P-9 1.0 1±0.0 1 1.0 0±0.1 4 1.7 1±0.0 9 0.9 1±0.2 0 1.7 4±0.0 6 0.6 5±0.1 1 2.2 3±0.1 2 0.4 7±0.0 9 0.0 0 6 0.0 3 6

3 討 論

柚皮苷是一種單體物質(zhì)，已有的研究表明柚皮苷具有廣泛的生物學活性和藥理作用，廣泛存在于西柚皮、橘皮、骨碎補等水果中，該化合物具有抗炎、抗誘變、鎮(zhèn)痛和抗氧化等多種作用［8］。最近有研究表明單體成分柚皮苷有明顯的骨保護作用，可增加大鼠骨強度［9］。有報道柚皮苷可聯(lián)合BMP-2發(fā)揮促進小鼠成骨細胞MC3T3-E1增殖分化的作用［10］。Lai等報道殼聚糖包覆的柚皮苷可以增強成骨細胞的擴散、增殖，增強成骨細胞骨形成能力［11］。另外有研究報道柚皮苷可以通過上調(diào)miR-20a表達水平和下調(diào)PPARγ表達水平來促進的骨生成［12］。此外，研究表明柚皮苷可以通過GALNT2-ANGPTL3信號傳導通路，從而改善小鼠高脂血癥［13］。作者之前研究也證實，柚皮苷可以促進成骨細胞骨形成作用，改善骨質(zhì)疏松癥大鼠骨量，但柚皮苷抗骨質(zhì)疏松的機制，特別是柚皮苷對破骨細胞凋亡的影響尚不清楚。

破骨細胞是一種終末的多核巨細胞，在骨重建過程中有重要意義。在骨組織代謝過程中，破骨細胞發(fā)揮骨吸收能力，是調(diào)節(jié)骨重建、骨修復的始動因素［14］。老年骨質(zhì)疏松患者人群破骨細胞活性增強，強于成骨細胞，導致骨丟失大于骨形成，從而出現(xiàn)骨量降低，骨結構破壞［15］。因此，抑制破骨細胞骨吸收活性是治療骨質(zhì)疏松的關鍵因素。

本研究在體外培養(yǎng)破骨細胞，采用柚皮苷進行干預。研究證實柚皮苷可以明顯減少成熟破骨細胞數(shù)量，抑制作用與柚皮苷濃度呈正相關。抑制破骨細胞數(shù)量同時，柚皮苷能降低骨薄片上骨吸收面積，說明柚皮苷能降低破骨細胞骨吸收活性。流式細胞術檢測顯示柚皮苷可加速破骨細胞凋亡。

BCL-2及BAX是細胞凋亡過程的關鍵調(diào)節(jié)因子，其中BCL-2屬于抑制凋亡基因，能減少破骨細胞的凋亡；BAX的作用可使BCL-2喪失抑制細胞凋亡，從而能促進細胞的凋亡［16］。BCL-2和BAX的高低可以決定細胞內(nèi)線粒體膜電位水平；當細胞表達BCL-2水平下降，BAX表達增高時，可導致線粒體膜電位發(fā)生改變，從而進一步促進線粒體釋放細胞色素C進入細胞質(zhì)中，細胞色素C與Apaf-1結合，激活下游因子Caspase-9，三者共同組成激活因子，逐級激活下游的Caspase-6、Caspase-7、Caspase-3，產(chǎn)生級聯(lián)放大反應［17，18］。Caspase-3 位于細胞凋亡信號Caspase級聯(lián)反應下游，是最重要的效應型Caspase。Caspase-3是細胞內(nèi)各種凋亡信號通路傳遞的終點，是凋亡信號通路的最終執(zhí)行者，當激活Caspase-3后細胞開始進入不可逆凋亡狀態(tài)［19，20］。本實驗結果證實，柚皮苷促進破骨細胞凋亡的原理可能是通過抑制破骨細胞表達基因Bcl-2，促進破骨細胞表達基因BAX，從而使BCL-2/BAX比值降低，增加破骨細胞內(nèi)線粒體膜的通透性，線粒體釋放細胞色素C入胞質(zhì)，逐級激活凋亡信號通路，最終使Caspase-3活化，使破骨細胞進入不可逆轉(zhuǎn)的凋亡，從而降低了TRAP陽性細胞數(shù)量以及骨吸收能力，MMP-9是破骨細胞骨吸收過程中的重要酶類，可使骨Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原蛋白發(fā)生降解［21］。柚皮苷可降低破骨細胞MMP-9的表達，從而抑制破骨細胞對骨的吸收作用，并且其促進破骨細胞凋亡的效果可隨著劑量增加而作用增強。

綜上所述，本研究證實柚皮苷可以通過改變破骨細胞的凋亡基因表達情況，來促進破骨細胞凋亡的發(fā)生，并且效果與濃度成正相關。