李 建，江 攀，李大鵬，趙國陽

（江蘇大學附屬醫(yī)院，江蘇鎮(zhèn)江212000）

骨關節(jié)炎（osteoarthritis,OA）是一種以關節(jié)炎癥和關節(jié)軟骨進行性退變?yōu)樘卣鞯某Ｒ娐躁P節(jié)疾病，其主要表現(xiàn)為關節(jié)疼痛、僵硬、活動受限，嚴重者甚至出現(xiàn)關節(jié)畸形，嚴重影響患者生活質量［1，2］。其病理變化主要涉及細胞外基質的分解或分解與合成的失衡，以及炎癥細胞因子誘導軟骨細胞破壞和凋亡［3，4］。研究表明，OA中炎癥因子表達的變化與軟骨細胞凋亡之間存在密切聯(lián)系［5］。

眾多研究已證實，脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）是革蘭氏陰性菌細胞壁的一種化合物，其通過增強炎癥因子的表達，如 IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等，來引起機體的炎癥反應，而且在體內(nèi)和體外均可以發(fā)揮作用［6］。ATDC5作為小鼠源性軟骨細胞，已被廣泛用于軟骨細胞體外實驗模型中［7］。MicroRNA（miRNA）是一類具有高度保守性的內(nèi)源性非蛋白編碼的小分子RNA，大小約19-25nt，通過與靶基因的mRNA分子的3’端非編碼區(qū)結合，抑制靶基因翻譯的進程［8］。研究表明，miRNA在OA中有重要作用，可以通過不同的信號通路參與調(diào)節(jié)炎癥因子導致軟骨細胞基質降解的過程，而且miRNA能夠調(diào)控軟骨的代謝和修復過程［9］。

在OA的研究中，LPS處理后的ATDC5細胞作為細胞損傷模型已廣泛應用［10，11］。研究細胞損傷模型中miRNA的表達差異，可以推測其在OA中所起的作用，為進一步研究治療OA的新靶點提供方向。

1 資料與方法

1.1 實驗材料

小鼠源性ATDC5軟骨細胞系，胎牛血清、DMEM/F12培養(yǎng)基（美國BI公司），胰蛋白酶（美國Gibco公司），脂多糖（武漢塞維爾公司），總蛋白提取試劑盒（上?？党晒荆?，兔抗IL-1β抗體、兔抗IL-6抗體、兔抗IL-8抗體、兔抗TNF-α抗體（沈陽萬類公司），兔抗GAPDH抗體（美國CST公司），總RNA提取試劑盒（美國Merck Millipore公司），RNA逆轉錄試劑盒、SYBR熒光染料（美國BIO-RAD公司），細胞計數(shù)試劑盒-8（南京福麥斯公司）等。

1.2 細胞分組與實驗處理

由美國BI公司提供小鼠源性的ATDC5細胞，在完全培養(yǎng)基（MEM/F12+10%胎牛血清+100μg/ml鏈霉素+100μg/ml青霉素），25 cm2培養(yǎng)瓶中，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)生長期。

將培養(yǎng)瓶中的ATDC5細胞傳代接種于6孔板培養(yǎng)，分為LPS-0組、LPS-5組、LPS-10組、LPS-15組 4 組，分別加入含有 0 μg/ml、5 μg/ml、10 μg/ml、15μg/ml的LPS培養(yǎng)液，持續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.3 檢測指標與方法

1.3.1 CCK-8檢測

將LPS處理后的ATDC5細胞濃度調(diào)整到105/ml，接種于96孔板，每孔100 ml，設置空白組A0（培養(yǎng)基）、實驗組A1（細胞+不同濃度的LPS）、對照組A2（細胞+培養(yǎng)基），每組3個復孔，每孔中加入10μl CCK-8試劑，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h。在酶標儀上測定在450 nm波長處的吸光度。細胞增殖活力=［A1-A0］ /［A2-A0］。

1.3.2 RT-PCR檢測

將ATDC5細胞接種于6孔板中培養(yǎng)，按照分組處理24 h。用TRIzol試劑提取總RNA。按照逆轉錄試劑盒說明將RNA樣品逆轉錄為cDNA，SYBR Green PCR試劑聯(lián)合熒光定量PCR儀進行PCR擴增和檢測，反應條件為預熱階段95℃10 min，95℃變性10 s，56℃退火延伸30 s，共40個循環(huán)。分別檢測 IL-1β、IL-6、IL-8和 TNF-α的 mRNA表達水平，以及 miRNA-23、miRNA-145、miRNA-148、miRNA-183、miRNA-192的表達水平。

1.3.3 Western Blot檢測

將ATDC5細胞接種于6孔板中培養(yǎng)，如前分組處理24 h。用含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液于冰上裂解細胞，離心取上清，按照BCA試劑盒操作步驟定量蛋白，沸水浴煮5 min，12.5% SDS-PAG凝膠電泳分離蛋白，80 V電壓下進行電泳，待Marker分離后，電壓調(diào)整為100 V繼續(xù)電泳，蛋白電泳將至膠底部時停止。在350 mA下將蛋白轉移至PVDF膜上，轉膜90 min后5%脫脂牛奶封閉1h，分別用GAP?DH、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的一抗于 4℃下孵育過夜。TBST緩沖液洗膜4次，每次10～15 min，與二抗共孵1 h后，于曝光儀曝光。分別檢測IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的蛋白表達水平。

1.4 統(tǒng)計學方法

使用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。計量資料以均數(shù)±標準差表示，組間數(shù)據(jù)用獨立樣本t檢驗，多組間用單向方差分析；LPS劑量與檢測指標行Pearson相關分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 細胞增殖活力

分別用濃度為 0 μg/ml、5 μg/ml、10 μg/ml、15 μg/ml的LPS處理24 h后，用CCK-8試劑檢測AT?DC5細胞增殖活力，結果見圖1，LPS處理后細胞增殖活力明顯降低，不同LPS組間細胞增殖活力的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。LPS劑量與細胞增殖活力呈顯著負相關（r=-0.961，P=0.001），細胞增殖活力下降呈LPS劑量依賴性。

圖1 不同濃度的LPS處理后，ATDC5細胞增殖活力變化情況

2.2 炎性因子表達

LPS處理ATDC5細胞24 h后，RT-PCR檢測炎性因子的mRNA表達水平見表1，LPS處理后IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA表達水平均顯著增加，不同LPS組間IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA表達水平差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。LPS劑量與IL-1β的mRNA表達水平呈顯著正相關（r=0.789，P=0.002）；LPS劑量與 IL-6的mRNA表達水平呈顯著正相關（r=0.808，P=0.001）；LPS劑量與IL-8的mRNA表達水平呈顯著正相關（r=0.791，P=0.002）；LPS劑量與TNF-α的mRNA表達水平呈顯著正相關（r=0.785，P=0.002）。4種炎性因子mRNA表達水平的增加與呈LPS劑量依賴性。

表1 RT-PCR檢測四組細胞炎性因子mRNA表達結果（ng/L，±s）與比較

表1 RT-PCR檢測四組細胞炎性因子mRNA表達結果（ng/L，±s）與比較

指標I L-1 β I L-6 I L-8 T N F-α L P S-0組（n=3）1.0 1±0.0 2 1.0 1±0.0 2 1.0 0±0.0 2 0.9 9±0.0 4 L P S-5組（n=3）1.6 2±0.5 4 1.9 7±1.0 2 1.8 3±0.9 2 1.9 6±0.7 9 L P S-1 0組（n=3）3.2 4±1.4 3 5.1 7±1.8 9 4.5 6±1.7 5 3.9 6±1.6 9 L P S-1 5組（n=3）4.4 3±1.9 4 6.3 5±2.9 6 5.1 8±2.0 8 5.0 9±2.4 1 P值0.0 3 5 0.0 2 1 0.0 2 3 0.0 4 0

Western Blot檢測四組細胞炎性蛋白表達水平見表2，LPS處理后IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的蛋白表達水平均顯著增加，不同LPS組間IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的蛋白表達水平差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。LPS劑量與IL-1β的蛋白表達水平呈顯著正相關（r=0.807，P=0.002）；LPS劑量與IL-6的蛋白表達水平呈顯著正相關（r=0.795，P=0.002）；LPS劑量與IL-8的蛋白表達水平呈顯著正相關（r=0.796，P=0.002）；LPS劑量與TNF-α的蛋白表達水平呈顯著正相關（r=0.771，P=0.003）。4種炎性因子蛋白表達水平的增加與呈LPS劑量依賴性。

表2 Western Blot檢測四組細胞炎性因子蛋白表達結果（±s）與比較

表2 Western Blot檢測四組細胞炎性因子蛋白表達結果（±s）與比較

指標I L-1 β/G A P D H I L-6/G A P D H I L-8/G A P D H T N F-α/G A P D H L P S-0組0.2 4±0.0 5 0.1 2±0.0 5 0.1 5±0.0 8 0.1 3±0.0 3 L P S-5組0.4 8±0.1 3 0.2 5±0.1 3 0.2 6±0.1 3 0.2 3±0.1 3 L P S-1 0組0.6 4±0.2 2 0.3 8±0.1 2 0.5 8±0.2 9 0.5 0±0.2 5 L P S-1 5組1.0 1±0.4 1 0.6 9±0.3 1 0.8 7±0.3 8 0.7 2±0.3 5 P值0.0 2 7 0.0 2 5 0.0 3 0 0.0 4 6

2.3 miRNA表達

LPS處理ATDC5細胞24 h后，細胞中不同miR?NA的表達檢測結果見表3。LPS處理后ATDC5細胞中 miRNA-23、miRNA-145、miRNA-148、miRNA-183、miRNA-192表達明顯升高，與LPS劑量呈顯著正相關（P＜0.05）；而miRNA-191表達顯著下降，與LPS劑量呈顯著負相關（P＜0.05）。

表3 RT-PCR檢測四組細胞miRNA表達結果（ng/L，±s）與比較

表3 RT-PCR檢測四組細胞miRNA表達結果（ng/L，±s）與比較

指標m i R N A-2 3 m i R N A-1 4 5 m i R N A-1 4 8 m i R N A-1 8 3 m i R N A-1 9 1 m i R N A-1 9 2 L P S-0組（n=3）1.0 0±0.0 3 0.9 8±0.0 3 1.0 0±0.0 3 0.9 9±0.0 2 0.9 8±0.0 3 0.9 8±0.0 2 L P S-5組（n=3）4.8 0±2.8 1 2 2.6 6±1 4.2 1 1 1.3 2±7.0 8 1 5.5 1±9.6 1 0.8 0±0.1 2 9.4 5±5.4 6 L P S-1 0組（n=3）1 5.0 7±7.1 0 1 1 8.3 8±3 4.7 9 3 4.4 0±1 4.2 6 4 4.5 7±2 0.2 0 0.5 5±0.1 9 2 0.5 8±9.9 1 L P S-1 5組（n=3）2 2.3 0±1 1.9 6 1 8 4.3 6±9 0.2 8 4 6.7 0±2 2.4 0 5 7.9 1±2 7.1 0 0.4 3±0.1 5 3 5.3 2±1 4.0 3 P值0.0 2 6 0.0 4 0 0.0 1 5 0.0 2 0 0.0 1 6 0.0 2 7

3 討 論

OA是一種常見的關節(jié)退行性疾病，中老年人群發(fā)病率較高，嚴重影響身體健康和生活質量。研究表明，軟骨退變是OA的直接原因，軟骨細胞是軟骨中唯一的細胞成分，能夠維持細胞外基質的代謝穩(wěn)態(tài)，此外，軟骨細胞可以促進膠原蛋白、蛋白聚糖和其他細胞外基質成分的合成，從而調(diào)節(jié)關節(jié)軟骨的正常生理功能［12］。目前OA的發(fā)病機制仍不清楚，但已明確軟骨細胞的炎癥反應和凋亡在OA的發(fā)生發(fā)展過程中起著非常重要的作用。在OA早期，軟骨變性會引起炎癥反應。炎性因子的過量釋放可能進一步破壞軟骨細胞，使關節(jié)軟骨的膠原蛋白、蛋白聚糖和其他細胞外基質分解，從而加速軟骨的退化［13，14］。所以在OA的晚期，炎癥反應引起了軟骨的退化。研究發(fā)現(xiàn)miRNA在許多疾病中發(fā)揮重要作用，包括癌癥和炎癥疾?。?5］。已證實眾多miRNA參與了OA發(fā)生發(fā)展過程，其中大多是通過NF-κB和p38MAPK信號通路發(fā)揮作用［16］。例如對miRNA-192的研究表明，這種miRNA能夠通過NF-κB信號通路促進炎癥反應進而促進OA的進展［17］。本實驗研究通過LPS誘導ATDC5細胞建立體外細胞炎性損傷模型，檢測miRNA表達變化，為miRNA在OA中可能起到的作用提供更多有利證據(jù)，探索可能存在治療OA的新靶點。

本次實驗中ATDC5屬于小鼠源性軟骨細胞，且完全在體外進行，不能等同于人的軟骨細胞研究，導致實驗數(shù)據(jù)可能會存在不足之處。但實驗發(fā)現(xiàn)幾種miRNA表達變化非常明顯，可能與炎性損傷有密切關系，有利于進一步深入研究miRNA在炎性損傷中的作用及機制，為miRNA在OA中可能起到的作用提供更多有利的數(shù)據(jù)支持。