侯莎，吳昌正，童星*

(1.佛山市海天調(diào)味食品股份有限公司，廣東 佛山 528000；2.廣東海天創(chuàng)新技術(shù)有限公司，廣東 佛山 528000)

米曲霉(Aspergillusoryzae)是半知菌亞門絲孢綱絲孢目從梗孢科曲霉屬中的一個(gè)常見種，在自然界中分布廣泛，主要分布于糧食、發(fā)酵食品、腐敗有機(jī)物和土壤中。米曲霉具有強(qiáng)大的蛋白分泌能力，能夠分泌蛋白酶、淀粉酶、糖化酶、纖維素酶、植酸酶和果膠酶等，被廣泛應(yīng)用在醬油、豆豉、黃豆醬等多種發(fā)酵調(diào)味品的生產(chǎn)中。同時(shí)也是多種食品用酶制劑的生產(chǎn)菌株。經(jīng)過多年實(shí)踐檢驗(yàn)，其安全性被國內(nèi)外普遍承認(rèn)，更被美國FDA認(rèn)定為公認(rèn)安全的菌株(generally recognized as safe， GRAS)。

米曲霉等絲狀真菌在環(huán)境中分布十分廣泛，與人類的生活息息相關(guān)，在醫(yī)療實(shí)踐、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及基礎(chǔ)生物學(xué)研究等方面扮演著十分重要的角色。絲狀真菌具有豐富的次級代謝網(wǎng)絡(luò)，其產(chǎn)物在醫(yī)藥領(lǐng)域具有相當(dāng)?shù)奶骄績r(jià)值，包括有重要應(yīng)用價(jià)值的抗生素、抗癌物質(zhì)、降血脂藥物、免疫抑制劑等[1]。米曲霉基因組相比同屬的大30%左右，擁有更為活躍的代謝網(wǎng)絡(luò)。次級代謝是一個(gè)復(fù)雜的、多層次的調(diào)控過程，不僅受途徑特異性轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，也受到全局性調(diào)控因子的控制，又與環(huán)境因子的影響密切相關(guān)。研究米曲霉次級代謝途徑，破譯其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，對于高效獲得具有應(yīng)用價(jià)值的次級代謝產(chǎn)物，指導(dǎo)米曲霉的工業(yè)應(yīng)用具有重大意義。

1 米曲霉的次級代謝產(chǎn)物

2005年，第一株米曲霉基因組由26家日本科研單位合作破譯，基因組大小為37 Mb，共有8條染色體，注釋12074個(gè)基因[2]。其大小相比同屬的構(gòu)巢曲霉和煙曲霉分別大29%和34%，在水解酶分泌、氨基酸代謝和糖類轉(zhuǎn)運(yùn)方面具有更為豐富的基因和通路，這為米曲霉產(chǎn)生豐富的次級代謝產(chǎn)物提供了基因基礎(chǔ)[3]。

米曲霉的次級代謝產(chǎn)物中不乏具有生理、藥理作用的活性成分，這些產(chǎn)物在米曲霉的進(jìn)化及與其他生物和環(huán)境的相互作用密不可分。例如在化妝品中廣泛使用，具有美白抗氧化作用的曲酸[4]，不僅是多種美白產(chǎn)品的主要功能成分，還是頭孢類抗生素的原料，具有抑制酪氨酸氧化酶、多酚氧化酶、黃嘌呤氧化酶的作用。1990年Fefferle W P等從來源于土壤的一株米曲霉中分離獲得Asperfuran物質(zhì)，研究發(fā)現(xiàn)其具有抗真菌活性[5]。Oryzachlorin于1969年從米曲霉中被分離，能夠強(qiáng)烈地抑制酵母菌的生長，但對細(xì)菌和絲狀真菌卻沒有抑制作用[6]。Aspergillomarasmine B，1965年Haenni等從米曲霉中分離出能夠影響植物原生質(zhì)體的滲透壓，在后來的研究中也發(fā)現(xiàn)該物質(zhì)對于血管緊張轉(zhuǎn)換酶和內(nèi)皮素轉(zhuǎn)換酶具有抑制作用[7]。聶麗娟從米曲霉的菌絲體及培養(yǎng)液中分離鑒定出12種化合物，其中1個(gè)全新化合物，并發(fā)現(xiàn)其中4種對神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用和增殖影響，1種化合物對氧化損傷的SH-SY5Y細(xì)胞具有保護(hù)作用，3種化合物對金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌和大腸桿菌具有抑菌活性，并且發(fā)現(xiàn)菌絲體提取物對于金黃色葡萄球菌具有顯著的抑制作用[8]。被發(fā)現(xiàn)和報(bào)道的化合物只是米曲霉次級代謝產(chǎn)物的一小部分，更多活性分子仍有待發(fā)掘、驗(yàn)證和開發(fā)應(yīng)用。

2 米曲霉的次級代謝途徑的轉(zhuǎn)錄調(diào)控

絲狀真菌次級代謝產(chǎn)物的合成與調(diào)控是復(fù)雜的過程，涉及多步酶促反應(yīng)，一般合成基因聚集成簇[9]，受到途徑特異性調(diào)控因子和全局性調(diào)控因子的雙重調(diào)控，又有表觀遺傳在其中發(fā)揮關(guān)鍵作用，同時(shí)也與溫度、濕度、營養(yǎng)條件等環(huán)境因子密切相關(guān)。米曲霉具備典型的次級代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，在轉(zhuǎn)錄過程、表觀遺傳以及環(huán)境因子等不同水平上均有多種蛋白質(zhì)參與，形成復(fù)雜的多重調(diào)控系統(tǒng)。

2.1 途徑特異性調(diào)控因子

途徑特異性調(diào)控因子是次級代謝途徑功能基因表達(dá)的最直接調(diào)控方式，50%次級代謝途徑含有途徑特異性調(diào)控因子，一般位于基因簇內(nèi)部。途徑特異性調(diào)控因子具有典型的轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)組成，包含DNA結(jié)合域和轉(zhuǎn)錄激活域。絲狀真菌的途徑特異性轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合域包含一個(gè)典型Zn(II)2-Cys6模體，能夠識別存在于功能基因的啟動(dòng)子區(qū)域中的一段特異性回文序列[10]，因此途徑特異性調(diào)控因子能夠結(jié)合在功能基因的啟動(dòng)子區(qū)域，并由轉(zhuǎn)錄激活域招募通用轉(zhuǎn)錄因子完成轉(zhuǎn)錄激活。一般認(rèn)為途徑特異性轉(zhuǎn)錄因子只能調(diào)控所在基因簇的表達(dá)，但是近來研究也發(fā)現(xiàn)有的還能調(diào)控其他途徑甚至多個(gè)途徑，使得不同途徑之間存在相互作用，次級代謝調(diào)控在最基礎(chǔ)的調(diào)控中也存在交叉與互作，其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜程度可見一斑[11]。

除了有活性分子外，絲狀真菌的一部分次級代謝產(chǎn)物存在一定的生物風(fēng)險(xiǎn)，比如黃曲霉毒素(aflatoxin， AF)，主要由黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生。值得一提的是，米曲霉雖然在種屬上與黃曲霉接近，但是卻從沒有檢測到黃曲霉毒素的產(chǎn)生[12]，這是由于米曲霉的黃曲霉毒素基因簇中存在著大片段缺失和多處突變所導(dǎo)致的[13]。其中途徑特異性調(diào)控因子aflR就存在多處突變，在有些米曲霉中aflR并不表達(dá)，有些能檢測到微弱表達(dá)[14]，但項(xiàng)目組通過RNAseq分析并用RT-PCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)大部分AF功能基因并未獲得表達(dá)(數(shù)據(jù)未公開發(fā)表)，這為米曲霉的安全性又增添了新的證據(jù)。

2.2 全局性調(diào)控因子

除了途徑特異性調(diào)控因子，米曲霉次級代謝途徑的轉(zhuǎn)錄調(diào)控還受到全局性調(diào)控因子的正向或負(fù)向調(diào)控，例如pH調(diào)控因子PacC、CreA，氮源調(diào)控因子AreA等。近年來研究最為廣泛的是受光照負(fù)調(diào)控的Velvet復(fù)合物，由LaeA、VeA、VelB 3個(gè)蛋白組成，對多種次級代謝途徑具有正向調(diào)控作用。主要蛋白LaeA是Bok等于2004年在構(gòu)巢曲霉中發(fā)現(xiàn)的，啟動(dòng)子和開放閱讀框中含有3個(gè)aflR結(jié)合序列和能夠參與組蛋白甲基化的S-腺苷甲硫氨酸結(jié)合序列[15]。LaeA不僅是組成Velvet三聚體主要的蛋白，能夠控制曲霉有性生殖和無性生殖的轉(zhuǎn)換，也是調(diào)控VeA、VelB及相關(guān)因子表達(dá)的關(guān)鍵因子。關(guān)于LaeA的作用機(jī)理，目前并沒有定論，可能的途徑有3種：一是通過組蛋白甲基化調(diào)控下游基因的表達(dá)；二是通過與途徑特異性調(diào)控因子的反饋調(diào)節(jié)作用控制次級代謝途徑功能基因的表達(dá)；三是通過G蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控次級代謝與形態(tài)分化[16]。

此外，與分生孢子梗發(fā)育相關(guān)的C2H2轉(zhuǎn)錄因子BrlA也被證明具有次級代謝調(diào)控的功能，尤其是與孢子產(chǎn)生相關(guān)的代謝調(diào)控。BrlA缺失突變與無性孢子產(chǎn)生異常密切相關(guān)[17]。

Arakaug等于2019年通過米曲霉突變庫鑒定出一個(gè)Zn(II)2-Cys6型轉(zhuǎn)錄因子KpeA，具有全局性調(diào)控的功能，參與孢子發(fā)生和次級代謝調(diào)控。KpeA的缺失突變降低了無性孢子發(fā)生的核心調(diào)控因子BrlA的表達(dá)，在固體培養(yǎng)基上表現(xiàn)出氣生菌絲更長、分生孢子減少的表型。此外，相比對照菌株，KpeA突變株的曲酸含量提升了6倍，原因是在KpeA突變株中曲酸合成的途徑特異性調(diào)控因子KojR的表達(dá)得到了顯著提升。在LaeA缺失突變株中并沒有發(fā)現(xiàn)KpeA表達(dá)量的變化，證明KpeA的調(diào)控作用并不是通過LaeA途徑實(shí)現(xiàn)的[18]，也印證了KpeA全局性調(diào)控因子的身份。全局性調(diào)控因子是米曲霉次級代謝網(wǎng)絡(luò)響應(yīng)外界刺激的紐帶，提升了細(xì)胞在不同環(huán)境中的適應(yīng)性。

2.3 表觀遺傳調(diào)控

途徑特異性調(diào)控因子通過直接招募通用轉(zhuǎn)錄元件來啟動(dòng)次級代謝基因的表達(dá)，全局性調(diào)控因子通過途徑特異性調(diào)控因子來影響功能基因的激活，而表觀遺傳調(diào)控則是通過染色體的結(jié)構(gòu)變化來間接影響轉(zhuǎn)錄因子或者功能基因的表達(dá)，調(diào)控方式包括DNA甲基化、組蛋白乙酰化、甲基化和泛素化等，其中通過組蛋白修飾實(shí)現(xiàn)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)重塑的研究最為廣泛。Kawauchi等鑒定出米曲霉中與酵母hst4同源的HstD基因，發(fā)現(xiàn)當(dāng)HstD缺失時(shí)，米曲霉的生長受到影響，但是曲酸的合成量卻增加了近200倍，青霉素的產(chǎn)量也有顯著提升。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，HstD基因缺失的菌株中LaeA蛋白表達(dá)量上升，隨即引起下游代謝通路基因的高表達(dá)，最終導(dǎo)致代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的提升[19]。

除了組蛋白乙?；?，甲基化也是影響基因表達(dá)的關(guān)鍵修飾。Shinohara等在米曲霉中發(fā)現(xiàn)了與構(gòu)巢曲霉cclA同源的基因和與釀酒酵母sppA同源的基因。CclA是組蛋白H3K4甲基化轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的組成部分，而SppA是與H3K4甲基化轉(zhuǎn)移酶相關(guān)的另一復(fù)合物的重要組成部分。這兩個(gè)基因的缺失影響了組蛋白H3K4的三甲基化，導(dǎo)致染色體狀態(tài)發(fā)生變化，影響相關(guān)區(qū)域基因的表達(dá)，最終導(dǎo)致次級代謝產(chǎn)物astellolide F產(chǎn)量的提升[20]。表觀遺傳調(diào)控在次級代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中是比全局性因子更上游的調(diào)控方式。

2.4 環(huán)境因子的調(diào)控

米曲霉中次級代謝途徑基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控和表觀遺傳調(diào)控均是響應(yīng)環(huán)境刺激的結(jié)果，因此環(huán)境刺激對于次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生十分重要。碳源、氮源、溫度、濕度、光照等這些環(huán)境因子均能引起米曲霉次級代謝的變化，而這種變化也是通過細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來實(shí)現(xiàn)。例如，pH的影響通過調(diào)控因子PacC、CreA來介導(dǎo)，氮源的影響通過AreA來介導(dǎo)，高溫和光照能夠抑制Velvet復(fù)合物的活性，從而導(dǎo)致下游通路的表達(dá)減弱等。

環(huán)境因子的調(diào)控涉及的次級代謝通路更為廣泛，往往一種因子的變化通過細(xì)胞內(nèi)信號通路的逐級放大，對多個(gè)代謝途徑產(chǎn)生影響。PARK等利用GC-TOF/MS與GC-MS聯(lián)用的方法檢測在合成培養(yǎng)基中不同溫度、不同pH、不同時(shí)間培養(yǎng)米曲霉所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)46種初級代謝產(chǎn)物、76種次級代謝產(chǎn)物發(fā)生變化。存在變化的次級代謝產(chǎn)物包括支鏈脂質(zhì)揮發(fā)性成分、苯系物等。直鏈揮發(fā)性脂質(zhì)成分在高溫下顯著降低，而在低pH條件下呋喃類化合物的產(chǎn)生則顯著提升，這體現(xiàn)出不同的次級代謝途徑對不同環(huán)境因子的響應(yīng)程度和方式并不相同[21]。

3 次級代謝產(chǎn)物的提升

活性次級代謝產(chǎn)物在原始菌株中的產(chǎn)生量往往并不豐富，加之復(fù)雜的提取工藝帶來的損失，導(dǎo)致活性成分的綜合得率很低，難以進(jìn)行推廣應(yīng)用。因此通過菌種選育、環(huán)境因子代謝調(diào)控和基因工程改造實(shí)現(xiàn)活性成分含量的提升，是米曲霉活性化合物走向應(yīng)用的重要一環(huán)。

3.1 菌種選育

在工業(yè)應(yīng)用中，目標(biāo)分子產(chǎn)量的提升主要依賴傳統(tǒng)誘變的方法，誘變方法包括化學(xué)誘變、紫外誘變、微波誘變、N+離子注入誘變及常壓室溫等離子體誘變(ARTP)等方式。誘變的育種方式更容易被消費(fèi)者所接受，對于研究并不深入的代謝通路，能夠快速獲得產(chǎn)量提升的菌株，同時(shí)也能產(chǎn)生豐富的突變?yōu)榇x通路的調(diào)控研究提供了資源。但誘變產(chǎn)生的基因變化具有隨機(jī)性，如何從大量的突變株中篩選出目標(biāo)產(chǎn)物提升的菌株是整個(gè)過程的關(guān)鍵，也是限制誘變育種效率提升的重要瓶頸。

對于米曲霉來說，如何篩選優(yōu)質(zhì)菌株的問題更為突出，除了目標(biāo)性狀篩選方法建立較難之外，通量化篩選更是面臨諸多瓶頸。米曲霉是絲狀真菌，液體培養(yǎng)時(shí)形成菌絲球，并不是分散的單細(xì)胞，難以通過在釀酒酵母或細(xì)菌中廣泛應(yīng)用的微流控系統(tǒng)配合流式分選的方式進(jìn)行通量篩選；固體培養(yǎng)狀態(tài)下也因菌絲蔓延導(dǎo)致交叉污染而難以實(shí)現(xiàn)通量化。舒冬梅等通過半固態(tài)培養(yǎng)基實(shí)現(xiàn)15株米曲霉的復(fù)篩是米曲霉通量篩選的首次公開報(bào)道，但是其篩選通量仍有待提高[22]。Feng等通過96孔板液體培養(yǎng)，獲得曲酸含量提升近3倍的米曲霉菌株[23]，但液態(tài)培養(yǎng)均一性及與工業(yè)應(yīng)用場景的匹配性仍需進(jìn)一步研究。因此，米曲霉的高通量篩選方法目前尚未形成穩(wěn)定的技術(shù)，仍需科研工作者針對米曲霉的生長和應(yīng)用特性進(jìn)行深入研究，建立匹配工業(yè)應(yīng)用場景的穩(wěn)定方法。

3.2 環(huán)境因子代謝調(diào)控

以全局性調(diào)控因子及表觀遺傳調(diào)控為分子基礎(chǔ)，次級代謝途徑能夠響應(yīng)多種環(huán)境因子的刺激，包括活性氧、碳源、氮源、溫度、濕度、光照、pH值等。因此，通過控制培養(yǎng)條件能夠最大程度激活功能基因的表達(dá)，引導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)和能量向目標(biāo)代謝通路轉(zhuǎn)移，獲得目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量的提升[24]。環(huán)境因子的調(diào)控往往與代謝組學(xué)研究相結(jié)合，通過代謝組學(xué)方法發(fā)現(xiàn)與特定產(chǎn)物密切相關(guān)的環(huán)境因子，然后通過最陡爬坡法、響應(yīng)面法對各個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，獲得最佳的培養(yǎng)條件。

3.3 基因工程手段菌種改造

隨著測序技術(shù)及生物信息學(xué)分析技術(shù)的進(jìn)步和人們對大數(shù)據(jù)處理能力的不斷增強(qiáng)，米曲霉功能基因組的研究迅速發(fā)展，加之CRISPR基因編輯系統(tǒng)的逐步完善，米曲霉的遺傳操作技術(shù)越發(fā)成熟，為利用基因工程和代謝工程來提高米曲霉次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量提供了基礎(chǔ)。Tamano等在阻斷曲酸合成途徑的米曲霉中引入由kojA啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)的多酚合成酶，實(shí)現(xiàn)多酚的持續(xù)產(chǎn)出[25]。Shinohara等發(fā)現(xiàn)當(dāng)染色質(zhì)重塑因子cclA和sppA突變時(shí)，次級代謝產(chǎn)物astellolide F產(chǎn)量顯著提升。基因工程改造具有明顯靶向性，往往能夠在最短時(shí)間獲得較好的產(chǎn)量提升效果，但是往往依賴于遺傳操作系統(tǒng)的成熟度和代謝通路的前期研究基礎(chǔ)[26]。同時(shí)，基因工程育種需要關(guān)注菌株的生長狀況及與生產(chǎn)工藝的匹配性等問題，此外，在食品領(lǐng)域的應(yīng)用仍受到一定限制。

4 結(jié)語與展望

在絲狀真菌的次級代謝研究中，米曲霉的研究基礎(chǔ)相對薄弱，原創(chuàng)性突破較少，深入而系統(tǒng)的研究更少，而且日、韓兩國的研究廣度和深度均超過我國。主要原因有兩點(diǎn)：一是米曲霉的遺傳操作并不十分成熟，調(diào)控機(jī)理的體內(nèi)驗(yàn)證耗時(shí)費(fèi)力；二是我國學(xué)術(shù)研究與工業(yè)應(yīng)用之間的銜接并不順暢，研究成果與工業(yè)需求并不匹配或者在工廠中難以復(fù)制和推廣，導(dǎo)致學(xué)者失去深入研究的動(dòng)力。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展和我國科技制度的改革，這些問題有望被逐漸克服，我國的米曲霉次級代謝研究也將會越來越系統(tǒng)和深入。

米曲霉次級代謝的多層次調(diào)控，其核心在于功能基因的表達(dá)調(diào)控，細(xì)胞外環(huán)境因子和細(xì)胞內(nèi)基因的變化都將通過染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄因子的變化，最終匯集到功能基因表達(dá)的調(diào)控上，形成環(huán)境刺激、表觀遺傳變化、全局性調(diào)控因子響應(yīng)、途徑特異性調(diào)控因子作用、功能基因表達(dá)的多層次調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。代謝組學(xué)在其中也發(fā)揮著重要作用，相比初級代謝，次級代謝對于胞內(nèi)物質(zhì)、能量、還原力等因素更為敏感，通過代謝調(diào)控能夠?qū)崿F(xiàn)胞內(nèi)物質(zhì)變化和能量轉(zhuǎn)移向目標(biāo)途徑傾斜，實(shí)現(xiàn)次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的提升。隨著基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)的發(fā)展及米曲霉遺傳操作技術(shù)的成熟，次級代謝調(diào)控因子將逐步被發(fā)現(xiàn)和解析，調(diào)控機(jī)理也將會被慢慢揭示。對米曲霉次級代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)認(rèn)知的逐步深入，能夠有效指導(dǎo)人們更加合理地應(yīng)用米曲霉的次級代謝產(chǎn)物，拓展米曲霉的工業(yè)應(yīng)用范圍和場景。