陳 思，張麗穎，蔣洪忠，任林柱

(吉林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，吉林長春 130062)

豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)屬于套式病毒目(Nidovirales)、冠狀病毒科(Coronaviridae)、冠狀病毒屬(Coronavirus)α冠狀病毒(Alphacoronavirus)。該病毒主要感染豬腸道上皮，導(dǎo)致絨毛萎縮、吸收不良，引起新生仔豬急性腹瀉、嘔吐、脫水和高病死率。PEDV主要通過糞-口直接接觸傳播，也可形成氣溶膠并通過糞-鼻途徑傳播[1]。

豬流行性腹瀉在20世紀(jì)70年代后期首次出現(xiàn)在英國和比利時[2]。我國于1973年首次報道豬流行性腹瀉病例；隨后，包括韓國和日本在內(nèi)的其他亞洲國家也相繼暴發(fā)該病[2]。2010年10月之后我國開始大規(guī)模暴發(fā)該病[2]。目前，PEDV已成為亞洲仔豬腹瀉的主要原因，是世界上最嚴重的豬病毒性疾病之一，給生豬行業(yè)的發(fā)展產(chǎn)生了巨大影響，造成了重大經(jīng)濟損失。

本文主要針對國內(nèi)外近期在PEDV的組織和細胞嗜性、細胞受體、入胞方式、細胞蛋白酶方面的研究進展進行綜述，以期為后續(xù)PEDV的研究提供參考。

1 PEDV的組織和細胞嗜性

病毒在特異組織和細胞中的復(fù)制能力是決定其組織嗜性的重要因素。PEDV在腸道具有組織嗜性，哺乳豬感染急性PEDV的12 h～24 h內(nèi)，PEDV主要感染空腸和回腸，其次是空腸近端和十二指腸[3]。幽門不是急性PEDV感染的部位，而大腸的絨毛腸細胞經(jīng)常被感染，但感染的結(jié)腸上皮細胞無壞死病變。與結(jié)腸腸上皮細胞不同的是，PEDV感染的小腸絨毛腸上皮細胞會發(fā)生急性壞死并從固有層剝落，導(dǎo)致小腸中明顯的絨毛萎縮或融合[1]。PEDV可能不會在體內(nèi)誘導(dǎo)腸道絨毛腸細胞凋亡，但體外感染PEDV的非洲綠猴腎細胞(Vero細胞)會發(fā)生凋亡[1]。

PEDV感染早期定位在小腸的絨毛-隱窩界面，而不是在絨毛尖端中。PEDV最先感染未成熟的腸細胞，隨后感染至空腸上部，直至感染整個空腸的絨毛上皮[1]。除了通過糞-口傳播，PEDV還能夠經(jīng)過鼻腔黏膜下的樹突狀細胞的攝取進入鼻腔黏膜固有層，隨后攝取PEDV后的樹突狀細胞遷移至附近淋巴結(jié)，通過病毒突觸將PEDV傳遞給淋巴細胞，而后攜帶PEDV的淋巴細胞又能經(jīng)淋巴循環(huán)和血液循環(huán)遷移至腸黏膜，并將病毒傳遞給腸上皮細胞引起致病[3]。PEDV在體內(nèi)除主要感染豬小腸上皮細胞外，還感染杯狀細胞和隱窩干細胞[4]，也能夠在仔豬鼻腔上皮中進行低水平復(fù)制[3]。

PEDV的S蛋白既具有受體結(jié)合能力又具有膜融合能力，S蛋白是決定組織和細胞嗜性以及宿主范圍的關(guān)鍵因素，但PEDV的細胞適應(yīng)性差。自PEDV發(fā)現(xiàn)以來，科研人員嘗試了很多方法將病毒適應(yīng)于細胞培養(yǎng)。1984年宣華等首次報道了在胎豬腸組織單層細胞上培養(yǎng)PEDV，但因胎豬腸組織不易獲得，未得到廣泛應(yīng)用。直到1988年，Hofmann等通過向Vero細胞培養(yǎng)基中添加胰蛋白酶，使PEDV成功適應(yīng)于Vero細胞。其后，日本和韓國也相繼報道PEDV在Vero細胞上培養(yǎng)成功。我國李樹根、錢永清等也成功地在體外實現(xiàn)PEDV的細胞培養(yǎng)。

目前PEDV的分離培養(yǎng)多數(shù)需要在細胞培養(yǎng)基中添加胰蛋白酶，可能是由于蛋白酶在PEDV侵入細胞和細胞釋放PEDV病毒粒子方面起著重要作用。但是，不同來源的PEDV或Vero細胞適應(yīng)株對胰酶的抵抗力不一致，有的病毒經(jīng)過高代次傳代培養(yǎng)后已不具備胰酶依賴性。研究發(fā)現(xiàn)，胰蛋白酶通過將S蛋白切割為S1和S2亞基，使PEDV能夠在體外復(fù)制[5]。胰酶識別切割S蛋白的裂解位點在S2區(qū)的890位氨基酸，裂解后的S2可以促進病毒與宿主細胞膜融合，利于病毒粒子的入侵[6]。隨后，PEDV可使受感染細胞裂解，導(dǎo)致細胞膜空泡化和合胞體形成[7]。

適應(yīng)Vero細胞的PEDV可以在不同種類的細胞系中增殖。Liu等將仔豬中分離的PEDV Ohi VBS2株在Vero CCL-81細胞中進行適應(yīng)性培養(yǎng)，隨后用該細胞適應(yīng)的PEDV分別感染PK-15、豬睪丸細胞(swine testicle，ST)、人肝癌細胞(human hepatocellular carcinomas，Huh-7)、人胚肺成纖維細胞(human embryonic lung fibroblasts，MRC-5)、Vero CCL-81和蝙蝠肺細胞(bat lung，Tb1-Lu)等，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Vero CCL-81細胞適應(yīng)的PEDV可以感染上述細胞系，提示PEDV能夠感染豬源、猴源、人源及蝙蝠源的細胞系[8]。結(jié)合基因組進化分析結(jié)果，推測PEDV可能來源于蝙蝠并且對包括人在內(nèi)的其他物種都有潛在的感染能力[8]。為探索新的培養(yǎng)方法，研究人員利用仔豬小腸上皮細胞(intestinal epithelial cell，IEC)成功分離了PEDV流行株，通過與Vero細胞對比發(fā)現(xiàn)病毒在添加胰酶的IEC上適應(yīng)細胞能力更強，并可以穩(wěn)定傳代[9]。推測可能是由于仔豬小腸上皮細胞是PEDV感染的宿主細胞，含有大量PEDV結(jié)合受體，例如pAPN等[10]。此外，IEC上的小腸宿主蛋白酶，可能具有類似胰酶的特性，可以促進病毒的侵入和增殖，提高PEDV體外培養(yǎng)的適應(yīng)性。

2 PEDV的受體

病毒通過吸附、侵入、脫殼、合成、裝配、釋放等環(huán)節(jié)完成增殖，病毒黏附到細胞膜上是侵入宿主細胞的第一步，一般是與細胞表面的特異性受體結(jié)合。冠狀病毒的受體包括多糖類受體和蛋白多肽類受體，其中多糖類受體又包括硫酸乙酰肝素和唾液酸。唾液酸有神經(jīng)氨酸 Neu5Gc、Neu5Ac、Neu5、9Ac2等；蛋白多肽受體有氨基肽酶N (aminopeptidase N，APN)、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)、癌胚抗原相關(guān)細胞黏附分子-1(carcinoembryonic antigen-associated adhesion molecule 1， CEACAM1)和二肽酰肽酶4(dipetidyl peptidase 4，DPP4)等[11]。研究發(fā)現(xiàn)，APN可能是PEDV的功能受體[8,10]，而Neu5Ac作為輔助受體發(fā)揮作用[8]。

氨基肽酶N(APN)是一種海馬型鋅-氨基肽酶，具有鋅離子依賴性，以頭對頭的同源二聚體形式錨定于細胞表面。APN的活性位點和肽結(jié)合通道位于一寬開口的腔中，空腔可能會進一步開放，以結(jié)合暴露的蛋白質(zhì)N末端?；钚晕稽c錨定在肽/蛋白質(zhì)的N-末端中性殘基，并且肽結(jié)合通道以不依賴序列的方式結(jié)合其余的肽/蛋白質(zhì)。APN暴露的外表面可與冠狀病毒結(jié)合，但不會影響其生理功能，從而充當(dāng)冠狀病毒受體。哺乳動物的APN多表達于腸上皮或神經(jīng)系統(tǒng)等組織的細胞表面，是一種具有多種功能的二聚體細胞表面胞外酶。

關(guān)于豬源APN(porcine aminopeptidase N，pAPN)是否為PEDV的受體，一直存在爭議。Li B X等[10]利用PEDV分別感染非易感細胞犬腎細胞(Madin-Daby canine kidney cells，MDCK)和過表達pAPN的MDCK細胞，發(fā)現(xiàn)PEDV能夠在pAPN過表達的MDCK細胞生長，初步確定pAPN為PEDV的功能性受體。此外，通過建立表達pAPN的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，發(fā)現(xiàn)其對PEDV易感，進一步證明pAPN為PEDV的受體[12]。但是PEDV無法在天然表達pAPN的ST細胞中復(fù)制，而后者卻對TGEV非常敏感。因此，有人推測認為，pAPN表達水平與PEDV感染之間可能存在相關(guān)性。進一步研究表明，pAPN受體密度似乎是導(dǎo)致PEDV感染成功的重要因素[13]。Liu C等[8]利用PEDV S蛋白假病毒系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)，該假病毒能感染表達人源APN(hAPN)或pAPN的非易感細胞MDCK，表明PEDV與APN的相互作用不具有物種特異性。而且，PEDV能感染豬、猴、人、蝙蝠等物種的細胞系[8]，也進一步表明PEDV與APN的相互作用并不是特異的，提示PEDV可以跨物種傳播。

近年研究發(fā)現(xiàn)，hAPN和pAPN可能不是PEDV的主要功能受體，APN可能通過其蛋白酶活性促進PEDV感染，但PEDV感染豬小腸上皮細胞可能與pAPN不相關(guān)[7,14]。另外，PEDV可以感染Vero細胞，但Vero細胞上的PEDV受體需要進一步確認。Ji C M等利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除Vero細胞的APN基因后，發(fā)現(xiàn)APN敲除的細胞系與正常的Vero細胞感染效率相同，而且構(gòu)建的穩(wěn)定表達綠猴APN的Vero細胞系感染PEDV的效率也未見增加，表明Vero細胞上可能存在其他類型的PEDV受體[7]。使用肝素作為競爭劑，發(fā)現(xiàn)肝素預(yù)處理PEDV時，可有效地抑制PEDV感染Vero細胞的效果，推測硫酸乙酰肝素可能是PEDV感染Vero的黏附因子，也可能是Vero細胞對PEDV易感的原因之一。此外，Vero細胞本身是干擾素缺陷型細胞且具有抗高濃度胰酶的特性，也可能是PEDV易感的另一個原因，這也進一步提示pAPN不是PEDV的唯一受體。因此，PEDV可能通過不同受體感染宿主細胞。

唾液酸是帶負電荷單糖，普遍存在于細胞膜表面，唾液酸有很多病毒結(jié)合糖蛋白和糖脂的唾液酸寡糖，由于細胞外表面上糖鏈中唾液酸分子的介導(dǎo)使病毒進入細胞。除了APN，有研究表明PEDV S1的N末端具有唾液酸結(jié)合活性，S1 NTD與細胞表面的唾液酸結(jié)合能增強病毒的感染性[15]。通過聚糖陣列篩選，發(fā)現(xiàn)Neu5Ac與PEDV S1的結(jié)合親和力最高[16]。然而，尚不知道唾液酸與S蛋白的結(jié)合如何影響PEDV進入細胞。

3 PEDV入胞方式

多數(shù)病毒的表面蛋白能夠特異性地識別和結(jié)合細胞膜表面的受體，進而介導(dǎo)病毒的入胞[11]。有囊膜的病毒能直接與細胞膜發(fā)生膜融合，進而將病毒基因組釋放到宿主細胞質(zhì)中；多數(shù)囊膜病毒是通過宿主細胞的內(nèi)吞作用，將病毒顆粒包裹在內(nèi)吞小體中并進入細胞。在內(nèi)吞小體中，病毒囊膜與內(nèi)吞小體的膜結(jié)構(gòu)在蛋白酶和低pH環(huán)境下發(fā)生病毒囊膜-內(nèi)體膜融合，使病毒基因組釋放到宿主細胞質(zhì)中。病毒利用的內(nèi)吞途徑包括網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞、小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞、脂筏介導(dǎo)的內(nèi)吞和巨胞飲作用等。

2014年，Park J E等[17]利用化學(xué)抑制劑和共聚焦方法分析了PEDV侵入Vero細胞的機制，發(fā)現(xiàn)PEDV的入胞過程是在網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用之后發(fā)生的，并且依賴于低pH才能成功進入細胞。Wei X N等[18]用不同的PEDV亞型(PEDV GⅠ亞型GDS09株和GⅡ亞型GDS01株)分別感染Vero和IPEC-J2細胞，發(fā)現(xiàn)PEDV可以通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞、小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞和脂筏介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑進入Vero和IPEC-J2細胞，而且不同亞型PEDV的侵入效率因內(nèi)吞途徑不同而不同。進一步分析發(fā)現(xiàn)，不同PEDV亞型之間的差異可能是由于S基因的差異，尤其是S基因的S1區(qū)(同源性約為92 %)與受體結(jié)合效率的不同而導(dǎo)致細胞進入和膜融合效率的不同[19]，提示PEDV的刺突蛋白在介導(dǎo)不同方式的內(nèi)吞途徑中各有重要作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)，PEDV主要通過內(nèi)吞途徑進入內(nèi)吞小體，在低pH環(huán)境和組織蛋白酶L的水解作用下引發(fā)病毒表面蛋白構(gòu)象的改變，從而發(fā)生病毒囊膜-內(nèi)體膜融合以及病毒脫衣殼，釋放病毒基因組進入細胞質(zhì)[19]。

關(guān)于PEDV侵入細胞的途徑，就目前研究結(jié)果來看，可能與豬德爾塔冠狀病毒的入侵方式類似[20]。一是內(nèi)吞途徑，通過宿主細胞的內(nèi)吞作用，將病毒顆粒包裹在內(nèi)吞小體中并進入細胞。在內(nèi)吞小體中，病毒囊膜與內(nèi)吞小體的膜結(jié)構(gòu)在組織蛋白酶L、低pH環(huán)境下進行融合，使病毒基因組釋放到宿主細胞質(zhì)中[19]。二是膜融合途徑，通過外源蛋白酶或宿主蛋白酶在病毒和受體結(jié)合后激活S蛋白，然后病毒通過膜融合方式進入細胞質(zhì)中。

4 蛋白酶在PEDV感染中的作用

蛋白酶在病毒感染中起關(guān)鍵作用，不同的病毒與不同的蛋白酶相互作用從而進入細胞，這在某種程度上決定了病毒的侵入途徑。一般來說，主要有4種細胞蛋白酶參與冠狀病毒的感染過程。

4.1 膜結(jié)合蛋白酶

大量研究表明，跨膜絲氨酸蛋白酶在病毒與細胞受體結(jié)合后介導(dǎo)病毒侵入。絲氨酸蛋白酶可以激活很多呼吸道冠狀病毒的感染過程。Shirato K等發(fā)現(xiàn)跨膜絲氨酸蛋白酶2(transmembrane protease serine 2，TMPRSS2)可以顯著促進PEDV在穩(wěn)定表達TMPRSS2的Vero細胞中釋放病毒粒子[21]。Shi W等[22]通過對Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶家族的TMPSS2、鱗癌細胞差異表達蛋白酶1(differentially expressed squamous cell carcinoma gene 1，DESC1)、呼吸道胰酶樣蛋白酶(human airway trypsin-like protease，HAT)和鑲嵌式長型絲氨酸蛋白酶(mosaic serine protease large-form，MSPL)蛋白酶進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TMPSS2和MSPL可與PEDV S蛋白進行共定位，且這些蛋白酶可以裂解S蛋白、促進病毒與細胞的融合。Shi等分別建立了穩(wěn)定表達TMPRSS2和MSPL的Vero/TMPRSS2和Vero/MSPL細胞系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這兩種細胞系(尤其是Vero/MSPL)可以代替外源胰蛋白酶用于體外培養(yǎng)PEDV，它們通過激活PEDV S蛋白可以顯著提高病毒滴度，促進病毒-細胞之間的融合[23]。

4.2 組織蛋白酶

病毒與細胞融合進入內(nèi)吞體后，溶酶體組織蛋白酶L或組織蛋白酶B即可激活病毒侵入。組織蛋白酶對SARS-CoV-2、MERS、HCoV-229E、SARS等冠狀病毒均有激活作用[24-26]。利用PEDV S蛋白假病毒系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)，PEDV侵入細胞并不依賴于前蛋白轉(zhuǎn)化酶或細胞表面蛋白酶，而是被溶酶體半胱氨酸蛋白酶(組織蛋白酶L和組織蛋白酶B)激活從而裂解S蛋白，促進S蛋白包裝的假病毒粒子侵入宿主細胞[27]。同時，組織蛋白酶激活PEDV侵入的效果優(yōu)于胰蛋白酶，而當(dāng)組織蛋白酶被抑制或缺少時，胰蛋白酶則可以替代組織蛋白酶的作用，激活PEDV侵入[27]。

4.3 細胞外蛋白酶

胰蛋白酶是一種消化酶，主要分布在小腸中，可直接裂解許多腸道冠狀病毒的S蛋白，因此，對PEDV侵入具有一定的促進作用。研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)PEDV毒株都高度依賴胰蛋白酶。當(dāng)病毒與其受體結(jié)合時，胰蛋白酶可切割結(jié)合的PEDV S蛋白，而游離病毒顆粒不會被裂解[28]。這些發(fā)現(xiàn)表明，PEDV S蛋白在與受體結(jié)合并被外源胰蛋白酶切割后可能發(fā)生構(gòu)象變化，從而誘導(dǎo)膜融合[28]。有研究表明，胰蛋白酶識別S蛋白的裂解位點為S2區(qū)的890位氨基酸，S蛋白的裂解可以促進病毒與宿主細胞膜融合，利于病毒粒子的入侵[6]。但是一些PEDV的Vero細胞適應(yīng)株在感染細胞時并不需要胰蛋白酶，而病毒出芽階段經(jīng)胰蛋白酶處理可在感染的細胞中引起明顯的細胞病變作用，導(dǎo)致感染的Vero細胞形成合胞體，在此過程中胰蛋白酶可以增強其感染性和CPE的形成[28-30]。

4.4 前蛋白轉(zhuǎn)化酶

弗林蛋白酶(Furin)是一種前蛋白轉(zhuǎn)化酶，位于反式高爾基體網(wǎng)絡(luò)(Trans Golgi Network，TGN)中，也存在于細胞表面。弗林蛋白酶可以裂解具有特定基序的前體蛋白，以產(chǎn)生具有生物學(xué)活性的成熟蛋白。該酶可以在PEDV的S1/S2位點上切割S蛋白，這種切割對于S蛋白介導(dǎo)的細胞-細胞融合和宿主細胞入侵至關(guān)重要。研究人員通過將PEDV S蛋白中的第888位氨基酸(V888)突變?yōu)楦チ值鞍酌缸R別的裂解位點(VQKR→RQKR)，構(gòu)建融合肽N端帶有弗林蛋白酶切割位點的重組PEDV毒株P(guān)EDV-SFCS，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PEDV-SFCS可在培養(yǎng)細胞中復(fù)制，且不依賴胰蛋白酶，但是重組病毒的滴度較低[31]。表明宿主蛋白酶可能具有替代胰蛋白酶的潛力，如果能合理利用可以使得PEDV體外培養(yǎng)無需胰蛋白酶。

5 展望

PEDV刺突蛋白S決定了病毒的多樣性和宿主嗜性，并介導(dǎo)病毒與宿主細胞的表面特異性受體結(jié)合和病毒-細胞膜融合過程；S蛋白還與PEDV的體外生長適應(yīng)情況和體內(nèi)毒力衰減有關(guān)。隨著PEDV突變株的不斷產(chǎn)生，PEDV的入胞過程可能進化出多種機制，而且PEDV可能對包括人類在內(nèi)的其他物種構(gòu)成潛在威脅。值得注意的是，PEDV進入宿主細胞的途徑可能與所使用的細胞系和環(huán)境條件也有一定關(guān)聯(lián)，因此，利用豬腸小體建立的PEDV感染模型有可能會更好的模擬PEDV體內(nèi)感染的過程[32-33]，而如何提高PEDV體外培養(yǎng)對細胞的適應(yīng)性，進而提高病毒滴度，是研究者們關(guān)注和急需解決的重要問題之一。因此，構(gòu)建不依賴于胰蛋白酶的通用的PEDV細胞系，對于PEDV的分離培養(yǎng)、病毒生物學(xué)研究，防御病毒感染至關(guān)重要。對于PEDV S蛋白與pAPN受體的深入研究將有助于更好地了解病毒入胞機制。PEDV入胞機制的深入研究，也將為靶向入胞途徑的抗病毒藥物設(shè)計提供靶點，并為PEDV的防控提供了新的思路和方向。