李媛媛 蘇東棟

結(jié)核病是嚴(yán)重危害人類健康的全球十大致死原因之一,尤其是耐藥結(jié)核病的出現(xiàn)使結(jié)核病治療困難重重,結(jié)核病防治任重道遠(yuǎn)。所以,高效精準(zhǔn)的藥物敏感性試驗(yàn)(藥敏試驗(yàn))和耐藥監(jiān)測對結(jié)核病的檢測和控制十分重要［1］。BACTECMGIT960液體藥敏試驗(yàn)(MGIT960藥敏試驗(yàn))是目前檢測MTB 對一線抗結(jié)核藥品耐藥性的常用方法之一［2］。但由于MTB 生長緩慢,此方法耗時較長,約需14 d 才能報告結(jié)果,以致患者延誤診斷而錯過最佳治療時機(jī)。近年來,隨著檢測技術(shù)的不斷進(jìn)步,各種各樣的分子診斷技術(shù)運(yùn)用于結(jié)核病的診斷和耐藥性檢測中,為患者提供更加快速、準(zhǔn)確的診斷和治療建議［3,4］。熒光PCR 探針熔解曲線法(熔解曲線法)是目前臨床應(yīng)用較為廣泛的一種分子檢測技術(shù),其通過對某些耐藥基因在熔解分析中的熔點(diǎn)變化的檢測來判定相應(yīng)基因是否發(fā)生突變［5,6］。本研究設(shè)想應(yīng)用熒光定量PCR 探針熔解曲線法檢測耐多藥結(jié)核病患者的臨床分離菌株對利福平、異煙肼、乙胺丁醇及鏈霉素的耐藥基因突變,并分析在MTB 耐藥基因檢測中使用熒光PCR 熔解曲線法的應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019 年4 月～2020 年11 月間于本院住院復(fù)治肺結(jié)核的患者為研究對象,納入符合2017 年版結(jié)核病診斷規(guī)范中復(fù)治肺結(jié)核診斷的患者(①因結(jié)核病不合理或不規(guī)律用抗結(jié)核藥物治療≥1 個月的患者；初治失敗和復(fù)發(fā)患者。②年齡≥17 歲。)作為本次研究的研究對象。獲得培養(yǎng)陽性菌株165 株,經(jīng)MPB64 快速抗原檢測初篩,160 株為MTB,5 株為非MTB,最終納入160 例(株)為本研究對象。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本留取 所有參加本次研究的患者全部完成心電圖、凝血功能、肝腎功能等常規(guī)檢查,并禁食8 h,結(jié)束后,清晨給予2%利多卡因局部吸入麻醉后經(jīng)電子支氣管鏡行病灶部位深部痰刷檢,收集患者痰標(biāo)本,標(biāo)本量均≥2 ml/份,刷檢痰標(biāo)本分離培養(yǎng)按照《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行。

1.2.2 MTB 培養(yǎng)及藥敏方法 采用傳統(tǒng)培養(yǎng)法和比例法藥敏試驗(yàn),MTB 分離培養(yǎng),并常規(guī)行藥敏試驗(yàn)。

1.2.3 熒光PCR 熔解曲線法 嚴(yán)格按照MTB 利福平、異煙肼、氟喹諾酮類、卷曲霉素、阿米卡星耐藥突變試劑盒說明書操作。DNA 提取：取1.5 ml 處理后的支氣管刷檢樣本(處理同分離培養(yǎng))加入1.5 ml 離心管。以12000 r/min 離心10 min,棄上清,加入200 μl滅菌水,渦旋振蕩重懸沉淀物,將沉淀重懸液加入核酸自動純化試劑管中,在每份標(biāo)本中加入40 ml 二硫蘇糖醇(DTT)。將試管放入核酸自動提取儀中,選取結(jié)核提取步驟,運(yùn)行儀器50 min 后,將純化的核酸轉(zhuǎn)入1.5 ml離心管中,99℃加熱20 min 后14000 r/min 離心10 min,吸取5 μl 上清液,加入到含20 μl PCR 反應(yīng)液的反應(yīng)管中,放入ABI7500 實(shí)時熒光PCR 擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增和熔解分析。PCR 反應(yīng)的程序?yàn)閷⒛蜞奏ぬ擒彰?UNG)去污染處理2 min,50℃,1 次；預(yù)變性95℃,10 min,1 個循環(huán)；Touchdown 循環(huán)95℃、10 s,71℃、15 s(每個循環(huán)下降1℃),78℃、15 s,10 個循環(huán)；PCR 循環(huán)程序95℃、10 s,61℃、15 s,78℃、15 s,45 個循環(huán)。熔解分析：95℃、2 min,40℃、2 min,45～85℃(設(shè)置在此階段每1℃采集FAM 和TET 通道熒光信號),1 個循環(huán)。

1.3 觀察指標(biāo) 每例患者采用同一標(biāo)本進(jìn)行絕對濃度法和熔解曲線法耐藥基因檢測,對絕對濃度法和熔解曲線法檢測利福平、異煙肼耐藥性結(jié)果不一致的對象以絕對濃度法為驗(yàn)證金標(biāo)準(zhǔn)。觀察熔解曲線法對利福平、異煙肼的檢測敏感度、特異度、準(zhǔn)確度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS24.0 統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗(yàn)；選擇Kappa一致性檢驗(yàn)檢驗(yàn)兩種方法。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

同一標(biāo)本應(yīng)用兩種方法檢測時,絕對濃度法檢出利福平21 例耐藥,139 例敏感；檢出異煙肼68 例耐藥,92 例敏感。熔解曲線法檢出利福平17 例耐藥,139 例敏感,4 例未檢出結(jié)果；檢出異煙肼61 例耐藥,99 例敏感。熔解曲線法對利福平的檢測準(zhǔn)確度為96.15%、敏感度為87.50%、特異度為98.39%；對異煙腓的檢測準(zhǔn)確度為95.00%、敏感度為88.57%、特異度為96.80%。兩種檢驗(yàn)方法對利福平及異煙肼的耐藥及敏感率比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.370、0.636,P=0.543、0.425＞0.05)。

表1 觀察熔解曲線法檢測的準(zhǔn)確度、敏感度及特異度(n,%)

3 討論

熒光PCR 熔解曲線法結(jié)合了聚合酶鏈反應(yīng)和熒光探針熔解曲線分析的優(yōu)點(diǎn),通過對目的基因進(jìn)行擴(kuò)增,觀察其熔解溫度與對照的差值,從而判斷是否有耐藥基因突變［7-10］。該方法簡便、快速、高效,可以準(zhǔn)確檢出耐藥基因的具體突變位點(diǎn),適用于專科醫(yī)院進(jìn)行大批量樣本檢測。

本研究以絕對濃度法藥敏試驗(yàn)為標(biāo)準(zhǔn),分別檢測了利福平、異煙肼耐藥情況,結(jié)果顯示熔解曲線法對利福平的檢測準(zhǔn)確度為96.15%、敏感度為87.50%、特異度為98.39%；對異煙腓的檢測準(zhǔn)確度為95.00%、敏感度為88.57%、特異度為96.80%。兩種檢驗(yàn)方法對利福平及異煙肼的耐藥及敏感率比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。表明熔解曲線法和絕對濃度法的一致性良好。研究中,熔解曲線法檢出對利福平139 例敏感,17 例耐藥,4 例標(biāo)本未檢出,原因可能RRDR 區(qū)域以外的DNA 發(fā)生突變或其他機(jī)制導(dǎo)致。耐藥熒光PCR熔解曲線法作為快速篩查MTB耐藥的分子學(xué)方法,雖然與標(biāo)準(zhǔn)的方法相比不完全一致,且檢測的基因位點(diǎn)有限,但因其良好的敏感度和特異度,節(jié)約時間、安全高效,是臨床檢驗(yàn)及診治耐藥結(jié)核的有效手段。

熒光PCR 熔解曲線法作為快速篩查MTB 耐藥的分子學(xué)方法,雖然與標(biāo)準(zhǔn)的方法相比不完全一致,且檢測的基因位點(diǎn)有限,但因其良好的敏感度和特異度,節(jié)約時間、安全高效,是臨床檢驗(yàn)及診治耐藥結(jié)核的有效手段。