竇 恒, 樊 華, 王秀英, 佟東輝，曲 晶，王 丹，孫 鶴，張怡軒

(1.沈陽(yáng)藥科大學(xué) 生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110016；2.遼寧格瑞仕特生物制藥有限公司，遼寧 本溪 117004；3.遼寧省檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證中心 遼寧省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院，遼寧 沈陽(yáng) 110030)

外用紅色諾卡氏菌(Nocardiarubra)細(xì)胞壁骨架是一種非特異性免疫調(diào)節(jié)劑，具有增強(qiáng)體內(nèi)巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的免疫活性[1]，有效促進(jìn)免疫細(xì)胞吞噬和殺滅病原體，提高人體抗感染的能力[2]，可以迅速消除局部炎癥，加快糜爛面的愈合[3]。巨噬細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)中具有抗原遞呈功能的細(xì)胞之一，具有直接吞噬和殺傷病原體和腫瘤細(xì)胞的功能[4]，還具有參與抗原加工、遞呈免疫調(diào)節(jié)的重要作用，檢測(cè)巨噬細(xì)胞吞噬功能對(duì)于判斷巨噬細(xì)胞的功能，了解機(jī)體的特異性和非特性免疫狀態(tài)具有重要作用[5]。原有外用紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架檢測(cè)巨噬細(xì)胞吞噬情況的方法為先將B/C小鼠兩次免疫后，腹腔注入雞紅細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共同作用數(shù)小時(shí)，抽取腹腔液共同孵育染色，顯微鏡下觀察，計(jì)算巨噬細(xì)胞的吞噬率和吞噬指數(shù)，以此判斷巨噬細(xì)胞的吞噬功能。該檢驗(yàn)方法統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異明顯，可作為日常檢驗(yàn)的依據(jù)。但由于需要操作者顯微鏡下計(jì)數(shù)，人工涂片及觀察，人工選擇觀察視野，因此受主觀因素影響較大；另外觀察的細(xì)胞數(shù)量有限，方法的靈敏度和準(zhǔn)確度都有所降低。近年來(lái)，文獻(xiàn)報(bào)道有學(xué)者應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞吞噬功能，如熒光微球法、FITC標(biāo)記大腸埃希菌法等[6]。流式細(xì)胞儀技術(shù)用于巨噬細(xì)胞的吞噬率檢測(cè)可以輕易地將觀察細(xì)胞數(shù)從幾百提高至幾千[7]，而且具有分析速度快、重復(fù)性好和特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[8]。熒光微球被細(xì)胞吞噬后，其熒光信號(hào)可迅速被流式細(xì)胞儀檢測(cè)，具有熒光信號(hào)的巨噬細(xì)胞即視為出現(xiàn)吞噬現(xiàn)象，可快速、準(zhǔn)確地測(cè)定巨噬細(xì)胞的吞噬率[9]。本研究探索了外用紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架兩種新的效力測(cè)定方法，即流式細(xì)胞術(shù)-熒光微球法和流式細(xì)胞術(shù)-免疫雙標(biāo)法(熒光微球+熒光抗體)，并與國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的方法進(jìn)行比較，為該藥品測(cè)定方法的改進(jìn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品來(lái)源 外用紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架(Nr-CWS)，批號(hào)201605001、201701001、201806001；成分為阿拉伯半乳聚糖、胞壁酸和粘肽等，輔料為右旋糖酐40；性狀為白色疏松狀體或粉末；生產(chǎn)公司為遼寧格瑞仕特生物制藥有限公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)小鼠 SPF級(jí)BALB/C鼠，雌性，21～24 g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)材料 羧酸基修飾熒光微球(黃綠色，直徑2.0 μm，美國(guó)Invitrogen公司)；BSA(牛血清白蛋白，規(guī)格1 g，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司)；F480熒光抗體(成熟小鼠巨噬細(xì)胞標(biāo)志物，規(guī)格0.1 mg，美國(guó)BD Pharmingen公司)；同型抗體(成熟小鼠巨噬細(xì)胞標(biāo)志物，規(guī)格0.1 mg，美國(guó)BD Pharmingen公司)；Giemsa(吉姆薩色素，規(guī)格 1 g，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；一次性無(wú)菌注射器(1、2、5、10 mL)、洗瓶、染缸、搪瓷盒(金屬盒/載玻片濕盒)、紗布、載玻片、移液槍(200 μL)、槍頭(200 μL)、眼科手術(shù)剪、眼科手術(shù)鑷子、100 mL錐形瓶，一次性靜脈輸液針、棉球、10 mL玻璃離心管、勾菌環(huán)。75%乙醇、甲醇、無(wú)水乙醇、姬姆氏色素(希格瑪)、甘油、香柏油。5%雞紅細(xì)胞(遼寧格瑞仕特生物制藥有限公司提供)。

1.1.4 主要儀器與設(shè)備 流式細(xì)胞儀(C6 plus，美國(guó)BD公司)；生化培養(yǎng)箱(IPP260，美國(guó)Memmert公司)；超聲器(HU-10260B，天津恒奧科技發(fā)展有限公司)；恒溫水浴(SW22，德國(guó)Julabo實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司)；恒溫水浴鍋(DK-98-II，天津泰斯特)；低速臺(tái)式離心機(jī)(TDL-80-2B，上海安亭)；雙目顯微鏡(DM3000，德國(guó)萊卡)。

1.2 方法

1.2.1 顯微鏡觀察法 ①樣品制備：將紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架溶于生理鹽水中，分別制成濃度為100和50 μg/mL的紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架樣品溶液。②5%雞紅細(xì)胞的制備：用10 mL注射器吸取3 mL阿氏液，從雞翅靜脈采血，于阿氏液中4 ℃貯存。將貯存于阿氏液中的雞血混勻，并取出一定量含雞紅細(xì)胞的阿氏液1 500 r/min離心5 min，棄上清，再加0.9%氯化鈉注射液至原量，混勻雞紅細(xì)胞，1 500 r/min離心5 min，用0.9%氯化鈉注射液共洗3次，第3次同速離心10 min，棄上清，并用0.9%氯化鈉注射液配成5%雞紅細(xì)胞懸液，4 ℃貯存，使用前鏡檢，發(fā)生溶血棄去。③操作：將檢疫合格的BALB/C鼠，隨機(jī)分為供試品高劑量組(100 μg/mL)、供試品低劑量組(50 μg/mL)和正常對(duì)照組，供試品組分別于第1天和第6天腹腔注射紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架樣品溶液0.2 mL/(只·次)；末次注射后第4天，腹腔注射新配制的5%雞紅細(xì)胞，2 h后，頸椎脫臼處死小鼠。沿正中線剪開腹壁皮膚，經(jīng)腹膜注入0.9%氯化鈉溶液，輕揉后，吸取腹腔液1.0 mL，分別滴于兩張載玻片上并涂勻，放入濕盒，溫箱孵育30 min后，固定5 min，浸于Giemsa染液中染色10 min，然后水洗。④檢測(cè)：待載玻片干后，將其置于顯微鏡下觀察、鏡檢并計(jì)數(shù)。⑤判定標(biāo)準(zhǔn)：雞紅細(xì)胞呈橢圓、具細(xì)胞核，染色后胞漿呈粉紅色，核呈紫藍(lán)色；中性粒細(xì)胞核呈藍(lán)色，胞漿呈淺紫色，顆粒呈藍(lán)紫色；嗜酸性粒細(xì)胞的顆粒呈紅色；嗜堿性粒細(xì)胞核呈暗藍(lán)色，顆粒呈暗紫紅色。實(shí)驗(yàn)以吞噬率和吞噬指數(shù)表示小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬能力。顯微鏡法吞噬率和吞噬指數(shù)按公式(1)和(2)計(jì)算。應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，其中吞噬率采用卡方檢驗(yàn)，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行吞噬指數(shù)兩兩比較，如供試品組的吞噬率或吞噬指數(shù)與正常對(duì)照組的吞噬率或吞噬指數(shù)比較，有顯著性差異，方可判定該供試品效力實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)-熒光微球法 ①熒光微球的制備：應(yīng)用1%的BSA溶液(稀釋200倍)制備含微球溶液。37 ℃避光孵育30 min，超聲5 min。臨用現(xiàn)配。②實(shí)驗(yàn)步驟：檢疫合格的BALB/C鼠，雌性，21～24 g，隨機(jī)分為供試品組和正常對(duì)照組。各實(shí)驗(yàn)組分別于第1天、第6天腹腔注射相應(yīng)藥液0.2 mL/(只·次)免疫小鼠；末次免疫后第4天(加雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)小鼠需在麻醉前2 h腹腔注射新配制的5%雞紅細(xì)胞各0.5 mL),取各組小鼠麻醉至小鼠不再掙扎，浸泡消毒3 min。腹腔注射生理鹽水3 mL/只，輕輕按揉腹部，將腹壁剪開一個(gè)小口，吸取腹腔洗液2 mL用75 μm過(guò)濾器過(guò)濾至試管內(nèi)，調(diào)整巨噬細(xì)胞數(shù)為(4～6)×105/mL。移液槍吸取1 mL腹腔洗液于6孔培養(yǎng)板中，加入已經(jīng)預(yù)調(diào)理過(guò)的熒光微球，37 ℃二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱避光孵育90～120 min，孵育結(jié)束后棄上清(含未貼壁細(xì)胞和多余熒光微球)，每次使用1.0 mL生理鹽水輕輕洗滌2次，去上清后再加入4 ℃生理鹽水0.3 mL，用細(xì)胞刮刮下貼壁細(xì)胞，輕輕吹打均勻后經(jīng)75 μm過(guò)濾器過(guò)濾后上機(jī)分析。③流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分析[10]：a.設(shè)門：首先設(shè)立APC-SSC二維散點(diǎn)圖，通過(guò)調(diào)節(jié)APC和SSC電壓值，以巨噬細(xì)胞設(shè)門界定分析的巨噬細(xì)胞群，最大限度地排除其他有核細(xì)胞、細(xì)胞碎片等的干擾；b.獲?。涸跓晒馕⑶虬l(fā)射光的熒光通路檢測(cè)巨噬細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，每份樣本獲取5 000個(gè)巨噬細(xì)胞，數(shù)據(jù)可顯示于二維散點(diǎn)圖和直方圖中。在二維散點(diǎn)圖中可通過(guò)設(shè)門圈定未吞噬熒光微球的巨噬細(xì)胞群和吞噬熒光微球的巨噬細(xì)胞群；在直方圖中可通過(guò)標(biāo)尺標(biāo)定未吞噬熒光微球的巨噬細(xì)胞群和吞噬熒光微球的巨噬細(xì)胞群，全部數(shù)據(jù)經(jīng)相關(guān)軟件分析未吞噬熒光微球的巨噬細(xì)胞和吞噬不同數(shù)量熒光微球的巨噬細(xì)胞的比例[11]。④考察雞紅細(xì)胞對(duì)流式細(xì)胞術(shù)-熒光微球雙標(biāo)法的影響實(shí)驗(yàn)[12]：同流式細(xì)胞術(shù)-熒光微球法的相關(guān)操作，同時(shí)做1組不加5%雞紅細(xì)胞的供試品組高劑量組、供試品組低劑量組和正常對(duì)照組。⑤判定標(biāo)準(zhǔn)：應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，其中吞噬率采用卡方檢驗(yàn)，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行吞噬指數(shù)兩兩比較，如供試品組的吞噬率或吞噬指數(shù)與正常對(duì)照組的吞噬率或吞噬指數(shù)比較，有顯著性差異，方可判定該供試品效力實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)-免疫雙標(biāo)法(熒光微球+熒光抗體) ①制備樣品：將紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架溶于生理鹽水中，分別制成質(zhì)量濃度為100和50 μg/mL的紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架樣品溶液。將檢疫合格的BALB/C鼠，隨機(jī)分為供試品高劑量組(100 μg/mL)、供試品低劑量組(50 μg/mL)和正常對(duì)照組。供試品組分別于第1天和第6天腹腔注射紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架樣品溶液0.2 mL/(只·次)；末次注射后第4天，取供試品高劑量組、供試品低劑量組和正常對(duì)照組小鼠，依次放入裝有乙醚棉球的離心管，麻醉至小鼠不再掙扎。將小鼠放入裝有75%乙醇的燒杯中，浸泡消毒3 min后，將小鼠放入紫外滅菌后的超凈臺(tái)上，手術(shù)暴露腹腔膜，通過(guò)腹腔壁注入3 mL生理鹽水。反復(fù)按摩小鼠腹部后，分別吸取腹腔液2.0 mL，備用。②制備熒光微球：將羧酸基修飾熒光微球用BSA溶液稀釋，制備羧酸基修飾熒光微球BSA溶液，避光孵育30 min后，超聲5 min。③操作：將超聲后的羧酸基修飾熒光微球BSA溶液，均勻分配到6孔板上，同時(shí)準(zhǔn)確加入獲得的腹腔液，沖勻微球，上下左右平行移動(dòng)6孔板，使液體充分混合，然后置于生化培養(yǎng)箱中避光孵育2.5 h；將培養(yǎng)后的6孔板取出，棄上清，加入生理鹽水洗滌，用細(xì)胞刮刮取細(xì)胞，吸入EP管中，并加入F480抗體[13]混勻，經(jīng)過(guò)濾器過(guò)濾，取濾液。④流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分析[14]：分別根據(jù)F480熒光抗體和同型抗體細(xì)胞對(duì)R1門進(jìn)行調(diào)整，確定R1門后其他操作同2.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分析。⑤判定標(biāo)準(zhǔn)：應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，其中吞噬率采用卡方檢驗(yàn)、吞噬指數(shù)兩兩比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，如供試品組的吞噬率或吞噬指數(shù)與正常對(duì)照組的吞噬率或吞噬指數(shù)比較，有顯著性差異，方可判定該供試品效力實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 原方法-顯微鏡觀察方法

檢疫合格的BALB/C鼠，進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，取三批外用紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架產(chǎn)品，批號(hào)為201605001、201701001、201806001，每次隨機(jī)分成供試品高劑量組、供試品低劑量和正常對(duì)照組3組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1～3。

表1 201605001批次外用紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架顯微鏡法測(cè)定結(jié)果

表2 201701001批次外用紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架顯微鏡法測(cè)定結(jié)果

表3 201806001批次外用紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架顯微鏡法測(cè)定結(jié)果

由表1～3可知，采用成熟的顯微鏡法，三批次外用紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架，高、低劑量供試品組與正常對(duì)照組比較吞噬率明顯升高(P<0.01)、吞噬指數(shù)明顯增大[15](P<0.01)，判定結(jié)果為陽(yáng)性。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)-熒光微球法[16]

檢疫合格的BALB/C鼠，進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，取三批外用紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架產(chǎn)品，批號(hào)為201605001、201701001、201806001，每次隨機(jī)分成供試品高劑量、供試品低劑量和正常對(duì)照組3組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4～6。

由表4～6可知，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，第1次實(shí)驗(yàn)100和200 μg/mL供試品組與正常對(duì)照組比較呈吞噬率明顯升高(P<0.05)，吞噬指數(shù)明顯增大(P<0.01)(表4)；而第2次實(shí)驗(yàn)100和200 μg/mL供試品組與正常對(duì)照組比較呈吞噬率明顯降低(P<0.05、P<0.01)，吞噬指數(shù)明顯減小(P<0.01)(表5)；第3次實(shí)驗(yàn)100和200 μg/mL供試品組與正常對(duì)照組比較呈吞噬指數(shù)明顯升高(P<0.01、P<0.05)(表6)，檢驗(yàn)結(jié)果不穩(wěn)定。

表4 流式細(xì)胞術(shù)-熒光微球法第1次實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表5 流式細(xì)胞術(shù)-熒光微球法第2次實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表6 流式細(xì)胞術(shù)-熒光微球法第3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 雞紅細(xì)胞對(duì)流式細(xì)胞術(shù)-熒光微球法的影響

加入雞紅細(xì)胞的影響實(shí)驗(yàn)，檢疫合格的BALB/C鼠，進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)分成供試品高劑量組、供試品低劑量組和正常對(duì)照組3組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表7。由表7可見，各組在加或未加雞紅細(xì)胞處理后，吞噬率和吞噬指數(shù)數(shù)值差異較大，如正常對(duì)照組未加雞紅細(xì)胞處理的吞噬率為32.60%±0.09%，約為加雞紅細(xì)胞處理(12.10%±0.04%)的2倍以上。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，5%雞紅細(xì)胞對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬熒光微球有干擾，使得最終獲得的數(shù)據(jù)偏小。因此，流式細(xì)胞術(shù)熒光微球雙標(biāo)法不添加雞紅細(xì)胞。

表7 雞紅細(xì)胞對(duì)流式細(xì)胞術(shù)-熒光微球法的影響

2.4 流式細(xì)胞術(shù)-免疫雙標(biāo)法(熒光微球+熒光抗體)

檢疫合格的BALB/C鼠，進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，取三批外用紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架產(chǎn)品，批號(hào)為201605001、201701001、201806001，每次隨機(jī)分成供試品高劑量組、供試品低劑量組和正常對(duì)照組3組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別見圖1與表8、圖2與表9、圖3與表10。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)-免疫雙標(biāo)法(熒光微球+熒光抗體)檢測(cè)數(shù)據(jù)(201605001)

表8 流式細(xì)胞術(shù)-免疫雙標(biāo)法(熒光微球+熒光抗體)檢測(cè)數(shù)據(jù)(201605001)

圖2 流式細(xì)胞術(shù)-免疫雙標(biāo)法(熒光微球+熒光抗體)檢測(cè)數(shù)據(jù)(201701001)

表9 流式細(xì)胞術(shù)-免疫雙標(biāo)法(熒光微球+熒光抗體)檢測(cè)數(shù)據(jù)(201701001)

表10 流式細(xì)胞術(shù)-免疫雙標(biāo)法(熒光微球+熒光抗體)檢測(cè)數(shù)據(jù)(201806001)

圖3 流式細(xì)胞術(shù)-免疫雙標(biāo)法(熒光微球+熒光抗體)檢測(cè)數(shù)據(jù)(201806001)

在流式細(xì)胞術(shù)-熒光微球法基礎(chǔ)上，加入F480熒光抗體，流式細(xì)胞術(shù)-免疫雙標(biāo)法(熒光微球+熒光抗體)檢驗(yàn)結(jié)果由表8～10可見，供試品組的吞噬率或吞噬指數(shù)與正常對(duì)照組的吞噬率或吞噬指數(shù)比較，三批外用紅色諾卡氏菌細(xì)胞壁骨架，高/低劑量供試品組與正常對(duì)照組比較吞噬率均明顯升高(P<0.01)，吞噬指數(shù)明顯增大(P<0.01、P<0.05)，有顯著性差異，判定該供試品效力實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性。

3 討 論

流式細(xì)胞儀利用熒光抗體與單克隆抗體技術(shù)結(jié)合的標(biāo)記技術(shù)，保證檢測(cè)的靈敏度和特異性，利用計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)流動(dòng)的單細(xì)胞懸液中單個(gè)細(xì)胞的多個(gè)參數(shù)信號(hào)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，保證了檢測(cè)速度和統(tǒng)計(jì)分析精確度[18]。

以上述兩種流式細(xì)胞術(shù)的實(shí)驗(yàn)方法來(lái)分析，流式細(xì)胞術(shù)-免疫雙標(biāo)法(熒光微球+熒光抗體)比流式細(xì)胞術(shù)-熒光微球法檢測(cè)更為穩(wěn)定，檢測(cè)結(jié)果重復(fù)性較好。熒光微球能夠?qū)哂型淌晒δ艿木奘杉?xì)胞進(jìn)行識(shí)別[19]，但檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性較差。加入的F480熒光抗體(成熟小鼠巨噬細(xì)胞標(biāo)志物，EMR1)，也稱小鼠含生長(zhǎng)因子樣模體黏液樣激素樣受體，是一種細(xì)胞表面糖蛋白，是成熟小鼠巨噬細(xì)胞表面特異性標(biāo)志物抗體，可用于標(biāo)記小鼠巨噬細(xì)胞，增加了流式細(xì)胞儀收集巨噬細(xì)胞的準(zhǔn)確性，兩者結(jié)合應(yīng)用更能準(zhǔn)確反映供試品對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的作用。流式細(xì)胞術(shù)-免疫雙標(biāo)法(熒光微球+熒光抗體)獲取的巨噬細(xì)胞數(shù)量5 000個(gè)遠(yuǎn)多于顯微鏡計(jì)數(shù)的200個(gè)巨噬細(xì)胞，數(shù)據(jù)獲得快，且客觀。

檢測(cè)巨噬細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)結(jié)果以統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)來(lái)判斷，其中吞噬率采用卡方檢驗(yàn)，吞噬指數(shù)兩兩比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，如供試品組的吞噬率或吞噬指數(shù)與正常對(duì)照組的吞噬率或吞噬指數(shù)比較，有顯著性差異，方可判定該供試品效力實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性。

顯微鏡法通過(guò)目視多個(gè)顯微視野，觀察計(jì)數(shù)200個(gè)巨噬細(xì)胞是否吞噬及吞噬的數(shù)量，以吞噬率及吞噬指數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)值來(lái)判定是否有效。而流式細(xì)胞術(shù)-免疫雙標(biāo)法(熒光微球+熒光抗體)一次性計(jì)數(shù)5 000個(gè)巨噬細(xì)胞，根據(jù)熒光抗體標(biāo)記技術(shù)，統(tǒng)計(jì)巨噬細(xì)胞吞噬情況。檢測(cè)數(shù)據(jù)以統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，判定藥品對(duì)比對(duì)照組的吞噬效力的結(jié)果是否有效。兩種方法計(jì)數(shù)方式不同，統(tǒng)計(jì)原理不同，判定結(jié)果的方式也不同，因此不需要用顯微鏡法和吞噬率及吞噬指數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)值來(lái)要求流式細(xì)胞術(shù)-免疫雙標(biāo)法(熒光微球+熒光抗體)。

鑒于巨噬細(xì)胞體外檢測(cè)的特殊性，利用流式細(xì)胞儀開展檢驗(yàn)產(chǎn)品的巨噬細(xì)胞吞噬情況，是具有可行性的，但目前檢驗(yàn)數(shù)據(jù)及檢驗(yàn)方法還需進(jìn)一步確認(rèn)，需更多的上機(jī)磨合，保證檢測(cè)的準(zhǔn)確性及科學(xué)性，本研究提出的方法可為該項(xiàng)檢驗(yàn)提供參考。