陳 渏，楊雅麗, 陳 旭, 王 杰, 周嘉裕, 廖 海

(西南交通大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 成都 610031)

新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)是繼重癥急性呼吸綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)與中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)之后出現(xiàn)的又一種高傳染性冠狀病毒。SARS-CoV-2的基因組中至少含有6個(gè)開(kāi)放閱讀框，分別編碼S-蛋白(spike protein)、M膜蛋白、E包膜蛋白、N核衣殼蛋白以及多種復(fù)制轉(zhuǎn)錄酶。其中，S-蛋白能夠與人體細(xì)胞表面的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)發(fā)生特異性相互作用，決定了SARS-CoV-2入侵宿主的親和能力及組織特異性[1-2]。由于ACE2廣泛分布于人類(lèi)呼吸道、心臟、腎臟、睪丸與胃腸道，推測(cè)SARS-CoV-2的作用靶器官可能多樣化[3-5]。相較于SARS-CoV，SARS-CoV-2傳染性更強(qiáng)，推測(cè)其與S-蛋白和ACE2的親和力更高[6-7]。比較SARS-CoV-2與SARS-CoV的S-蛋白，發(fā)現(xiàn)有27處氨基酸殘基發(fā)生了改變，其中有6個(gè)氨基酸位于受體結(jié)合區(qū)(Receptor binding domain，RBD)。這些改變有可能賦予新型冠狀病毒的S-蛋白獨(dú)特的三維結(jié)構(gòu)特性，進(jìn)而影響(或增強(qiáng))其與ACE2 的相互作用。與此同時(shí)，由于S-蛋白在侵染過(guò)程中的核心地位，其成為預(yù)防及治療新型冠狀病毒的單抗或疫苗開(kāi)發(fā)的重要靶點(diǎn)。例如，Yang等[8]獲得了靶向RBD(位于S-蛋白的319～545位氨基酸殘基)的重組疫苗，能夠有效抑制RBD與ACE2的結(jié)合，從而阻斷SARS-Cov-2假病毒和SARS-Cov-2活病毒的感染。Zhu等[9]利用攜帶S-蛋白基因的腺病毒載體，注射入人體后，誘導(dǎo)產(chǎn)生S-蛋白抗體。為了更好地開(kāi)展S-蛋白的結(jié)構(gòu)與功能研究，篩選更有效的SARS-CoV-2疫苗與抗體，急需建立S-蛋白的高效表達(dá)體系，確?？蒲腥藛T獲得足量的S-蛋白。然而，不同生物常常具有不同的密碼子偏好性，往往傾向于使用一種或幾種特定的同義密碼子。分析密碼子偏好性，從中篩選最優(yōu)密碼子，對(duì)于提高重組蛋白質(zhì)的表達(dá)效率是不可或缺的。此外，密碼子的偏好性分析對(duì)揭示物種間或某一物種家族間的基因進(jìn)化規(guī)律也具有指導(dǎo)價(jià)值[10]。本研究從NCBI中收集包括SARS-CoV-2在內(nèi)的71條(51條SARS-CoV-2，20條其他類(lèi)型的冠狀病毒)S-蛋白的CDS序列，對(duì)其開(kāi)展密碼子偏好性分析，最后進(jìn)行了初步的密碼子優(yōu)化與表達(dá)驗(yàn)證，旨在為S-蛋白基因的重組表達(dá)篩選最適表達(dá)系統(tǒng)，并從密碼子偏好性的角度，對(duì)SARS-CoV-2開(kāi)展系統(tǒng)進(jìn)化分析。

1 材料與方法

1.1 材料

數(shù)據(jù)來(lái)源 S-蛋白基因來(lái)源于GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)，登錄序號(hào)見(jiàn)表1。大腸埃希菌(Escherichiacoli)、酵母菌(Saccharomycescerevisiae)等模式生物的基因組密碼子偏好性數(shù)據(jù)來(lái)源于密碼子使用數(shù)據(jù)庫(kù)(Codon Usage Database)(http://www.kazusa.or.jp/codon/)。分析51條SARS-CoV-2病毒的S-蛋白基因序列，發(fā)現(xiàn)其核苷酸序列高度相似(大于99%)，因此選取1條具有代表性的序列(如2019新冠病毒MN908947.3)開(kāi)展后續(xù)分析。

表1 冠狀病毒S-蛋白基因序列編號(hào)

1.2 方法

1.2.1 S-蛋白基因的密碼子偏好性分析 采用 CodonW 軟件和EMBOSS在線(xiàn)程序?qū)跔畈《維-蛋白的RSCU、有效密碼子數(shù)(Effective Number of Codon, ENc)、密碼子 G/C 含量 GC、密碼子第三位 G/C 含量 GC3s、密碼子適應(yīng)指數(shù)(Codon adaptation index，CAI)等密碼子偏好性參數(shù)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析。RSCU被定義為在編碼氨基酸的若干同義密碼子中，某一特定密碼子的相對(duì)使用概率。若RSCU 為1，則表明該密碼子無(wú)偏好性；若其值大于1，則表明其相對(duì)使用頻率較高；若其值小于1，則說(shuō)明其相對(duì)使用頻率較低[11-12]。ENc 值能夠反映密碼子家族中同義密碼子非均衡使用的偏好程度，其值介于 20～61 之間，越接近于 20，說(shuō)明偏好性越強(qiáng)。用各個(gè)冠狀病毒基因的ENc及GC3s值構(gòu)建散點(diǎn)圖和ENc-GC3s期望曲線(xiàn)(ENc=2+GC3s+29/[GC3s2+(1-GC3s)2])，各點(diǎn)與期望曲線(xiàn)的相對(duì)位置可以反映出密碼子偏好性的形成是由于堿基突變還是自然選擇[13-15]。若某一基因的密碼子偏好性受堿基突變影響較大時(shí)，其 ENc-GC3s 點(diǎn)將分布于期望曲線(xiàn)附近；若其受自然選擇影響較大時(shí)，則會(huì)分布在偏離期望曲線(xiàn)較遠(yuǎn)的位置[16-18]。

1.2.2 S-蛋白基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)及基于RSCU值的相關(guān)聚類(lèi)分析 通過(guò)MEGA軟件，采用鄰接法(Neighbor-joining)構(gòu)建冠狀病毒S-蛋白基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，重復(fù)次數(shù)設(shè)為1 000。利用SPSS軟件組間聯(lián)結(jié)法對(duì)各基因的RSCU值進(jìn)行系統(tǒng)聚類(lèi)分析。

1.2.3 適合S-蛋白基因表達(dá)的外源宿主 利用Codon W計(jì)算大腸埃希菌、酵母、λ噬菌體等模式生物基因組的密碼子使用頻率，并利用SPSS軟件與SARS-CoV-2的S-蛋白基因的密碼子使用頻率進(jìn)行比較，確定其合適的外源表達(dá)系統(tǒng)和遺傳轉(zhuǎn)化受體。

1.2.4 新冠病毒S-蛋白的RBD區(qū)域的原核表達(dá) 參考大腸埃希菌基因組的密碼子偏好性，對(duì)S-蛋白的RBD(Arg128至Pro398，共271個(gè)氨基酸殘基)區(qū)域進(jìn)行密碼子優(yōu)化，同時(shí)在RBD區(qū)域的5′-端引入EcoR Ⅰ酶切位點(diǎn)，3′-端引入TAA終止密碼與XhoⅠ酶切位點(diǎn)，由南京集思慧遠(yuǎn)生物科技有限公司完成該RBD片段全合成。合成的RBD片段與pGEX-4T-1載體經(jīng)EcoR Ⅰ與XhoⅠ雙酶切、連接形成pGEX-4T-1-RBD重組載體。提取pGEX-4T-1-RBD重組載體，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌Arctic-Express，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至菌液OD值0.6～0.7，加入IPTG 使其終濃度為0.5 mmol/L，11 ℃、160 r/min誘導(dǎo)表達(dá)12 h。表達(dá)完成后，培養(yǎng)物在室溫條件下，10 000 r/min，10 min離心2次，棄上清，用 PBS重懸菌體沉淀。重懸液進(jìn)行超聲波破碎后，分別取上清液(10 μL)與沉淀液加入上樣緩沖液重懸。最后采用12% SDS-PAGE和考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 冠狀病毒的S-蛋白基因同義密碼子相對(duì)使用度分析

基于21條冠狀病毒S-蛋白基因的RSCU值制作熱圖(圖1)。結(jié)果顯示有28個(gè)密碼子具有偏好性，分別為UUU、UUA、UUG、UCU、UCA、UAU、UAA、UGU、CUU、CCU、CCA、CAU、CAA、CGU、AUU、ACU、ACA、AAU、AAA、AGU、AGA、AGG、GUU、GCU、GCA、GAU、GAA和GGU。其中RSCU≥2的有CCU、GUU與GGU，最優(yōu)密碼子為UAA，其RSCU值為3.00，表明冠狀病毒傾向于UAA作為終止密碼子。RSCU≤0.5的密碼子有17個(gè)，分別為UUC、UCG、CUA、CCC、CAC、CGC、CGG、ACC、ACG、AGC、GCC、GCG、GGG、UGA、UAG、CGA和CCG，表明以上17個(gè)密碼子使用頻率較低。

圖1 冠狀病毒S-蛋白基因的RSCU熱圖

2.2 冠狀病毒S-蛋白基因偏好性相關(guān)參數(shù)比較分析

由表2可知，大部分冠狀病毒的ENc值低于50，其中扁顱蝠冠狀病毒的ENc值最低，僅為40.97；僅有β、文鳥(niǎo)、知更鳥(niǎo)、麻雀和伏翼蝠冠狀病毒的ENc值高于50，表明冠狀病毒S-蛋白基因的密碼子偏好性較弱。不同冠狀病毒的CAI值相差不大，均處在0.2～0.3之間，說(shuō)明冠狀病毒的S-蛋白基因的表達(dá)強(qiáng)度偏低。除知更鳥(niǎo)冠狀病毒GC含量46.6%，GC3s值47.6%較高外，其他冠狀病毒GC含量介于36.0%～42.3%之間，GC3s值介于22.0%～37.6%之間，表明冠狀病毒S-蛋白基因?qū)A基A和T有更強(qiáng)的偏好性。

表2 S-蛋白基因偏好性相關(guān)參數(shù)

2.3 SARS-CoV-2密碼子偏好性分析

相較于冠狀病毒的密碼子偏好性整體分析結(jié)果，SARS-CoV-2具有偏好性的密碼子有28個(gè)，偏好性極強(qiáng)(RSCU>2)的密碼子有7個(gè)(增加了UCU、UAA、CUU、AGA與GCU)，最優(yōu)密碼子也為UAA。SARS-CoV-2的GC、GC3s、CAI與ENc值等密碼子偏好性參數(shù)與SARS的S-蛋白較為接近。其GC含量與GC3s值分別為37.3%與25.1%，CAI與ENc值分別為0.226與44.15，表明SARS-CoV-2的S-蛋白基因偏向于A/U編碼，且密碼子偏好性較弱。

2.4 ENc-plot圖分析

ENc-plot圖(圖2)顯示，除知更鳥(niǎo)冠狀病毒S-蛋白基因遠(yuǎn)離期望曲線(xiàn)，其余冠狀病毒的S-蛋白基因均分布于期望曲線(xiàn)附近，表明冠狀病毒的S-蛋白基因密碼子偏好性的形成主要受到堿基突變的影響，自然選擇的影響較小。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV-2和SARS不僅位于期望曲線(xiàn)較近，且緊密靠近，表明兩者密碼子偏好性形成具有高度相似性。

圖2 冠狀病毒S-蛋白基因的ENc-plot分析

2.5 基于CDS序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)和基于RSCU值的聚類(lèi)

通過(guò)鄰接法構(gòu)建了冠狀病毒S-蛋白基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，該進(jìn)化樹(shù)具有較高的自展值，可信度較高，能夠用于分析冠狀病毒S-蛋白基因的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系(圖3A)。21種不同來(lái)源的冠狀病毒聚類(lèi)為二簇，第一簇由哺乳動(dòng)物為宿主的冠狀病毒組成，第二簇包括了鳥(niǎo)類(lèi)與部分以哺乳動(dòng)物為宿主的冠狀病毒。MERS、SARS與SARS-CoV-2聚類(lèi)在第一簇中較近的位置，其中SARS-CoV-2與SARS在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中靠得最近，表明SARS-CoV-2與SARS具有最近的親緣關(guān)系，而與MERS親緣關(guān)系稍遠(yuǎn)。

在基于RSCU值的SPSS聚類(lèi)(圖3B)中，21條冠狀病毒S-蛋白基因被聚為兩類(lèi)。其中，第一類(lèi)由畫(huà)眉等4種鳥(niǎo)類(lèi)冠狀病毒和雪貂冠狀病毒組成，第二類(lèi)由SARS-CoV-2等13種哺乳動(dòng)物冠狀病毒和火雞冠狀病毒組成，相較于CDS序列，基于RSCU的聚類(lèi)更適合用于冠狀病毒的系統(tǒng)發(fā)育分析。兩種聚類(lèi)結(jié)果中，SARS-CoV-2、SARS與MERS表現(xiàn)出相似的聚類(lèi)結(jié)果，表明SARS-CoV-2與SARS的親緣關(guān)系最近，可能來(lái)源于同一個(gè)祖先冠狀病毒，這為 SARS-CoV-2的系統(tǒng)發(fā)育與溯源提供了參考。

圖3 冠狀病毒S-蛋白基因RSCU值聚類(lèi)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果

2.6 SARS-CoV-2的S-蛋白基因與不同模式生物的密碼子偏好性比較

比較不同模式生物基因組與SARS-CoV-2的S-蛋白基因的密碼子使用頻率，將比值<0.5和>2的密碼子視為使用頻率差異較大的密碼子。結(jié)果顯示，SARS-CoV-2的S-蛋白基因密碼子與大腸埃希菌、噬菌體與釀酒酵母相比，使用頻率差異較大的密碼子數(shù)分別為28、27與15，表明釀酒酵母更適合作為新冠病毒S-蛋白基因的外源表達(dá)載體。

2.7 RBD區(qū)域的原核表達(dá)

由于SARS-CoV-2的S-蛋白與大腸埃希菌有較多的差異密碼子，若以大腸埃希菌為表達(dá)宿主，需要進(jìn)行密碼子優(yōu)化。根據(jù)本研究的分析結(jié)果，對(duì)S-蛋白的RBD區(qū)域密碼子完成了優(yōu)化、改造及全基因合成，成功構(gòu)建了pGEX-4T-1-RBD重組載體。pGEX-4T-1載體帶有GST標(biāo)簽，因此重組蛋白的理論分子量為57.89 kDa。由圖4可知，相較于未誘導(dǎo)的大腸埃希菌，含有pGEX-4T-1-RBD的重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，產(chǎn)生了一條較明顯的蛋白條帶(57 kDa)，與預(yù)期分子量一致，表明RBD片段獲得了成功誘導(dǎo)表達(dá)。

圖4 RBD區(qū)域表達(dá)的SDS-PAGE

3 討 論

密碼子作為基因密碼的基本單位和進(jìn)化單位，對(duì)于其偏好特點(diǎn)的分析與計(jì)算需要依賴(lài)生物信息學(xué)的發(fā)展。本研究使用一些常用的生物信息軟件圍繞密碼子使用模式，對(duì)51條SARS-CoV-2的S-蛋白基因密碼子偏好性及其與以往報(bào)道的20條其他物種的冠狀病毒S-蛋白基因的進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，冠狀病毒S-蛋白基因中有17個(gè)非優(yōu)勢(shì)密碼子，這些密碼子即成為未來(lái)密碼子改造的重點(diǎn)區(qū)域。ENc值是評(píng)判密碼子偏好強(qiáng)弱的通用指標(biāo)，本研究發(fā)現(xiàn)，冠狀病毒S-蛋白基因的ENc值在44左右，密碼子偏好性總體一般。這種現(xiàn)象可能與冠狀病毒的多宿主性有關(guān)，以往報(bào)道多種哺乳動(dòng)物及鳥(niǎo)類(lèi)為其宿主，因此低偏好性可能有利于冠狀病毒的跨物種傳播。絕大部分冠狀病毒的GC含量介于36.0%～42.3%之間，GC3s值介于22.0%～37.6%之間，表明冠狀病毒S-蛋白基因?qū)A基A和T有更強(qiáng)的偏好性，相似結(jié)果也出現(xiàn)在28個(gè)優(yōu)勢(shì)密碼子與全基因組堿基組成中[19]。

SARS-CoV-2與SARS具有相近的密碼子偏好性參數(shù)，這不僅體現(xiàn)在兩者具有相近的GC含量、GC3s、CAI與ENc值，并且在ENc-plot曲線(xiàn)上也位于相近位置。更有趣的是，在基于RSCU值的聚類(lèi)樹(shù)及基于CDS序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中，SARS-CoV-2與SARS均緊密聚類(lèi)，該結(jié)果不僅表明二者的親緣關(guān)系最近，也表明二者可能起源于某一種祖先冠狀病毒。由于SARS-CoV-2與SARS的親緣關(guān)系最近，因此推測(cè)二者可能擁有同一類(lèi)中間宿主，即蝙蝠。Zhou等[20]基于冠狀病毒全基因組序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，也證實(shí)SARS-CoV-2與SARS具有最近的親緣關(guān)系，這與本研究結(jié)果相同。然而，陳嘉源等[21]基于冠狀病毒Nankai基因CDS序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，卻發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2與 SARS 冠狀病毒相距較遠(yuǎn)，究其原因可能有兩點(diǎn)：①在進(jìn)化過(guò)程中，冠狀病毒的不同基因或基因組不同區(qū)域受到了不同的選擇壓力；②不同病毒在進(jìn)化過(guò)程中，出現(xiàn)了基因的平行轉(zhuǎn)移。

根據(jù)本研究的分析結(jié)果，對(duì)S-蛋白的RBD區(qū)域的密碼子完成了優(yōu)化與改造，并在E.coli中成功實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)，驗(yàn)證了分析結(jié)果。下一步將對(duì)RBD的表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化篩選，以提高RBD的可溶性表達(dá)。