范三紅，王嬌嬌，李佳妮，白寶清

（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，特色植物資源研究與利用山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030006）

據(jù)報道，長期高脂膳食使得高血脂癥（即血脂代謝異常）發(fā)病率呈逐漸上升趨勢[1]。高血脂癥常常伴有糖尿病、動脈粥樣硬化和肝臟、腎臟等組織沉積過多過氧化脂質(zhì)等并發(fā)癥[2-4]，嚴(yán)重影響人體健康。臨床上常用他汀類藥物治療高血脂癥[5]，同時，從天然可食資源中探索能調(diào)節(jié)人體血脂代謝水平的成分也已成為研究熱點(diǎn)。辣椒屬茄科草本植物，營養(yǎng)豐富，在我國分布較廣且資源豐富[6]。辣椒紅色素是存在于辣椒中的一類天然色素，包括辣椒紅素、辣椒玉紅素、玉米黃質(zhì)素和β-胡蘿卜素等，被廣泛應(yīng)用于食品添加劑和彩妝領(lǐng)域[7]。辣椒紅色素屬于類胡蘿卜素復(fù)烯同類，是VA的前體，研究發(fā)現(xiàn)其具有抗氧化活性[8-9]。辣椒堿類物質(zhì)是辣椒中的辛辣成分，包括辣椒堿、二氫辣椒堿、降二氫辣椒堿等一系列物質(zhì)，具有抑菌抗炎、減肥、調(diào)節(jié)血糖、血脂等藥理作用[10]。

當(dāng)前大多數(shù)研究都是針對辣椒堿的降血脂活性，較少有針對辣椒紅色素抗氧化活性的報道，聶乾忠等[11]發(fā)現(xiàn)辣椒素類物質(zhì)對高脂血癥大鼠有降血脂和膽固醇的作用。Manjunatha等[12]研究表明姜黃素和辣椒堿的協(xié)同作用可以減輕高脂喂養(yǎng)大鼠的血脂代謝紊亂，并能減緩由高脂血癥引起的氧化應(yīng)激損失。陳朝軍等[13]研究花椒麻素和辣椒素對實(shí)驗(yàn)性高血脂癥大鼠血脂水平的協(xié)同作用，結(jié)果顯示，不同質(zhì)量比的花椒麻素和辣椒素有降血脂和延緩體質(zhì)量增加的作用。牟文燕等[14]研究不同水平辣椒紅色素對血鸚鵡生長、體形、體色和抗氧化能力的影響，發(fā)現(xiàn)1%辣椒紅色素組血鸚鵡的過氧化氫酶（catalase，CAT）活力顯著高于對照組（P＜0.05）。

本實(shí)驗(yàn)通過飼喂高脂飼料建立高血脂小鼠模型，探討辣椒紅色素的體內(nèi)抗氧化活性和辣椒堿的降血脂作用，以期為辣椒資源的深層探索提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF級昆明小鼠64 只，體質(zhì)量（23±2）g，由山西省第三人民醫(yī)院提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2019-0010。

基礎(chǔ)飼料山西省第三人民醫(yī)院；高脂飼料南京盛民科研動物公司；辣椒粉末（編號s4）山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所。

乙腈、二氯甲烷、石油醚（沸點(diǎn)60～90 ℃）、K2HPO4（均為分析純），甲醇、乙腈、二氯甲烷（均為色譜純），辣椒紅素（純度98%）、玉米黃質(zhì)素（純度97%）、β-胡蘿卜素（純度97%）、辣椒堿（純度99%）、二氫辣椒堿（純度98%）、降二氫辣椒堿（純度98%）北京百靈威科技有限公司；血清總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、CAT、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）測定試劑盒南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

WJX-800A型高速多功能粉碎機(jī)上海緣沃工貿(mào)有限公司；AL204電子分析天平梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SB-5200DT型超聲波清洗器寧波新芝生物科技股份有限公司；1260 Infinity II高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀美國安捷倫公司；Synergy H1多功能酶標(biāo)儀美國伯騰儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 辣椒紅色素和辣椒堿的制備

干辣椒經(jīng)粉碎機(jī)粉碎處理，過45 目篩，得到干辣椒粉末。采用三相鹽析體系萃取分離辣椒紅色素和辣椒堿，具體步驟如下：向20 mL的具塞試管中加入0.5 g辣椒粉末、4 g磷酸氫二鉀、4 g乙腈、3.2 g石油醚和8.8 g蒸餾水，充分混勻，45 ℃下超聲輔助萃取10 min。靜置待三相分離后，辣椒紅色素聚集在上相，辣椒堿類物質(zhì)富集于中相，收集上相和中相萃取液，即為辣椒紅色素和辣椒堿提取液，濃縮后冷凍干燥，備用。

1.3.2 辣椒紅色素和辣椒堿各組分含量測定

將上相和中相萃取液過0.4 5 μ m 有機(jī)濾膜，進(jìn)行HPLC分析。辣椒紅色素HPLC條件：辣椒紅色素分析色譜柱ZORBAX RX-SIL（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：甲醇-乙腈-二氯甲烷體積比5∶10∶85，流速為1 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測波長475 nm。辣椒堿HPLC條件：色譜柱ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：體積分?jǐn)?shù)70%甲醇溶液，流速為1 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測波長280 nm。以峰面積外標(biāo)法定量。標(biāo)準(zhǔn)品溶液與樣品溶液進(jìn)樣量均為10 μL。

1.3.3 動物分組及給藥處理

小鼠的給藥劑量由實(shí)驗(yàn)室前期藥效學(xué)動物實(shí)驗(yàn)得出的灌胃劑量確定。SPF級昆明種雄性小鼠64 只，飼養(yǎng)于無毒塑料鼠盒中，每盒8 只，飼喂基礎(chǔ)詞料、蒸餾水，室內(nèi)溫度22～25 ℃、相對濕度40%～60%，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，稱體質(zhì)量，剔除體質(zhì)量異常的小鼠后。隨機(jī)分為8 組，每組8 只。每天給辣椒紅色素低、中、高劑量組灌胃辣椒紅色素，辣椒堿低、中、高劑量組灌胃辣椒堿，空白對照組和高脂模型組灌胃生理鹽水，連續(xù)飼養(yǎng)4 周，實(shí)驗(yàn)期間小鼠自由飲水和進(jìn)食。具體分組及給藥方法見表1。

表 1 動物分組及飼料、灌胃條件（n＝8）Table 1 Animal grouping and feeding and gavage conditions (n= 8)

1.3.4 指標(biāo)測定

1.3.4.1 血清和組織樣品制備

實(shí)驗(yàn)第28天末次給藥后，斷食不斷水12 h，稱量體質(zhì)量后摘眼球取全血，低溫冷凍離心機(jī)4 000 r/min離心15 min，分離血清，于-20 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩Ｐ∈笕⊙?，頸椎脫臼處死并摘取肝臟，經(jīng)冷生理鹽水沖洗后用濾紙吸干后稱質(zhì)量，用鋁箔紙包好裝入樣品袋，-80 ℃保存待用。測定時取一定量的組織，按1∶9（m/V）的比例加入預(yù)冷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9%生理鹽水，在冰上用玻璃勻漿器迅速研磨成10%的組織勻漿，冷凍離心機(jī)4 000 r/min離心10 min后取上清液，-20 ℃保存待測。

1.3.4.2 小鼠體質(zhì)量及肝臟指數(shù)測定

每周固定時間，飼喂前稱量每只小鼠體質(zhì)量并記錄。最后解剖小鼠后稱量各肝臟質(zhì)量，肝臟指數(shù)按照下式計算。

式中：m為末次稱取的小鼠體質(zhì)量/g；m1為小鼠肝臟質(zhì)量/g。

1.3.4.3 小鼠體內(nèi)抗氧化指標(biāo)測定

取備用的小鼠肝組織勻漿，小鼠肝臟組織中MDA含量和GSH-Px、SOD、CAT活力的測定按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.4.4 小鼠體內(nèi)血脂水平測定

取適量存放于EP管中處理后的小鼠血清，血清中TG、TC、HDL-C、LDL-C濃度按試劑盒說明書進(jìn)行測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析與處理

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒紅色素和辣椒堿各組分分析結(jié)果

表 2 辣椒紅色素和辣椒堿各組分含量Table 2 Composition of capsanthin and capsaicin prepared in this study

由表2可知，經(jīng)HPLC測定辣椒（編號s4）中辣椒紅色素總含量和辣椒堿總含量分別為0.686 mg/g和3.230 mg/g，辣椒堿含量遠(yuǎn)多于辣椒紅色素。HPLC分析鑒定出辣椒紅色素的3 種組分，分別為β-胡蘿卜素、辣椒紅素和玉米黃質(zhì)素，辣椒堿同樣鑒定出3 種組分，分別為降二氫辣椒堿、辣椒堿和二氫辣椒堿。其中辣椒紅色素中辣椒紅素為主要的色素組分，含量為0.632 mg/g，辣椒堿為總辣椒堿的主要組分，含量為1.852 mg/g，二氫辣椒堿含量也較多，為1.014 mg/g。

2.2 辣椒紅色素和辣椒堿對小鼠平均攝食量的影響

表 3 不同階段小鼠平均攝食量Table 3 Average food intake of mice during gavage

辣椒紅色素和辣椒堿對受試小鼠攝食量的影響如表3所示，在整個實(shí)驗(yàn)周期中，小鼠攝食量稍有波動，整體趨于平穩(wěn)。在同一階段，小鼠平均攝食量在4～5 g，組間攝食量均無顯著性差異，由此可以排除實(shí)驗(yàn)過程中由于攝食量增加或減少而引起的包括體質(zhì)量、血脂水平和抗氧化活性等變化。

2.3 辣椒紅色素和辣椒堿對小鼠體質(zhì)量及肝臟指數(shù)的影響

表 4 辣椒紅色素和辣椒堿對小鼠體質(zhì)量、肝臟指數(shù)的影響Table 4 Effects of capsaicin and capsaicin on body mass and liver index in mice

在整個實(shí)驗(yàn)過程中，各組實(shí)驗(yàn)小鼠生長良好，體質(zhì)量均隨時間延長逐漸增長。由表4可知，實(shí)驗(yàn)前各組小鼠質(zhì)量之間無顯著差異（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，模型組小鼠的體質(zhì)量極顯著高于空白對照組（P＜0.01），說明高脂模型的建立對小鼠體質(zhì)量有極顯著的影響。實(shí)驗(yàn)組小鼠體質(zhì)量顯著低于高脂模型組小鼠（P＜0.05）。灌胃2 周開始，小鼠體質(zhì)量增長速率減慢。灌胃4 周后，辣椒紅色素低、中劑量組小鼠體質(zhì)量顯著低于高脂模型組小鼠（P＜0.05），辣椒紅色素高劑量組小鼠體質(zhì)量與高脂模型組相比，差異極顯著（P＜0.01）。灌胃4 周后，辣椒堿各劑量組小鼠體質(zhì)量均極顯著低于高脂模型組（P＜0.01），且隨著辣椒堿劑量的增大，對小鼠體質(zhì)量的降低作用越明顯；辣椒紅色素各劑量組體質(zhì)量也有所下降，說明辣椒紅色素和辣椒堿可以一定程度上減緩小鼠體質(zhì)量的增長。同時可以看出，同劑量組下辣椒堿對小鼠體質(zhì)量的影響更顯著。與空白對照組比較，模型組的肝臟指數(shù)極顯著升高（P＜0.01）；而與高脂模型組比較，辣椒堿中、高劑量組肝臟系數(shù)分別為顯著（P＜0.05）和極顯著降低（P＜0.01）。

2.4 辣椒紅色素、辣椒堿對小鼠肝臟抗氧化水平的影響

圖 1 辣椒紅色素和辣椒堿對小鼠肝臟抗氧化活性的影響Fig. 1 Effects of capsanthin and capsaicin on antioxidant system parameters in the liver of mice

高血脂癥動物往往組織中的脂質(zhì)過氧化物含量較高，GSH-Px是一種重要的還原脂質(zhì)過氧化物的酶類，能催化過氧化氫分解，可防止細(xì)胞膜與其他生物組織免受過氧化損傷[15]。由圖1A可知，高脂模型組GSH-Px活力與空白對照組相比顯著降低（P＜0.05）。辣椒紅色素和辣椒堿各劑量組與高脂模型組相比均有升高。辣椒紅色素低、中劑量組與模型組相比顯著升高（P＜0.05），辣椒紅色素高劑量組GSH-Px活力與高脂模型組差異極顯著（P＜0.01），其活力與空白對照組相差僅4.21%，同時各實(shí)驗(yàn)組小鼠肝臟GSH-Px活力與辣椒紅色素灌胃劑量呈正相關(guān)；辣椒堿各劑量組中僅高劑量組的GSH-Px活力極顯著高于模型組（P＜0.01），其活力高于模型組52.12%。這表明辣椒紅色素和辣椒堿提取組分能一定程度幫助氧化損傷機(jī)體的GSH-Px活力恢復(fù)至正常水平，提高機(jī)體的抗氧化能力[16]。

SOD是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，可以保護(hù)細(xì)胞免受自由基攻擊[17]。如圖1B所示，高脂模型組小鼠SOD活力下降，與空白對照組相比差異極顯著（P＜0.01），表明長期飼喂高脂飼料能夠使小鼠肝組織的抗氧化能力降低[18]。辣椒紅色素低、中劑量組小鼠SOD活力相差不大，辣椒紅色素高劑量組小鼠SOD活力較高脂模型組上升了31.87%（P＜0.01）；辣椒堿中、高劑量組SOD活力與模型組相比分別升高了9.59%和15.61%（P＜0.05），這說明一定劑量的辣椒紅色素和辣椒堿組分均可以提高小鼠體內(nèi)SOD的活性，但同劑量組下，辣椒紅色素組效果更好。

CAT在動物肝臟組織中活力較高，在機(jī)體內(nèi)具有抗氧化作用[19]。從圖1C可以看出，高脂模型組小鼠CAT活力顯著下降（P＜0.05），辣椒堿高劑量組較模型組的CAT活力增加了21.86%；辣椒紅色素低、中劑量組差異顯著，其CAT活力分別增加了3.10%、12.11%（P＜0.05），辣椒紅色素高劑量組CAT活力則極顯著增加了32.72%（P＜0.01），表明辣椒紅色素各劑量組小鼠肝臟組織中SOD活力呈明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，這與文獻(xiàn)[20]的結(jié)論一致。

MDA是膜脂過氧化的主要產(chǎn)物之一，其含量代表肝臟的損傷程度，與細(xì)胞氧化損傷的程度呈正相關(guān)[21]。從圖1D可以得出，與空白對照組相比較，模型組小鼠肝臟組織中MDA含量極顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比較，辣椒堿中、高劑量組MDA含量分別降低28.98%、35.80%（P＜0.05）；辣椒紅色素低、中、高劑量組MDA含量分別降低26.70%、34.94%、41.19%，說明辣椒紅色素和辣椒堿各組分能不同程度降低小鼠體內(nèi)MDA含量，減輕機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，從而保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的完整性[23]。并且同為高劑量組，辣椒紅色素降低MDA含量比辣椒堿組分高5.39%，隨辣椒紅色素和辣椒堿劑量的增大，其對機(jī)體的保護(hù)作用增強(qiáng)。

2.5 辣椒紅色素、辣椒堿對小鼠血脂水平的影響

高血脂癥是血脂代謝異常所致，其主要表現(xiàn)為血清中TC、TG和LDL-C水平過高或HDL-C水平過低[24]。血清中TC、TG水平的異常增加與心血管疾病的發(fā)生呈正相關(guān)。其中HDL-C可作為逆向轉(zhuǎn)運(yùn)TC的載體，其水平增加可加快血液中TC的分解[23]。

圖 2 辣椒紅色素和辣椒堿對小鼠血脂水平的影響Fig. 2 Effects of capsanthin and capsaicin on blood lipid levels in mice

如圖2所示，模型組小鼠與空白對照組小鼠比較，TC、TG、LDL-C濃度極顯著升高（P＜0.01），HDL-C濃度極顯著降低（P＜0.01），表明高脂模型組小鼠出現(xiàn)明顯的血脂代謝紊亂[25]。

由圖2A可知，與高脂模型組相比，辣椒紅色素高劑量組和辣椒堿高劑量組小鼠血清中TC濃度分別降低了17.17%（P＜0.05）和23.26%（P＜0.01）。從圖2B可以看出，辣椒堿各劑量組小鼠與高脂模型組小鼠的TG濃度相比差異顯著（P＜0.05），與空白對照組對比無顯著差異（P＞0.05），且小鼠血清中TG濃度與辣椒堿劑量呈負(fù)相關(guān)，即辣椒堿劑量越高，小鼠血清中TG濃度越低，而對于辣椒紅色素各劑量組TG濃度均有所下降，但僅高劑量組小鼠與模型組比差異顯著（P＜0.05）。

如圖2C所示，辣椒紅色素高劑量組小鼠HDL-C濃度較模型組升高了12.99%，辣椒堿低、中劑量組小鼠與高脂模型組小鼠HDL-C濃度相比顯著升高（P＜0.05），辣椒堿高劑量組小鼠HDL-C濃度較模型組極顯著升高

57.14%（P＜0.01）。

從圖2D可以得出，辣椒堿各劑量組小鼠血清中LDL-C濃度與高脂模型組相比均降低，其中辣椒堿低、中劑量組與模型組相比差異顯著（P＜0.05），辣椒堿高劑量組差異極顯著（P＜0.01），且隨著辣椒堿劑量的升高，小鼠血清中LDL-C濃度降低；辣椒紅色素中、高劑量組LDL-C濃度與模型組相比顯著下降（P＜0.05），辣椒紅色素高劑量組和辣椒堿高劑量組小鼠較模型組相比，其LDL-C濃度分別降低了15.32%和24.77%。綜合來看，辣椒紅色素和辣椒堿各劑量組均有一定降低血脂功效，并具有統(tǒng)計學(xué)意義，但辣椒堿富集組分在調(diào)節(jié)小鼠血脂水平上作用更明顯，這與文獻(xiàn)[26]的結(jié)論一致。

3 討 論

以天然植物資源辣椒為原料，以三相萃取分離同步得到的辣椒紅色素和辣椒堿提取物為研究對象，通過飼喂高脂飼料建立高血脂癥小鼠模型，經(jīng)不同劑量的辣椒紅色素和辣椒堿灌胃干預(yù)后，對肝臟組織和血清中相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行測定。

GSH-Px、SOD、CAT這3 種酶是體內(nèi)重要的抗氧化酶，其活性高低可間接反映機(jī)體清除氧自由基的能力，MDA是體內(nèi)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物之一，其含量與機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度成正比[27-28]。結(jié)果顯示，經(jīng)辣椒紅色素和辣椒堿富集組分灌胃干預(yù)的實(shí)驗(yàn)組小鼠肝組織中的GSH-Px、SOD和CAT活力均高于高脂模型組小鼠，同時各劑量組小鼠肝臟中的MDA含量降低，可初步表明辣椒紅色素和辣椒堿提取物具有一定的體內(nèi)抗氧化活性，降低脂質(zhì)過氧化程度。但對比來看，辣椒紅色素組分的抗氧化作用更明顯，這可能是由于辣椒紅色素組分均為類胡蘿卜素（VA前體），結(jié)構(gòu)中含有共軛雙鍵，其中辣椒紅素單組分還含有共軛酮基和環(huán)戊烷環(huán)，使得辣椒紅色素富集組分的抗氧化功效更加顯著[29]。通過測定辣椒紅色素和辣椒堿各劑量組小鼠血清的血脂水平，結(jié)果表明，經(jīng)辣椒紅色素和辣椒堿富集組分灌胃的實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中的TC、TG和LDL-C濃度明顯低于高脂模型組，HDL-C濃度與模型組相比顯著升高[30-31]，表明辣椒紅色素和辣椒堿富集組分具有調(diào)節(jié)高血脂癥小鼠血脂代謝異常的功效，其中辣椒堿類物質(zhì)效果更佳，這是因?yàn)槔苯穳A可以激活瞬時電位香草酸1受體，而瞬時電位香草酸1在調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝以及保護(hù)心血管系統(tǒng)等方面具有一定作用[32]。這為開發(fā)天然降脂、抗氧化產(chǎn)品，擴(kuò)大辣椒資源的利用提供了新思路和理論參考。