宋玉欣，龔志華，張 嬌，賀 麟，李蘭蘭，陳美艷，張楊玲，屈青云，肖文軍

（湖南農業(yè)大學 茶學教育部重點實驗室，國家植物功能成分利用工程技術研究中心，湖南 長沙 410128）

隨著現(xiàn)代飲食結構的變化，公眾在提倡“低脂飲食”的同時，海鮮、魚類、肉類、奶類等動物蛋白食品的攝入與日俱增。研究表明，攝入相對過量的動物性蛋白易導致慢性疾病的發(fā)生[1]，增加健康風險，可能出現(xiàn)抑郁、焦慮癥狀，嚴重時可能產生自殺行為[2-3]。中樞神經遞質是抑郁發(fā)生、發(fā)展的重要病理物質[4]，研究發(fā)現(xiàn)多巴胺（dopamine，DA）[5]、5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）[6]、去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）[7]水平的降低，極易導致情緒低落以及動力、食欲明顯下降。雖然市面上有許多抗抑郁的西藥，但其常伴有毒副作用，因此，從植物中尋找安全、天然、高效的產物來防治抑郁、焦慮已成為社會需求和研究熱點[8]。研究發(fā)現(xiàn)，合歡皮[9]、北五味子[10]、香附[11]等植物源天然產物具有抗焦慮作用，能降低鼠腦內中樞神經遞質含量，改善自主行為。

新食品原料L-茶氨酸是主要存在于茶葉中的一種非蛋白質氨基酸，具有抗氧化[12]、降血壓[13]、預防糖尿病[14]、提高免疫力[15-16]、提高學習能力[17]、改善大腦認知能力[18]等多種生理功能，且安全、無毒副作用。研究表明，L-茶氨酸的谷氨酰γ-乙基酰胺結構與谷氨酰胺的谷氨酸γ-羧基酰胺結構十分類似，同時其分解代謝產物谷氨酸是合成谷氨酰胺的前體物質，可通過改變機體中谷氨酸、谷氨酰胺濃度達到神經保護的作用[19]。目前關于自主行為的營養(yǎng)干預研究主要集中于通過噪聲刺激、潮濕墊料、夾尾等[20]方法建立大鼠或小鼠慢性不可預知溫和應激模型，鮮見高蛋白飲食所致抑郁或焦慮的營養(yǎng)干預研究。為此，本研究通過對不同水平高蛋白飲食的SPF級6 周齡SD雄性大鼠進行40 d的灌胃實驗，采用曠場和明暗箱行為學實驗觀察以及生理生化表征的方法，探究不同劑量L-茶氨酸對不同水平高蛋白飲食SD大鼠自主行為的影響，以期為高蛋白飲食的多元化營養(yǎng)干預及L-茶氨酸深層次利用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF級6 周齡雄性SD大鼠160 只，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，生產許可證號：SCXK（湘）2016-0002，實驗動物質量合格證編號：43004700063552。

普通維持飼料（蛋白質供能比20%）、低水平高蛋白飼料（蛋白質供能比30%）、中水平高蛋白飼料（蛋白質供能比40%）及高水平高蛋白飼料（蛋白質供能比50%）[21]均由北京華阜康生物科技有限公司提供，飼料配方如表1所示。

表 1 不同水平高蛋白飼料組分及三大供能營養(yǎng)素比例Table 1 Components and proportions of three major energy-supplying nutrients in high-protein diets

L-茶氨酸（純度≥98%）湖南省三福生物科技公司；0.9%氯化鈉注射液湖南科倫制藥有限公司；5-HT、NE、DA酶聯(lián)免疫吸附測定（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒上海茁彩生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

多功能酶標儀賽默飛世爾（上海）儀器有限公司；MIKRO22R型臺式冷凍離心機德國Hettich公司；自制曠場箱（100 cm×100 cm×50 cm）的無蓋木箱，箱子底部用實線劃分為2 5 個長寬均為20 cm×20 cm的小方格，中間9 格為中央?yún)^(qū)域，其余16 格為外周區(qū)域）、自制明暗箱（實驗裝置由兩個40 cm×40 cm×40 cm的正方形紙箱組成，其中一個紙箱為暗箱，全遮光；另一個紙箱去蓋；中間由一條不透光的紙質通道連接，使大鼠可以無阻礙地在兩個紙箱走動）。

1.3 方法

1.3.1 動物實驗設計

參考文獻[17,22-23]結果確定L-茶氨酸劑量。將160 只大鼠根據(jù)體質量隨機分為16 組，每組10 只，每3、3、4 只飼養(yǎng)于同一籠中，籠底鋪墊楊木墊料，大鼠于溫度（25±2）℃、相對濕度50%～70%、普通維持飼料、自由飲食飲水的條件下適應性飼養(yǎng)7 d，依據(jù)飼料種類及L-茶氨酸低（100 mg/（kgmb·d））、中（200 mg/（kgmb·d））、高（400 mg/（kgmb·d））灌胃劑量的區(qū)別，將各組分別編號：普通維持飼料組（P2CK）、普通維持飼料+L-茶氨酸低劑量組（P 2 L L）、普通維持飼料+L-茶氨酸中劑量組（P 2 M L）、普通維持飼料+L-茶氨酸高劑量組（P2HL）；低水平高蛋白飼料組（P3CK）、低水平高蛋白飼料+L-茶氨酸低劑量組（P3LL）、低水平高蛋白飼料+L-茶氨酸中劑量組（P3ML）、低水平高蛋白飼料+L-茶氨酸高劑量組（P3HL）；中水平高蛋白飼料組（P4CK）、中水平高蛋白飼料+L-茶氨酸低劑量組（P4LL）、中水平高蛋白飼料+L-茶氨酸中劑量組（P4ML）、中水平高蛋白飼料+L-茶氨酸高劑量組（P4HL）；高水平高蛋白飼料組（P5CK）、高水平高蛋白飼料+L-茶氨酸低劑量組（P5LL）、高水平高蛋白飼料+L-茶氨酸中劑量組（P5ML）、高水平高蛋白飼料+L-茶氨酸高劑量組（P5HL）。

將L-茶氨酸干預組的相應L-茶氨酸劑量溶解于生理鹽水中，依據(jù)體質量進行灌胃，其他組灌胃生理鹽水；每日上午8∶00灌胃，連續(xù)灌胃40 d。每只大鼠隔天稱體質量、記錄，及時按體質量調整灌胃量，每日定時稱量當日剩余日糧并定時添加日糧。

1.3.2 明暗箱實驗

實驗第40天給藥3 h后進行明暗箱實驗，將整組大鼠放在暗箱中，頭部朝明箱，立刻關閉蓋子，給予無光條件，通過攝像裝置觀察并記錄5 min內從暗箱到明箱的大鼠穿越次數(shù)以及在明箱的活動時間。實驗過程中保持外界環(huán)境安靜，每次放入大鼠前要清理糞便并噴灑酒精去除氣味，以便進行下一組測試，確保每次檢測結果的準確性。

1.3.3 曠場實驗

在實驗第40天下午進行曠場實驗，保持室內安靜，捏住大鼠尾巴，輕放于格內迅速離開，將大鼠置于中央方格同一位置，且每次放置時確保頭部固定同一朝向；通過攝像裝置觀察并記錄大鼠在5 min內活動的水平移動格數(shù)和后肢站立次數(shù)，結束后將大鼠放回飼養(yǎng)籠中，清掃糞便等殘留物，噴灑酒精消毒并擦拭干凈，以防影響后續(xù)實驗。

1.3.4 樣本采集

所有行為學觀察實驗完成后，大鼠禁食12 h。第41天，用質量分數(shù)10%水合氯醛溶液麻醉大鼠，腹部主動脈取血。血樣在室溫下靜置30 min后，3 500 r/min離心10 min，吸取上清液，分裝移至1 mL潔凈EP管，置于-80 ℃保存，留待檢測。

1.3.5 生化指標檢測

按試劑盒說明書要求，檢測大鼠血清DA、5-HT、NE質量濃度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 25.0軟件對每組數(shù)據(jù)進行方差分析，各組間采用最小顯著性差異法和鄧肯檢驗（P＜0.05表示有顯著性差異，為具有統(tǒng)計學意義），統(tǒng)計結果以平均值±標準差表示；對于不符合正態(tài)分布或正態(tài)轉化無效的數(shù)據(jù)，采用Kruskal-Wallis秩和檢驗。使用GraphPad Prism 8.0.2軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 L-茶氨酸對高蛋白飲食SD大鼠體質量及采食量的影響

表 2 不同水平高蛋白飲食對SD大鼠體質量和采食量的影響Table 2 Effect of high-protein diet on body mass and feed intake of SD rats

表2表明，與P2CK相比，P3CK、P4CK、P5CK各組大鼠的平均日采食量均顯著減少（P＜0.05），主要原因是高蛋白飲食可引起大鼠厭食[24]。在第1天各組間體質量差異不顯著，經過40 d不同水平蛋白飼料的喂養(yǎng)后，與P2CK相比，隨蛋白質供能比的增加，不同水平高蛋白飼料組體質量逐漸減少，其中P5CK體質量減少達顯著水平（P＜0.05），說明高水平高蛋白飲食可產生飽食感，減少采食量，減輕大鼠體質量，這與French等[25]的結論一致。

表 3 L-茶氨酸對高蛋白飲食SD大鼠體質量和采食量的影響Table 3 Effect of L-theanine on body mass and feed intake of SD rats fed with high-protein diet

如表3所示，通過不同劑量L-茶氨酸對不同水平高蛋白飲食大鼠營養(yǎng)干預40 d后，與P5CK相比，P5LL、P5ML、P5HL各組大鼠的平均日采食量均減少，但不顯著，而其體質量則有所增加，其中P5LL的體質量增加顯著（P＜0.05），說明L-茶氨酸對高蛋白飲食SD大鼠具有增加體質量的作用。

2.2 L-茶氨酸對高蛋白飲食SD大鼠曠場自主行為的影響

圖 1 L-茶氨酸對高蛋白飲食SD大鼠曠場自主行為的影響Fig. 1 Effect of L-theanine on autonomous behavior of SD rats fed high-protein diet in open field

曠場實驗是檢測動物情緒行為的一種常用的方法，其結果的升高或降低會有不同的行為學解釋[26]。圖1A表明，與P2CK相比，P5CK大鼠的水平移動格數(shù)減少，但差異不顯著；與P3CK、P4CK相比，P5CK大鼠的水平移動格數(shù)顯著減少（P＜0.05）。由圖1C可知，與P3CK、P4CK相比，P5CK大鼠在曠場箱的后肢站立次數(shù)顯著減少（P＜0.05），這可能是低水平高蛋白飲食有利于提高認知能力，而高水平高蛋白飲食可能導致自主行為障礙的緣故[27]。

圖1B顯示，與P5CK相比，P5LL、P5ML大鼠的水平移動格數(shù)顯著增加（P＜0.05），同時由圖1D可知，P5LL、P5ML、P5HL各組大鼠在曠場箱的后肢站立次數(shù)均增加，其中P5LL、P5ML顯著增加（P＜0.05），說明L-茶氨酸的干預可以改善大鼠因高蛋白飲食所致的曠場自主行為[28]。

2.3 L-茶氨酸對高蛋白飲食SD大鼠明暗箱自主行為的影響

圖 2 L-茶氨酸對高蛋白飲食SD大鼠明暗箱自主行為的影響Fig. 2 Effect of L-theanine on autonomic behavior of SD rats fed high-protein diet in light/dark boxes

明暗箱是利用實驗動物喜歡探究新奇環(huán)境，但又因厭惡明室中的亮光而退卻，由此形成矛盾沖突狀態(tài)，使穿箱次數(shù)減少，以此評價是否抑郁的行為學實驗[29]。圖2表明，與P2CK相比，P5CK大鼠在明箱中的停留時間顯著縮短，進入明箱的次數(shù)顯著減少（P＜0.05）；L-茶氨酸干預40 d后，P5LL大鼠在明箱中的停留時間顯著延長（P＜0.05），同時P5LL、P5ML、P5HL各組大鼠進入明箱的次數(shù)顯著增加（P＜0.05），說明L-茶氨酸具有改善大鼠因高蛋白飲食所致的明暗箱自主行為的作用。

2.4 L-茶氨酸對高蛋白飲食SD大鼠單胺類神經遞質類物質的影響

表 4 L-茶氨酸對不同水平高蛋白飲食SD大鼠血清中單胺類神經遞質類物質的影響Table 4 Effect of L-theanine on monoamine neurotransmitters in serum of SD rats fed high-protein diet

單胺類神經遞質假說[30]中，抑郁癥的發(fā)病與DA、5-HT、NE等單胺類神經遞質及其受體含量、敏感度等密切相關。表4表明，與P2CK相比，P5CK大鼠血清中DA、5-HT、NE質量濃度減少無顯著差異，但L-茶氨酸干預后，與P5CK相比，P5LL、P5ML、P5HL各組大鼠血清中DA、NE質量濃度顯著升高（P＜0.05），且P5LL大鼠血清中5-HT質量濃度顯著升高（P＜0.05），說明L-茶氨酸能夠提高高蛋白飲食大鼠血清中單胺類神經遞質DA、5-HT、NE的質量濃度，達到抗抑郁效果，這與彭彬等[28]的研究結果一致。

3 討 論

隨著生活水平的提高，人體攝入蛋白質的比例逐漸增大，長期高蛋白的攝入對人體的影響值得探討。有研究指出，長期進食高蛋白食物可以產生腎臟損害[31]、肝臟損害[32]、降低免疫力[33]、增加患糖尿病風險[34]等，還會破壞血腦屏障的完整性[35]，導致認知水平下降、神經元變性[36]等神經疾病。

人體研究結果表明L-茶氨酸對高焦慮傾向的受試者有更好的抗抑郁或焦慮作用，能夠起到神經保護功能[37]；Yin Cui等[38]通過小鼠行為學實驗證明L-茶氨酸對小鼠的抗抑郁作用可能是由中樞單胺能神經遞質系統(tǒng)介導；彭彬等[28]通過建立慢性不可預見性溫和應激抑郁大鼠模型，發(fā)現(xiàn)L-茶氨酸組大鼠DA、5-HT、NE的質量濃度增高。同時，大多現(xiàn)有的抗抑郁藥物主要是作用于單胺類神經遞質系統(tǒng)[30]，在神經遞質調節(jié)中起關鍵信號突觸傳遞作用的單胺類神經遞質DA、5-HT、NE的釋放水平與抑郁癥的發(fā)生有直接關系?？梢姡琇-茶氨酸具有神經保護，改善因抑郁、焦慮等所致自主行為的作用。

為了明確何種高蛋白飲食水平可誘導焦慮或抑郁自主行為，本研究設置了4 個不同蛋白水平飼料組。通過對體質量測定、行為學觀察及生化指標檢測發(fā)現(xiàn)，只有蛋白質供能比為50%的高水平高蛋白飲食對大鼠自主行為及神經遞質含量產生了顯著的不良影響。因此，結果中只涉及到L-茶氨酸干預高水平高蛋白組的數(shù)據(jù)。一方面，高水平高蛋白飲食大鼠進入曠場箱的水平移動格數(shù)以及后肢站立次數(shù)均顯著減少（P＜0.05），說明大鼠對新環(huán)境的探索能力受到影響；進入明箱的次數(shù)以及在明箱中的時間也顯著縮短（P＜0.05），說明大鼠對新環(huán)境的好奇程度降低；L-茶氨酸干預能夠提高大鼠的探索能力，改善大鼠因高蛋白飲食所致的曠場和明暗箱自主行為。另一方面，各水平高蛋白飼料組大鼠血清中DA、5-HT、NE質量濃度無顯著差異，而L-茶氨酸干預的高蛋白飲食各組大鼠血清中DA、NE質量濃度顯著升高（P＜0.05），且P5LL組大鼠血清中5-HT質量濃度顯著升高（P＜0.05）。

因此，綜合本研究中L-茶氨酸對高蛋白飲食SD大鼠體質量、采食量以及在曠場和明暗箱中的自主行為影響結果，可以認為，低水平高蛋白飲食有利于提高認知能力，而高水平高蛋白飲食則可能導致抑郁、焦慮等自主行為障礙；同時L-茶氨酸的干預可以改善大鼠因高蛋白飲食所致自主行為障礙的作用。后續(xù)可通過轉錄組學、蛋白質組學、代謝組學等技術方法，從各組間的差異基因、蛋白及代謝產物等方面進行相關機制研究。

低水平高蛋白飲食有利于提高認知能力，而高水平高蛋白飲食則可能導致抑郁、焦慮等自主行為障礙，L-茶氨酸具有改善高蛋白飲食所致焦慮或抑郁SD大鼠自主行為的作用，其機制可能與單胺類神經遞質的代謝相關。