宋玉欣，龔志華，張 嬌，賀 麟，李蘭蘭，陳美艷，張楊玲，屈青云，肖文軍

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

隨著現(xiàn)代飲食結(jié)構(gòu)的變化，公眾在提倡“低脂飲食”的同時(shí)，海鮮、魚類、肉類、奶類等動(dòng)物蛋白食品的攝入與日俱增。研究表明，攝入相對(duì)過量的動(dòng)物性蛋白易導(dǎo)致慢性疾病的發(fā)生[1]，增加健康風(fēng)險(xiǎn)，可能出現(xiàn)抑郁、焦慮癥狀，嚴(yán)重時(shí)可能產(chǎn)生自殺行為[2-3]。中樞神經(jīng)遞質(zhì)是抑郁發(fā)生、發(fā)展的重要病理物質(zhì)[4]，研究發(fā)現(xiàn)多巴胺（dopamine，DA）[5]、5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）[6]、去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）[7]水平的降低，極易導(dǎo)致情緒低落以及動(dòng)力、食欲明顯下降。雖然市面上有許多抗抑郁的西藥，但其常伴有毒副作用，因此，從植物中尋找安全、天然、高效的產(chǎn)物來防治抑郁、焦慮已成為社會(huì)需求和研究熱點(diǎn)[8]。研究發(fā)現(xiàn)，合歡皮[9]、北五味子[10]、香附[11]等植物源天然產(chǎn)物具有抗焦慮作用，能降低鼠腦內(nèi)中樞神經(jīng)遞質(zhì)含量，改善自主行為。

新食品原料L-茶氨酸是主要存在于茶葉中的一種非蛋白質(zhì)氨基酸，具有抗氧化[12]、降血壓[13]、預(yù)防糖尿病[14]、提高免疫力[15-16]、提高學(xué)習(xí)能力[17]、改善大腦認(rèn)知能力[18]等多種生理功能，且安全、無毒副作用。研究表明，L-茶氨酸的谷氨酰γ-乙基酰胺結(jié)構(gòu)與谷氨酰胺的谷氨酸γ-羧基酰胺結(jié)構(gòu)十分類似，同時(shí)其分解代謝產(chǎn)物谷氨酸是合成谷氨酰胺的前體物質(zhì)，可通過改變機(jī)體中谷氨酸、谷氨酰胺濃度達(dá)到神經(jīng)保護(hù)的作用[19]。目前關(guān)于自主行為的營(yíng)養(yǎng)干預(yù)研究主要集中于通過噪聲刺激、潮濕墊料、夾尾等[20]方法建立大鼠或小鼠慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激模型，鮮見高蛋白飲食所致抑郁或焦慮的營(yíng)養(yǎng)干預(yù)研究。為此，本研究通過對(duì)不同水平高蛋白飲食的SPF級(jí)6 周齡SD雄性大鼠進(jìn)行40 d的灌胃實(shí)驗(yàn)，采用曠場(chǎng)和明暗箱行為學(xué)實(shí)驗(yàn)觀察以及生理生化表征的方法，探究不同劑量L-茶氨酸對(duì)不同水平高蛋白飲食SD大鼠自主行為的影響，以期為高蛋白飲食的多元化營(yíng)養(yǎng)干預(yù)及L-茶氨酸深層次利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

SPF級(jí)6 周齡雄性SD大鼠160 只，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2016-0002，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào)：43004700063552。

普通維持飼料（蛋白質(zhì)供能比20%）、低水平高蛋白飼料（蛋白質(zhì)供能比30%）、中水平高蛋白飼料（蛋白質(zhì)供能比40%）及高水平高蛋白飼料（蛋白質(zhì)供能比50%）[21]均由北京華阜康生物科技有限公司提供，飼料配方如表1所示。

表 1 不同水平高蛋白飼料組分及三大供能營(yíng)養(yǎng)素比例Table 1 Components and proportions of three major energy-supplying nutrients in high-protein diets

L-茶氨酸（純度≥98%）湖南省三福生物科技公司；0.9%氯化鈉注射液湖南科倫制藥有限公司；5-HT、NE、DA酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒上海茁彩生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

多功能酶標(biāo)儀賽默飛世爾（上海）儀器有限公司；MIKRO22R型臺(tái)式冷凍離心機(jī)德國(guó)Hettich公司；自制曠場(chǎng)箱（100 cm×100 cm×50 cm）的無蓋木箱，箱子底部用實(shí)線劃分為2 5 個(gè)長(zhǎng)寬均為20 cm×20 cm的小方格，中間9 格為中央?yún)^(qū)域，其余16 格為外周區(qū)域）、自制明暗箱（實(shí)驗(yàn)裝置由兩個(gè)40 cm×40 cm×40 cm的正方形紙箱組成，其中一個(gè)紙箱為暗箱，全遮光；另一個(gè)紙箱去蓋；中間由一條不透光的紙質(zhì)通道連接，使大鼠可以無阻礙地在兩個(gè)紙箱走動(dòng)）。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

參考文獻(xiàn)[17,22-23]結(jié)果確定L-茶氨酸劑量。將160 只大鼠根據(jù)體質(zhì)量隨機(jī)分為16 組，每組10 只，每3、3、4 只飼養(yǎng)于同一籠中，籠底鋪墊楊木墊料，大鼠于溫度（25±2）℃、相對(duì)濕度50%～70%、普通維持飼料、自由飲食飲水的條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，依據(jù)飼料種類及L-茶氨酸低（100 mg/（kgmb·d））、中（200 mg/（kgmb·d））、高（400 mg/（kgmb·d））灌胃劑量的區(qū)別，將各組分別編號(hào)：普通維持飼料組（P2CK）、普通維持飼料+L-茶氨酸低劑量組（P 2 L L）、普通維持飼料+L-茶氨酸中劑量組（P 2 M L）、普通維持飼料+L-茶氨酸高劑量組（P2HL）；低水平高蛋白飼料組（P3CK）、低水平高蛋白飼料+L-茶氨酸低劑量組（P3LL）、低水平高蛋白飼料+L-茶氨酸中劑量組（P3ML）、低水平高蛋白飼料+L-茶氨酸高劑量組（P3HL）；中水平高蛋白飼料組（P4CK）、中水平高蛋白飼料+L-茶氨酸低劑量組（P4LL）、中水平高蛋白飼料+L-茶氨酸中劑量組（P4ML）、中水平高蛋白飼料+L-茶氨酸高劑量組（P4HL）；高水平高蛋白飼料組（P5CK）、高水平高蛋白飼料+L-茶氨酸低劑量組（P5LL）、高水平高蛋白飼料+L-茶氨酸中劑量組（P5ML）、高水平高蛋白飼料+L-茶氨酸高劑量組（P5HL）。

將L-茶氨酸干預(yù)組的相應(yīng)L-茶氨酸劑量溶解于生理鹽水中，依據(jù)體質(zhì)量進(jìn)行灌胃，其他組灌胃生理鹽水；每日上午8∶00灌胃，連續(xù)灌胃40 d。每只大鼠隔天稱體質(zhì)量、記錄，及時(shí)按體質(zhì)量調(diào)整灌胃量，每日定時(shí)稱量當(dāng)日剩余日糧并定時(shí)添加日糧。

1.3.2 明暗箱實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)第40天給藥3 h后進(jìn)行明暗箱實(shí)驗(yàn)，將整組大鼠放在暗箱中，頭部朝明箱，立刻關(guān)閉蓋子，給予無光條件，通過攝像裝置觀察并記錄5 min內(nèi)從暗箱到明箱的大鼠穿越次數(shù)以及在明箱的活動(dòng)時(shí)間。實(shí)驗(yàn)過程中保持外界環(huán)境安靜，每次放入大鼠前要清理糞便并噴灑酒精去除氣味，以便進(jìn)行下一組測(cè)試，確保每次檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.3.3 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

在實(shí)驗(yàn)第40天下午進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)，保持室內(nèi)安靜，捏住大鼠尾巴，輕放于格內(nèi)迅速離開，將大鼠置于中央方格同一位置，且每次放置時(shí)確保頭部固定同一朝向；通過攝像裝置觀察并記錄大鼠在5 min內(nèi)活動(dòng)的水平移動(dòng)格數(shù)和后肢站立次數(shù)，結(jié)束后將大鼠放回飼養(yǎng)籠中，清掃糞便等殘留物，噴灑酒精消毒并擦拭干凈，以防影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 樣本采集

所有行為學(xué)觀察實(shí)驗(yàn)完成后，大鼠禁食12 h。第41天，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%水合氯醛溶液麻醉大鼠，腹部主動(dòng)脈取血。血樣在室溫下靜置30 min后，3 500 r/min離心10 min，吸取上清液，分裝移至1 mL潔凈EP管，置于-80 ℃保存，留待檢測(cè)。

1.3.5 生化指標(biāo)檢測(cè)

按試劑盒說明書要求，檢測(cè)大鼠血清DA、5-HT、NE質(zhì)量濃度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 25.0軟件對(duì)每組數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，各組間采用最小顯著性差異法和鄧肯檢驗(yàn)（P＜0.05表示有顯著性差異，為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義），統(tǒng)計(jì)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；對(duì)于不符合正態(tài)分布或正態(tài)轉(zhuǎn)化無效的數(shù)據(jù)，采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)。使用GraphPad Prism 8.0.2軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 L-茶氨酸對(duì)高蛋白飲食SD大鼠體質(zhì)量及采食量的影響

表 2 不同水平高蛋白飲食對(duì)SD大鼠體質(zhì)量和采食量的影響Table 2 Effect of high-protein diet on body mass and feed intake of SD rats

表2表明，與P2CK相比，P3CK、P4CK、P5CK各組大鼠的平均日采食量均顯著減少（P＜0.05），主要原因是高蛋白飲食可引起大鼠厭食[24]。在第1天各組間體質(zhì)量差異不顯著，經(jīng)過40 d不同水平蛋白飼料的喂養(yǎng)后，與P2CK相比，隨蛋白質(zhì)供能比的增加，不同水平高蛋白飼料組體質(zhì)量逐漸減少，其中P5CK體質(zhì)量減少達(dá)顯著水平（P＜0.05），說明高水平高蛋白飲食可產(chǎn)生飽食感，減少采食量，減輕大鼠體質(zhì)量，這與French等[25]的結(jié)論一致。

表 3 L-茶氨酸對(duì)高蛋白飲食SD大鼠體質(zhì)量和采食量的影響Table 3 Effect of L-theanine on body mass and feed intake of SD rats fed with high-protein diet

如表3所示，通過不同劑量L-茶氨酸對(duì)不同水平高蛋白飲食大鼠營(yíng)養(yǎng)干預(yù)40 d后，與P5CK相比，P5LL、P5ML、P5HL各組大鼠的平均日采食量均減少，但不顯著，而其體質(zhì)量則有所增加，其中P5LL的體質(zhì)量增加顯著（P＜0.05），說明L-茶氨酸對(duì)高蛋白飲食SD大鼠具有增加體質(zhì)量的作用。

2.2 L-茶氨酸對(duì)高蛋白飲食SD大鼠曠場(chǎng)自主行為的影響

圖 1 L-茶氨酸對(duì)高蛋白飲食SD大鼠曠場(chǎng)自主行為的影響Fig. 1 Effect of L-theanine on autonomous behavior of SD rats fed high-protein diet in open field

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)是檢測(cè)動(dòng)物情緒行為的一種常用的方法，其結(jié)果的升高或降低會(huì)有不同的行為學(xué)解釋[26]。圖1A表明，與P2CK相比，P5CK大鼠的水平移動(dòng)格數(shù)減少，但差異不顯著；與P3CK、P4CK相比，P5CK大鼠的水平移動(dòng)格數(shù)顯著減少（P＜0.05）。由圖1C可知，與P3CK、P4CK相比，P5CK大鼠在曠場(chǎng)箱的后肢站立次數(shù)顯著減少（P＜0.05），這可能是低水平高蛋白飲食有利于提高認(rèn)知能力，而高水平高蛋白飲食可能導(dǎo)致自主行為障礙的緣故[27]。

圖1B顯示，與P5CK相比，P5LL、P5ML大鼠的水平移動(dòng)格數(shù)顯著增加（P＜0.05），同時(shí)由圖1D可知，P5LL、P5ML、P5HL各組大鼠在曠場(chǎng)箱的后肢站立次數(shù)均增加，其中P5LL、P5ML顯著增加（P＜0.05），說明L-茶氨酸的干預(yù)可以改善大鼠因高蛋白飲食所致的曠場(chǎng)自主行為[28]。

2.3 L-茶氨酸對(duì)高蛋白飲食SD大鼠明暗箱自主行為的影響

圖 2 L-茶氨酸對(duì)高蛋白飲食SD大鼠明暗箱自主行為的影響Fig. 2 Effect of L-theanine on autonomic behavior of SD rats fed high-protein diet in light/dark boxes

明暗箱是利用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物喜歡探究新奇環(huán)境，但又因厭惡明室中的亮光而退卻，由此形成矛盾沖突狀態(tài)，使穿箱次數(shù)減少，以此評(píng)價(jià)是否抑郁的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)[29]。圖2表明，與P2CK相比，P5CK大鼠在明箱中的停留時(shí)間顯著縮短，進(jìn)入明箱的次數(shù)顯著減少（P＜0.05）；L-茶氨酸干預(yù)40 d后，P5LL大鼠在明箱中的停留時(shí)間顯著延長(zhǎng)（P＜0.05），同時(shí)P5LL、P5ML、P5HL各組大鼠進(jìn)入明箱的次數(shù)顯著增加（P＜0.05），說明L-茶氨酸具有改善大鼠因高蛋白飲食所致的明暗箱自主行為的作用。

2.4 L-茶氨酸對(duì)高蛋白飲食SD大鼠單胺類神經(jīng)遞質(zhì)類物質(zhì)的影響

表 4 L-茶氨酸對(duì)不同水平高蛋白飲食SD大鼠血清中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)類物質(zhì)的影響Table 4 Effect of L-theanine on monoamine neurotransmitters in serum of SD rats fed high-protein diet

單胺類神經(jīng)遞質(zhì)假說[30]中，抑郁癥的發(fā)病與DA、5-HT、NE等單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其受體含量、敏感度等密切相關(guān)。表4表明，與P2CK相比，P5CK大鼠血清中DA、5-HT、NE質(zhì)量濃度減少無顯著差異，但L-茶氨酸干預(yù)后，與P5CK相比，P5LL、P5ML、P5HL各組大鼠血清中DA、NE質(zhì)量濃度顯著升高（P＜0.05），且P5LL大鼠血清中5-HT質(zhì)量濃度顯著升高（P＜0.05），說明L-茶氨酸能夠提高高蛋白飲食大鼠血清中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)DA、5-HT、NE的質(zhì)量濃度，達(dá)到抗抑郁效果，這與彭彬等[28]的研究結(jié)果一致。

3 討 論

隨著生活水平的提高，人體攝入蛋白質(zhì)的比例逐漸增大，長(zhǎng)期高蛋白的攝入對(duì)人體的影響值得探討。有研究指出，長(zhǎng)期進(jìn)食高蛋白食物可以產(chǎn)生腎臟損害[31]、肝臟損害[32]、降低免疫力[33]、增加患糖尿病風(fēng)險(xiǎn)[34]等，還會(huì)破壞血腦屏障的完整性[35]，導(dǎo)致認(rèn)知水平下降、神經(jīng)元變性[36]等神經(jīng)疾病。

人體研究結(jié)果表明L-茶氨酸對(duì)高焦慮傾向的受試者有更好的抗抑郁或焦慮作用，能夠起到神經(jīng)保護(hù)功能[37]；Yin Cui等[38]通過小鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)證明L-茶氨酸對(duì)小鼠的抗抑郁作用可能是由中樞單胺能神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)介導(dǎo)；彭彬等[28]通過建立慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激抑郁大鼠模型，發(fā)現(xiàn)L-茶氨酸組大鼠DA、5-HT、NE的質(zhì)量濃度增高。同時(shí)，大多現(xiàn)有的抗抑郁藥物主要是作用于單胺類神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)[30]，在神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵信號(hào)突觸傳遞作用的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)DA、5-HT、NE的釋放水平與抑郁癥的發(fā)生有直接關(guān)系?？梢?，L-茶氨酸具有神經(jīng)保護(hù)，改善因抑郁、焦慮等所致自主行為的作用。

為了明確何種高蛋白飲食水平可誘導(dǎo)焦慮或抑郁自主行為，本研究設(shè)置了4 個(gè)不同蛋白水平飼料組。通過對(duì)體質(zhì)量測(cè)定、行為學(xué)觀察及生化指標(biāo)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，只有蛋白質(zhì)供能比為50%的高水平高蛋白飲食對(duì)大鼠自主行為及神經(jīng)遞質(zhì)含量產(chǎn)生了顯著的不良影響。因此，結(jié)果中只涉及到L-茶氨酸干預(yù)高水平高蛋白組的數(shù)據(jù)。一方面，高水平高蛋白飲食大鼠進(jìn)入曠場(chǎng)箱的水平移動(dòng)格數(shù)以及后肢站立次數(shù)均顯著減少（P＜0.05），說明大鼠對(duì)新環(huán)境的探索能力受到影響；進(jìn)入明箱的次數(shù)以及在明箱中的時(shí)間也顯著縮短（P＜0.05），說明大鼠對(duì)新環(huán)境的好奇程度降低；L-茶氨酸干預(yù)能夠提高大鼠的探索能力，改善大鼠因高蛋白飲食所致的曠場(chǎng)和明暗箱自主行為。另一方面，各水平高蛋白飼料組大鼠血清中DA、5-HT、NE質(zhì)量濃度無顯著差異，而L-茶氨酸干預(yù)的高蛋白飲食各組大鼠血清中DA、NE質(zhì)量濃度顯著升高（P＜0.05），且P5LL組大鼠血清中5-HT質(zhì)量濃度顯著升高（P＜0.05）。

因此，綜合本研究中L-茶氨酸對(duì)高蛋白飲食SD大鼠體質(zhì)量、采食量以及在曠場(chǎng)和明暗箱中的自主行為影響結(jié)果，可以認(rèn)為，低水平高蛋白飲食有利于提高認(rèn)知能力，而高水平高蛋白飲食則可能導(dǎo)致抑郁、焦慮等自主行為障礙；同時(shí)L-茶氨酸的干預(yù)可以改善大鼠因高蛋白飲食所致自主行為障礙的作用。后續(xù)可通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等技術(shù)方法，從各組間的差異基因、蛋白及代謝產(chǎn)物等方面進(jìn)行相關(guān)機(jī)制研究。

低水平高蛋白飲食有利于提高認(rèn)知能力，而高水平高蛋白飲食則可能導(dǎo)致抑郁、焦慮等自主行為障礙，L-茶氨酸具有改善高蛋白飲食所致焦慮或抑郁SD大鼠自主行為的作用，其機(jī)制可能與單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的代謝相關(guān)。