王慶紅，譚明乾，齊子和，王海濤,

（1.大連工業(yè)大學食品學院，遼寧 大連 116034；2.國家海洋食品工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116034）

納米材料具有小尺寸效應、表面效應、高反應活性和量子效應[1-3]，對人類身體健康有著潛在的風險。隨著納米技術(shù)在食品領域的廣泛應用，人們越來越重視其可能導致的負面健康效應。目前研究主要集中在外源添加的納米粒子上[4-5]；除外源添加的納米粒子外，食品在加工過程中也可產(chǎn)生具有納米結(jié)構(gòu)的顆粒[6-8]，然而這一類食源性納米粒子的性質(zhì)還缺乏研究。

碳量子點（carbon quantum dots，CQDs）是一類新型納米結(jié)構(gòu)，以碳、氧、氫為主要組分，直徑一般小于10 nm，最先在純化碳納米管過程中發(fā)現(xiàn)[9]。Sk等[10]在焦糖中分離得到碳納米粒子，首次將CQDs與食品聯(lián)系起來。近期研究發(fā)現(xiàn)，CQDs在食品中分布廣泛；如Jiang Chengkun等[11]在雀巢咖啡中發(fā)現(xiàn)了CQDs；Song Xunyu等[12]報道了烤雞胸肉中的CQDs。食品中CQDs的形成與加工方式密切相關(guān)。熱加工是食品工業(yè)中常用的加工方式，高溫下食品組分發(fā)生復雜的相互作用，這些反應能夠?qū)е录{米顆粒的形成。納米材料相對比表面積較大，且表面自由能較高，能夠和其他分子通過氫鍵等發(fā)生相互作用。如烤魚中分離得到的CQDs能夠通過氫鍵與胃蛋白酶發(fā)生相互作用[13]。除蛋白質(zhì)外，食源性CQDs還能與金屬離子發(fā)生相互作用，如烤制牛肉中獲取的CQDs可以通過與鐵離子相互作用實現(xiàn)對鐵元素的載運[14]；牛肉湯中獲取的CQDs能夠和鋅離子相互作用[15]。

鎘是一種重金屬元素，具有明顯毒性，長期接觸鎘對人體健康有害[16]。鎘可以通過食物鏈傳遞，在器官中積累[17]。研究表明，鎘離子（Cd2+）對哺乳動物的器官，包括肺、腎、睪丸以及心血管、造血系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)都會造成損害[18]。魚類和軟體動物等水生生物對鎘具有極強的富集能力，可沿食物鏈轉(zhuǎn)移蓄積，具有隱藏性和不可逆性等特點[19]，是影響水產(chǎn)品食用安全的重要因素之一。貝類具有很強的富集重金屬的能力[20]，在貝類加工過程中，特別是在熱加工過程中可能會產(chǎn)生CQDs，這種納米結(jié)構(gòu)與貝類中的Cd2+發(fā)生相互作用，可能會影響鎘本身的毒性。本實驗采用蝦夷扇貝（Patinopecten yessoensis）作為研究對象，通過透射電子顯微鏡（transmission electron microscopy，TEM）觀察、X射線光電子能譜（X-ray photoelectron spectroscopy，XPS）分析、傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）分析等系統(tǒng)表征來源于蝦夷扇貝的CQDs，并采用等溫滴定量熱（isothermal titration calorimetry，ITC）法考察CQDs與Cd2+的相互作用，同時通過細胞毒性實驗評價CQDs對Cd2+毒性的影響，以期為深入認識食源性納米顆粒的性質(zhì)及其潛在的健康影響提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蝦夷扇貝購于大連市甘井子區(qū)仟和農(nóng)貿(mào)市場；大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤（pheochromocytoma，PC12）細胞獲取自中國科學院上海科學院細胞資源中心實驗室細胞庫。

乙酸乙酯天津市大茂化學試劑廠；溴化鉀北京百靈威科技有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基美國Gibco公司；胎牛血清北京四季青生物科技有限公司；青鏈霉素混合液（雙抗）美國Hycone公司；磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、噻唑藍（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT）北京寶希迪科技有限公司；體積分數(shù)30%過氧化氫大連博諾科技有限公司；活性氧（reactive oxygen species，ROS）測定試劑盒、線粒體膜電位檢測試劑盒南京建成生物工程研究所有限公司；細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒上海碧云天生物科技有限公司；實驗用水為超純水，電阻率18.2 MΩ·cm。

1.2 儀器與設備

Lambda 35紫外-可見光譜儀、FTIR儀美國PerkinElmer有限公司；F-2700熒光分光光度計日立（中國）有限公司；JEM-2100（UHR）TEM日本電子株式會社；Escalab 250Xi XPS儀美國賽默飛世爾科技公司；NU-437-400s超凈工作臺、NU-5810E二氧化碳培養(yǎng)箱美國Nuaire公司；FACSVerse流式細胞儀美國BD公司；Infinite M200多功能酶標儀、普通熒光酶標儀瑞士Tecan公司；XRD-7000S X射線衍射（X-ray diffraction，XRD）儀日本島津公司；FLS-980穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀英國愛丁堡儀器公司；Affinity ITC儀美國TA儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 CQDs的制備

取2 g蝦夷扇貝貝柱于反應釜中，加入7 mL去離子水，180 ℃加熱4 h。4 000 r/min離心5 min，收集上清液。上清液采用乙酸乙酯進行萃取后置于3 500 Da的透析袋內(nèi)于常溫下透析。收集透析袋外溶液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，使用500 Da的透析袋在常溫下透析，收集透析袋內(nèi)溶液，冷凍干燥，得到CQDs，于-20 ℃冰箱凍存。

1.3.2 CQDs的表征

以2,5-二羥基苯甲酸為基質(zhì)，通過基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）測定CQDs的分子質(zhì)量。將1 mg/mL CQDs水溶液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，滴至超薄碳膜網(wǎng)上，在室溫下干燥后使用TEM觀察CQDs形貌，加速電壓為200 kV。隨機選取TEM照片中100 個CQDs并測量其直徑，獲得CQDs的粒徑分布結(jié)果。采用XRD儀分析CQDs晶體結(jié)構(gòu)，分析條件：采用Cu靶，管壓30 kV、管流20 mA、掃描速率5（°）/min、衍射角度2θ范圍5°～80°。采用XPS儀分析CQDs的元素組成和表面基團，分析條件：單色X射線源Al Kα作為激發(fā)源，激發(fā)電壓1 486.6 eV，結(jié)合能用污染碳C1s（結(jié)合能284.8 eV）進行校準。采用紫外-可見吸收光譜儀對CQDs進行掃描，分析條件：掃描范圍700～200 nm、掃描速率1 200 nm/min，去離子水作為空白對照。采用熒光分光光度計測定CQDs熒光光譜，分析條件：狹縫寬度10 nm。通過穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀測定CQDs熒光壽命。采用壓片法測定CQDs FTIR光譜，溴化鉀為背景，掃描范圍500～4 000 cm-1。

1.3.3 CQDs與Cd2+相互作用分析

使用PBS分別配制成濃度4 mmol/L CQDs溶液和10 mmol/L Cd2+溶液，經(jīng)0.22 μm微孔膜過濾后置于真空脫氣機中進行脫氣處理。將350 μL CQDs溶液注入ITC儀樣品池中，130 μL Cd2+溶液加入注射器中。溫度25 ℃、滴定速率180 s/滴、滴定間隔300 s、滴定40 滴、攪拌速率80 r/min。通過NanoAnalyze軟件Independent Binding模式分析擬合數(shù)據(jù)，確定CQDs和Cd2+間相互作用的熱力學參數(shù)（結(jié)合常數(shù)（Ka）、結(jié)合位點數(shù)（n）、焓變（ΔH）、熵變（ΔS）和吉布斯自由能變（ΔG））。

1.3.4 細胞毒性評價

1.3.4.1 MTT法檢測細胞毒性

將PC12細胞以104個/孔的密度接種于96 孔板中。使用完全培養(yǎng)基在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，棄去原培養(yǎng)基，用含有不同質(zhì)量濃度（0.12～1.00 mg/mL）CQDs、10 μmol/L Cd2+或CQDs-Cd2+（CQDs質(zhì)量濃度為0.06 mg/mL或0.12 mg/mL，Cd2+濃度為10 μmol/L）的新鮮完全培養(yǎng)基處理細胞24 h。然后去除孔板中培養(yǎng)基，加入20 μL 5 mg/mL MTT孵育4 h。除去孔板中MTT溶液后，每孔加入150 μL DMSO，振蕩15 min，用多功能酶標儀于570 nm波長處測定吸光度，吸光度與活細胞數(shù)成正比[21]。以不含CQDs、Cd2+或CQDs-Cd2+的新鮮完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞作為空白對照。

1.3.4.2 ROS水平檢測

將PC12細胞接種于12 孔板中，每孔加入約5×105個細胞，細胞培養(yǎng)箱孵育24 h，當細胞鋪滿孔板約85%后去除孔板中原有培養(yǎng)基，加入10 μmol/L Cd2+溶液以及終濃度10 μmol/L Cd2+與終質(zhì)量濃度0.06 mg/mL CQDs的混合溶液，繼續(xù)孵育24 h；使用過氧化氫處理的細胞作為陽性對照組。處理20 min后收集細胞，離心去上清液，使用500 μL PBS重懸后避光加入10 μmol/L 2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽，在37 ℃下避光染色30 min，離心收集細胞，采用PBS重懸后轉(zhuǎn)移至黑色96 孔板中，使用熒光酶標儀檢測熒光強度[22]。ROS水平以處理組與對照組熒光強度的比值表示。

1.3.4.3 線粒體膜電位測定

將PC12細胞接種于12 孔板中，每孔加入約5×105個細胞，細胞培養(yǎng)箱孵育24 h，待細胞鋪滿孔板約85%后分別加入含有10 μmol/L Cd2+以及終濃度10 μmol/L Cd2+與終質(zhì)量濃度0.06 mg/mL CQDs混合溶液的培養(yǎng)基，使用細胞凋亡誘導劑羰基氰化物間氯苯腙（carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone，CCCP）作為陽性對照組。處理20 min后收集細胞，離心去上清液，加入500 μL JC-1染劑，避光孵育20 min，離心后采用JC-1染色緩沖液重懸，繼續(xù)用JC-1染色緩沖液洗滌2 次，樣品轉(zhuǎn)移至96 孔板，使用熒光酶標儀檢測JC-1單體（激發(fā)波長490 nm、發(fā)射波長530 nm）和JC-1聚合物（激發(fā)波長570 nm、發(fā)射波長590 nm）熒光強度。以JC-1聚合物與其單體的熒光強度比值表示線粒體膜電位[22]。

1.3.4.4 細胞周期的檢測

將PC12細胞以每孔106個細胞接種于6 孔板中，培養(yǎng)24 h棄去原培養(yǎng)基，分別加入含有10 μmol/L Cd2+以及終濃度10 μmol/L Cd2+與終質(zhì)量濃度0.06 mg/mL CQDs混合溶液的培養(yǎng)基。繼續(xù)孵育24 h，胰酶消化收集細胞，離心去上清液，用PBS再次清洗細胞后離心去上清液，加入1 mL冰浴預冷的體積分數(shù)70%乙醇溶液，輕輕吹打均勻，4 ℃固定24 h。離心后棄去固定液，加入1 mL冰浴預冷的PBS清洗細胞，棄去PBS，加入0.5 mL染色緩沖液，10 μL 100 μg/mL RNase和25 μL 50 μg/mL碘化丙啶（propidium iodide，PI），37 ℃下避光孵育30 min，最后用流式細胞儀分析細胞周期。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

每個實驗重復3 次，實驗數(shù)據(jù)使用SPSS 19軟件進行處理，結(jié)果以平均值±標準差表示，采用單因素方差分析進行差異顯著性分析（以P＜0.05表示差異顯著），使用Origin Pro 8.5軟件繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 扇貝來源CQDs的表征結(jié)果

食源性CQDs普遍存在于日常生活所食食物中，這些CQDs是食品中某些組分，如蛋白質(zhì)、多糖和脂質(zhì)在高溫條件下相互作用形成的。已有報道表明，在烤制食品和飲料中發(fā)現(xiàn)了CQDs，因此推測蝦夷扇貝在熱加工過程中也會產(chǎn)生CQDs。本實驗通過離心沉淀及透析，提取并純化了蝦夷扇貝熱加工過程中可能產(chǎn)生的CQDs。由圖1A可知，扇貝來源CQDs溶液在可見光照射下呈淺黃色，考察CQDs在200～600 nm波長范圍內(nèi)的紫外-可見光吸收情況發(fā)現(xiàn)，在260 nm附近有1 個明顯的吸收峰，這可能由共軛分子的π→π*電子躍遷引起[23]。由圖1B可知，在紫外光照射下，扇貝來源CQDs溶液能夠發(fā)出明亮的藍色熒光，最大激發(fā)波長為330 nm，最大發(fā)射波長為430 nm；熒光光譜分析結(jié)果表明，在300～390 nm波長范圍內(nèi)，扇貝來源CQDs最大熒光發(fā)射波長隨其激發(fā)波長的增大而增大，同時熒光強度相應減小，這種熒光紅移現(xiàn)象是CQDs的典型特征[24]。通過TEM觀察CQDs形態(tài)，如圖1C所示，蝦夷扇貝中CQDs形貌接近球形，分散性良好，沒有明顯聚集；同時在高分辨TEM圖像中觀察到CQDs晶格結(jié)構(gòu)，晶格間距為0.18 nm。TEM結(jié)果進一步證明了CQDs的存在。粒徑分析結(jié)果如圖1D所示，蝦夷扇貝中CQDs粒徑分布相對較窄，主要集中在2～6 nm，平均粒徑為3.7 nm。

圖 1 扇貝來源CQDs的紫外-可見吸收光譜與熒光光譜以及形態(tài)分析Fig. 1 UV-vis absorption spectra, fluorescence emission spectra and size distribution of CQDs from scallop

圖 2 扇貝來源CQDs的結(jié)晶度、熒光壽命、表面官能團及分子質(zhì)量分析Fig. 2 Crystallinity, fluorescence lifetime, surface functional groups and molecular mass analysis of CQDs from scallop

通過XRD考察扇貝來源CQDs的結(jié)晶狀態(tài)，如圖2A所示，在2θ為23.36°處觀察到一個較寬的衍射峰，這表明蝦夷扇貝中CQDs為無序的碳結(jié)構(gòu)，這與大多數(shù)CQDs的結(jié)晶度結(jié)果一致[25]。在室溫下通過時間相關(guān)單光子計數(shù)技術(shù)測定CQDs的熒光衰減曲線，如圖2B所示。采用雙指數(shù)函數(shù)進行擬合計算得到蝦夷扇貝中CQDs的平均熒光壽命為5.98 ns。通過FTIR考察CQDs的表面基團，由圖2C可知，CQDs在3 300 cm-1附近有明顯的吸收帶，這與氨基和羥基的伸縮振動有關(guān)；位于2 900 cm-1處的吸收峰與C-H鍵振動有關(guān)，這說明CQDs表面存在甲基；1 641、1 522 cm-1和1 449 cm-1處的吸收峰分別對應酰胺I、II和III帶。酰胺I帶主要由C＝O鍵的伸縮振動引起，酰胺II帶與N-H彎曲振動密切相關(guān)，酰胺III帶反映C-N拉伸振動。FTIR結(jié)果表明，蝦夷扇貝中CQDs表面具有羥基、氨基、羧基和甲基等官能團[26]。采用MALDI-TOF-MS測定蝦夷扇貝中CQDs的分子質(zhì)量，由圖2D可知，CQDs在m/z800～1 800范圍內(nèi)出現(xiàn)多個離子峰，這表明CQDs存在不同分子質(zhì)量。此外，TEM圖像及粒徑分析結(jié)果均表明，蝦夷扇貝中CQDs粒徑不同，粒徑不同必然導致分子質(zhì)量的差異，這進一步印證了MALDI-TOF-MS的結(jié)果。CQDs在m/z1 030處的離子峰強度最大，因此，以m/z1 030代表蝦夷扇貝中CQDs的分子質(zhì)量，這一結(jié)果與之前報道的烤雞肉和鴨肉中CQDs的分子質(zhì)量測定結(jié)果[8,27]相似。

圖 3 扇貝來源CQDs的元素組成分析Fig. 3 Elemental analysis of CQDs from scallop

采用XPS進一步表征扇貝來源CQDs的元素組成和表面基團。由圖3A可知，蝦夷扇貝中CQDs XPS全掃描譜中存在3 個主要峰，結(jié)合能分別為285、399 eV和532 eV，分別對應C、N和O 3 種元素。根據(jù)峰面積計算得到CQDs中C、N和O 3 種元素的相對含量分別為23.75%、7.01%和68.77%。相對較高的N元素含量表明蝦夷扇貝中的含氮成分（如蛋白質(zhì)）參與了CQDs的形成。圖3B～D分別是C1s、N1s和O1s的XPS高分辨譜圖。XPS高分辨譜圖可以展現(xiàn)CQDs表面基團信息。在C1s XPS高分辨譜圖中284.7、286.0、286.7 eV和288.0 eV 4 個峰分別表示C-C/C＝C、C-N、C-O和O-C＝O鍵。N1s XPS高分辨譜圖存在398.1 eV和398.6 eV兩個峰，分別對應吡啶氮和N-H基團。O1s XPS高分辨譜圖在531.3 eV和532.3 eV分別存在O-C＝O和C-O兩個特征峰[25-26,28]。這與FTIR結(jié)果類似，XPS分析結(jié)果進一步證明了蝦夷扇貝CQDs存在羥基、氨基和羧基等官能團。

2.2 扇貝來源CQDs與Cd2+的相互作用

圖 4 扇貝來源CQDs與Cd2＋的ITC分析Fig. 4 ITC analysis of CQDs and Cd2+ from scallop

ITC 是研究物質(zhì)之間相互作用的有效手段，可以通過測定物質(zhì)相互作用產(chǎn)生的熱力學變化，揭示2 種物質(zhì)之間的結(jié)合力以及結(jié)合化學計量學。熱力學參數(shù)包括ΔG、ΔH和ΔS，它們在物質(zhì)相互作用時不同的變化規(guī)律可以闡釋物質(zhì)相互作用的機制。一般來講，分子間相互作用力主要分為4 種類型：氫鍵、范德華力、靜電相互作用和疏水相互作用。當氫鍵或范德華力為分子間主要相互作用力時，ΔS＜0且ΔH＜0；當分子間作用力主要為靜電相互作用時，ΔH＜0而ΔS＞0；當疏水相互作用為主要作用力時，ΔS＞0且ΔH＞0[13,29]。圖4A為Cd2+滴定蝦夷扇貝中CQDs的ITC曲線，圖4B為每次滴定結(jié)合后產(chǎn)生的熱圖。Cd2+滴定CQDs后吸熱不斷下降，校正因Cd2+滴定稀釋而導致的溶解熱后，采用非線性最小二乘法模型擬合，以獨立位點結(jié)合模型確定Cd2+與CQDs相互作用過程中的熱力學參數(shù)。Cd2+與CQDs相互作用過程中的ΔG為-27.24 kJ/mol，ΔG＜0說明兩者之間的反應為自發(fā)反應。同時，該過程中ΔH為-4.869 kJ/mol，ΔS為75.04 J/（mol·K），說明Cd2+與CQDs結(jié)合力主要為靜電相互作用。Cd2+與CQDs相互作用的Ka為5.925×104mol/L，n為0.408，說明Cd2+與CQDs具有良好的結(jié)合力。綜上所述，Cd2+可以通過靜電相互作用自發(fā)地與CQDs形成CQDs-Cd2+復合物。

2.3 扇貝來源CQDs及CQDs-Cd2+的細胞毒性評價

食源性CQDs廣泛存在于食品中，雖然碳本身不被認為是有毒元素，但CQDs因具有較小尺寸，可能對人類健康構(gòu)成潛在風險，其安全性受到廣泛關(guān)注[30]。多數(shù)研究結(jié)果表明，食源性CQDs的毒性較小。如以2 g/kgmb劑量灌胃可樂中的CQDs，對小鼠血液生化指標沒有顯著影響[31]。Liao Han等[32]研究飲料中CQDs對人舌鱗狀細胞癌Tca8113細胞的細胞毒性，細胞活性評價結(jié)果表明，當CQDs質(zhì)量濃度低于20 mg/mL時，不會引起細胞活性的顯著下降。本實驗采用MTT法評價扇貝來源CQDs對PC12細胞的細胞毒性，由圖5A可知，隨著CQDs質(zhì)量濃度增加，細胞存活率逐漸降低，當CQDs質(zhì)量濃度為1 mg/mL時，細胞存活率接近60%，當CQDs質(zhì)量濃度小于0.12 mg/mL時，細胞存活率受到CQDs的影響較小。

圖 5 CQDs及CQDs-Cd2＋對PC12細胞的細胞毒性Fig. 5 Cytotoxicity analysis of CQDs and CQDs-Cd2+ complex

一般而言，納米顆粒因相對比表面積較大，且表面自由能較高，能夠與其他分子通過疏水相互作用、氫鍵和靜電吸附等發(fā)生相互作用。ITC結(jié)果表明，扇貝來源CQDs能夠通過靜電相互作用與Cd2+形成復合物，這種復合物的細胞毒性尚不清楚。為進一步研究食源性CQDs對鎘毒性的影響，測定當CQDs存在時對Cd2+誘導細胞毒性的影響。由圖5B可知，CQDs的存在增強了Cd2+的毒性，細胞存活率隨CQDs質(zhì)量濃度增加而下降。當Cd2+（10 μmol/L）單獨存在時，細胞存活率為52.2%，在此條件下，加入0.06 mg/mL CQDs后，細胞存活率下降到45.1%，當加入CQDs質(zhì)量濃度增加到0.12 mg/mL后，細胞存活率下降到39.6%。為排除CQDs自身毒性對細胞活性的影響，同時測定CQDs單獨存在時對細胞活性的影響。CQDs質(zhì)量濃度0.06 mg/mL和0.12 mg/mL時，細胞存活率分別為96.4%和90.5%。細胞存活率下降幅度低于與Cd2+共同存在時，這表明CQDs強化了Cd2+的毒性。越來越多的研究表明，Cd2+會破壞細胞線粒體膜的完整性，可通過線粒體途徑誘導細胞凋亡[33-34]。進一步測定CQDs存在情況下Cd2+對細胞ROS水平（圖5C）和線粒體膜電位（圖5D）的影響。結(jié)果表明，CQDs存在情況下，與僅存在Cd2+相比，細胞ROS水平大幅升高；同時，線粒體膜電位結(jié)果表明CQDs與Cd2+共同存在產(chǎn)生的聯(lián)合毒性對線粒體膜完整性影響更大；表明CQDs可能通過增加ROS水平和損害線粒體功能增強Cd2+毒性。

圖 6 CQDs及CQDs-Cd2＋復合物對細胞周期的影響Fig. 6 Effect of CQDs and CQDs-Cd2+ complex on cell cycle

細胞周期分為2 個階段，分別為細胞間期與細胞分裂期，包括細胞一次分裂完成開始到下一次分裂結(jié)束整個過程，其中，細胞間期又分為3 個階段，即DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）與DNA合成后期（G2期）。細胞周期停滯是抑制細胞生長的關(guān)鍵因素[35]，細胞周期受到嚴密調(diào)控，基因組DNA完成復制并均等分配到子細胞中。當處于不利條件時，細胞分裂停止，甚至誘發(fā)細胞凋亡。處于細胞周期不同階段DNA含量不同，G1期細胞具有二倍體細胞的DNA含量（2N），G2期因DNA復制，細胞中DNA含量翻倍（4N），S期細胞的DNA含量介于G1期和G2期之間。通過DNA含量不同，可以區(qū)分處于不同細胞周期階段的細胞，進而對細胞周期進行分析。PI可以與DNA結(jié)合，其熒光強度可以直接反映細胞內(nèi)DNA含量。本實驗通過流式細胞儀PI染色法對細胞內(nèi)DNA含量進行檢測。由圖6可知，與對照組相比，Cd2+孵育導致G1期細胞比例減少，從對照組的57.7%下降到51.8%；S期和G2期細胞比例增加，分別從對照組的27.7%和8.5%上升到36.2%和13.2%。這說明細胞周期被阻滯在G2期。當加入CQDs后，CQDs與Cd2+共同孵育會導致更嚴重的細胞周期阻滯。G2期細胞周期阻滯能夠?qū)е录毎蛲?，這與上述細胞活性結(jié)果相符。

3 結(jié) 論

本實驗系統(tǒng)考察了扇貝來源的C Q D s，結(jié)果表明，CQDs呈球形，在水溶液中分散良好，平均粒徑為3.7 nm。CQDs表面具有羥基、氨基和羧基等豐富的官能團。ITC結(jié)果表明，CQDs與Cd2+通過靜電相互作用形成復合物。進一步評價CQDs對Cd2+細胞毒性的影響，結(jié)果表明，CQDs增強了Cd2+的細胞毒性，干擾正常細胞周期。本研究系統(tǒng)表征了扇貝來源CQDs的性質(zhì)及其與重金屬離子的相互作用，為認識食源性納米顆粒的性質(zhì)提供了參考。