劉建寧, 孫 立, 牛志云, 溫樹鵬, 王 穎, 張學(xué)軍, 王福旭

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院血液科；河北省血液病重點實驗室, 河北 石家莊 050000)

異基因造血干細(xì)胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation, allo-HSCT)通過移植物抗白血病效應(yīng)(graft-versus-leukemia, GVL)實現(xiàn)了對血液系統(tǒng)惡性腫瘤的治愈效果，執(zhí)行GVL的供者T淋巴細(xì)胞經(jīng)歷活化擴增及效應(yīng)的過程后清除白血病細(xì)胞，成為中高危急性白血病(acute leukemia，AL)有效的治療手段。而移植后復(fù)發(fā)是allo-HSCT后最常見的死亡原因。一旦復(fù)發(fā)，預(yù)后很差，總體5年生存率僅為5%[1-2]。目前針對復(fù)發(fā)的治療手段有：調(diào)整免疫抑制劑、補救性放療化療、去甲基化藥物治療、細(xì)胞治療、靶向治療等[3]。這些方案能起到一定程度上的改善效果，但結(jié)果仍不理想。白血病復(fù)發(fā)的可能原因包括白血病細(xì)胞的耐藥機制，其生物學(xué)特性出現(xiàn)改變，對GVL效應(yīng)不敏感從而實現(xiàn)免疫逃逸；也有研究表明白血病細(xì)胞丟失了不相合的HLA單倍體表型，導(dǎo)致主要或次要組織相容性復(fù)合體表達(dá)降低，不被免疫細(xì)胞識別從而復(fù)發(fā)；而腫瘤通過激活以程序性死亡蛋白1(PD-1)為代表的免疫檢查點轉(zhuǎn)導(dǎo)的負(fù)調(diào)控通路來抑制免疫反應(yīng)逃避免疫的機制愈受重視。PD-1是表達(dá)于T淋巴細(xì)胞的免疫抑制性受體，腫瘤細(xì)胞浸潤的T淋巴細(xì)胞PD-1的表達(dá)突出明顯，活化的T淋巴細(xì)胞經(jīng)抗原識別后表達(dá)PD-1，并分泌干擾素，誘導(dǎo)組織中其配體(programmed death ligand-1，PD-L1)的表達(dá)，腫瘤細(xì)胞表達(dá)PD-L1與PD-1結(jié)合，抑制T淋巴細(xì)胞功能。本研究收集2019年3月至2020年2月于河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院行allo-HSCT患者40例的臨床資料，同期健康者23例，動態(tài)比較兩組T淋巴細(xì)胞PD-1的表達(dá)水平，重點分析移植后患者T淋巴細(xì)胞表面PD-1表達(dá)水平變化及臨床意義，以便為后期治療提供參考，報道如下。

1 資料與方法

1.1研究對象 本研究所觀察患者組病例均來自2019年3月至 2020年2月于河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院行allo-HSCT患者40例，男21例，女19例，平均年齡(33.30±10.67)歲；急性髓細(xì)胞白血病(AML)21例，急性淋巴性細(xì)胞白血病(ALL)16例，慢性粒細(xì)胞白血病(CML)加速期 1例，急性混合細(xì)胞白血病(MPAL)2例。同期健康志愿者23例，設(shè)為健康對照組，其中男性15例，女性8例，平均年齡(45.65±10.40)歲。所有患者均通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)及細(xì)胞遺傳學(xué)等檢查確診，符合惡性血液病診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]。研究均獲得患者的知情同意并簽署知情同意書，符合2013年修訂的《赫爾辛基宣言》的要求。

1.2移植情況 移植患者移植前原發(fā)病危險分層：高危17例，中危16例，低危7例[5-6]。移植均為親緣供者，其中人類白細(xì)胞抗原(HLA)全相合12例，單倍型相合28例。干細(xì)胞來源:外周血干細(xì)胞(PBSC)10例，因國內(nèi)外研究表明采用臍帶血等第三方細(xì)胞輔助allo-HSCT等促進供者造血干細(xì)胞植入，降低GVHD發(fā)生率，減少復(fù)發(fā)死亡率，改善allo-HSCT預(yù)后[7-9]，故研究對象中有30例患者干細(xì)胞源于PBSC+臍帶血(CB)。血型相合20例，血型不合20例，供受者性別相同22例，不同18例。

1.3預(yù)處理方案 均采用清髓預(yù)處理方案，劑量均遵從中國allo-HSCT治療血液系統(tǒng)疾病專家共識(I)[10]。見表1。

表1 移植患者組清髓預(yù)處理方案

1.4干細(xì)胞動員、采集及回輸 動員應(yīng)用重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(rhG-CSF)皮下注射，rhG-CSF(5-10 μg/kg·d)，4～7天。第4～7天采集外周血干細(xì)胞，采集目標(biāo)為MNC≥5×108/kg受者體重，CD34+細(xì)胞≥2×106/kg受者體重。本研究患者回輸細(xì)胞情況為MNC中位數(shù)9.883(7.199, 13.261)×108/kg受者體重，CD34+細(xì)胞中位數(shù)4.434(3.621, 5.795)×106/kg受者體重。

1.5植入情況 移植效果以造血干細(xì)胞回輸后連續(xù)3天中性粒細(xì)胞計數(shù)>0.5×109/L的第1天為粒細(xì)胞植入；不依賴血小板連續(xù)輸注7天血小板計數(shù)>20×109/L的第1天為血小板植入。

1.6移植物抗宿主病(GVHD)的診斷與治療 移植后急性、慢性移植物抗宿主病參照NIH 2005[11]、NCI 2011[12]標(biāo)準(zhǔn)進行診斷和評估。GVHD的常規(guī)預(yù)防采用環(huán)孢素A(CsA)+嗎替麥考酚酯(MMF)+短療程甲氨蝶呤(MTX)+蘆可替尼，CsA起始劑量1.5 mg/kg每12小時1次，靜脈輸注，-1天開始，消化道癥狀消失后改為口服，一般移植后3個月逐漸減量，6個月停用，根據(jù)復(fù)發(fā)風(fēng)險和GVHD情況酌情縮短或延長其應(yīng)用時間，MTX于+1、+3、+6天給藥，并于用藥24小時后給予甲酰四氫葉酸鈣解救，個別患者給予預(yù)防性供者淋巴細(xì)胞輸注(DLI)。GVHD的治療首先根據(jù)環(huán)孢素濃度適當(dāng)調(diào)整CsA用量，同時給予甲潑尼龍1～2 mg/kg，若病情3天后進展或5～7天后未緩解，考慮給予MTX、注射用重組人II型腫瘤壞死因子受體抗體融合蛋白、抗CD25單克隆抗體等二線藥物治療[13]。

1.7病情監(jiān)測 分別于移植后1、2、3、4.5、6個月留取患者外周血、骨髓，進行血常規(guī)、骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)、微小殘留檢測、融合基因、細(xì)胞遺傳學(xué)、分子生物學(xué)等檢測，骨髓、外周血供受者DNA嵌合、性染色體錯配的監(jiān)測，以評估患者疾病狀態(tài)。微小殘留檢測采用熒光素標(biāo)記的單克隆抗體及流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞抗原的表達(dá)及表達(dá)量，本研究MRD陽性復(fù)發(fā)的患者6例，其中，AML 3例、B-ALL 1例、T-ALL 1例、MPAL 1例，分別于移植后0.5、1.5、9、17、2、3個月復(fù)發(fā)，同時留取外周血標(biāo)本監(jiān)測PD-1的表達(dá)水平。

1.8PD-1檢測 實驗所需試劑均購于Biolegend公司，應(yīng)用流式細(xì)胞儀(品牌：美天旎，型號：MACSQuant 10)檢測外周血標(biāo)本PD-1在CD3+CD4+, CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞的表達(dá)水平。各取100 ul抗凝處理后全血加入到2個EP管中，向管1中加入2 ul CD8 Pacific Blue(貨號301033)、PD1-FITC(貨號329904)、CD4-PE/CY7(貨號300512)、CD3-APC/CY7(貨號300426)、7AAD(貨號420404)，管2中加入同型對照CD8 Pacific Blue、IgG1-FITC(貨號78080)、CD4-PE/CY7、CD3-APC/CY7、7AAD混勻，于4℃環(huán)境下避光孵育10 min；離心后棄上清液，并加入裂解液混勻，室溫避光10-15 min以裂解紅細(xì)胞。裂解后離心棄上清，加入FBS，重懸細(xì)胞，上機檢測。應(yīng)用Flowjo軟件分析：圈定細(xì)胞門P1門后，在P1門內(nèi)設(shè)置CD3/SSC顯示CD3占所有有核細(xì)胞的比例；在CD3門內(nèi)，以“十字門”的方式畫出CD4+PD1+/CD4-PD1+細(xì)胞；另外再在CD4門和CD8門內(nèi)以畫出PD-1+細(xì)胞的比例。

2 結(jié) 果

2.1移植后PD-1在CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞的表達(dá)水平變化 移植后1～6個月PD-1在CD3+CD4+、CD3+CD8+T細(xì)胞的表達(dá)水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.002)，且表達(dá)水平呈現(xiàn)逐漸下降的變化。見表2、圖1。

表2 PD-1在T淋巴細(xì)胞的表達(dá)水平

圖1 移植組PD-1表達(dá)水平隨移植后時間的變化

2.2移植組1～6個月與對照組PD-1的表達(dá)水平比較 結(jié)果發(fā)現(xiàn)移植后1～6個月PD-1在CD3+CD4+T細(xì)胞的表達(dá)水平逐漸下降，但均高于對照組，移植后表達(dá)水平最低的第6個月和對照組PD-1的表達(dá)水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(U=54.000，P=0.003)；移植組PD-1在CD3+CD8+T細(xì)胞的表達(dá)水平在移植后1、2個月高于對照組(U=44.000，P<0.01)，移植后3、4.5、6個月CD3+CD8+T細(xì)胞和對照組PD-1的表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(U=115.000，125.000，110.000，P=0.267，0.434，0.202)。

2.3PD-1表達(dá)水平對MRD陽性復(fù)發(fā)的提示意義 根據(jù)34例MRD陰性組患者T淋巴細(xì)胞PD-1的表達(dá)數(shù)據(jù)，分別統(tǒng)計移植后1、2、3、4.5及6個月不同時間點表達(dá)水平的均值范圍。本研究中MRD陽性復(fù)發(fā)患者6例，其中4例未于MRD陽性復(fù)發(fā)前采樣檢測均不納入統(tǒng)計，1例復(fù)發(fā)患者在MRD復(fù)發(fā)前曾行DLI治療，PD-1表達(dá)水平低于未DLI組，故未納入MRD陽性組分析，剩余1例患者復(fù)發(fā)前3個月(移植后6個月)PD-1在CD3+CD4+、CD3+CD8+T細(xì)胞的表達(dá)水平54.20%；37.30%，高于總體均值范圍(29.27±15.08)%；(17.18±17.50)%。

3 討 論

allo-HSCT作為治愈AL的主要治療方案，移植物存在抗白血病效應(yīng)(GVL)是造血干細(xì)胞移植能夠治愈AL的主要機制。而移植后復(fù)發(fā)，嚴(yán)重影響著移植后患者的長期生存時間和狀態(tài)，可能由GVL效應(yīng)丟失導(dǎo)致。目前研究分析GVL效應(yīng)丟失的原因：①白血病細(xì)胞HLA Ⅱ類分子丟失；②白血病細(xì)胞獲得新的基因突變；③T淋巴細(xì)胞PD-1表達(dá)上調(diào)；④白血病細(xì)胞PD-L1表達(dá)升高。

PD-1作為CD28家族的成員之一，表達(dá)于T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞，通過與其配體PD-L1相互作用引起T細(xì)胞衰竭而發(fā)揮負(fù)性免疫調(diào)控效應(yīng)[14]。其轉(zhuǎn)導(dǎo)的信號通路干擾T細(xì)胞的活化和增殖，使T細(xì)胞處于衰竭狀態(tài)，免疫細(xì)胞功能差，抑制性受體持續(xù)表達(dá)，妨礙免疫系統(tǒng)對感染和腫瘤細(xì)胞的最佳控制[15]。Simonetta等[16]分析了105例allo-HSCT受者分離的T細(xì)胞亞群上PD-1的表達(dá)，結(jié)果顯示allo-HSCT后表達(dá)PD-1的CD3+CD4+和CD3+CD8+T細(xì)胞的比例在移植后早期明顯增加，且PD-1在CD3+CD8+T細(xì)胞表面的表達(dá)只呈現(xiàn)了一過性增加，隨時間推移逐漸趨于正常化，而在CD3+CD4+T細(xì)胞表面的表達(dá)呈現(xiàn)早期和長期的增加，雖有下降趨勢，但在研究的所有時間點中(包括allo-HSCT后5年以上的患者)，其表達(dá)比例仍明顯高于健康對照水平。本研究顯示，allo-HSCT后1個月到6個月PD-1在CD3+CD4+T細(xì)胞的表達(dá)一直處在高于健康者的水平，但有明顯的下降趨勢；而在CD3+CD8+T細(xì)胞的表達(dá)雖然也呈下降趨勢，但在3個月開始，與健康者水平差異無明顯統(tǒng)計學(xué)意義，與之前報道吻合。表明allo-HSCT后PD-1在CD3+CD4+和CD3+CD8+T細(xì)胞表面的表達(dá)變化過程不同，CD3+CD4+T細(xì)胞表面PD-1表達(dá)上調(diào)持續(xù)時間相對長，不除外持續(xù)性升高，需延長研究時間證實；而CD3+CD8+T細(xì)胞表面PD-1則呈現(xiàn)瞬時過表達(dá)的特點。

同時Kong等[17]研究了allo-HSCT的AML患者11例外周血樣本并進行流式細(xì)胞術(shù)檢測，其中5例在移植后2～6個月出現(xiàn)白血病復(fù)發(fā)，余6例在采血點(移植后3～6個月)一直處于緩解狀態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在復(fù)發(fā)患者中始終檢測到高表達(dá)PD-1的細(xì)胞比例增加，提示PD-1在allo-HSCT后白血病復(fù)發(fā)中有著預(yù)測價值。Noviello等[18]研究了PD-1等抑制性受體在32例AML患者的骨髓浸潤T細(xì)胞的表達(dá)在allo-HSCT后復(fù)發(fā)或完全緩解后的差異，發(fā)現(xiàn)移植后復(fù)發(fā)的患者PD-1在CD3+CD8+T細(xì)胞表達(dá)的比例均高于緩解的患者。本研究中分析復(fù)發(fā)患者復(fù)發(fā)前PD-1表達(dá)水平與對應(yīng)移植后時間點未復(fù)發(fā)患者組表達(dá)水平的總體均值，發(fā)現(xiàn)了復(fù)發(fā)前PD-1在CD3+CD4+、CD3+CD8+T細(xì)胞的表達(dá)水平高于未復(fù)發(fā)總體的現(xiàn)象。如報道所言，PD-1表達(dá)上調(diào)，其介導(dǎo)的信號通路抑制T淋巴細(xì)胞的功能活化，減少T淋巴細(xì)胞的增殖，增加T細(xì)胞功能缺陷。以此可推測，當(dāng)移植后患者PD-1檢測表達(dá)升高時，衰竭T細(xì)胞增加，機體免疫下降，從而促進腫瘤細(xì)胞逃脫免疫監(jiān)視，導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)。

基于以上研究，目前PD-1抑制劑在allo-HSCT后患者的治療中應(yīng)用逐漸增多。Berger等[19]在pidilizumab的I期臨床試驗中，應(yīng)用于8例AML晚期患者，其中4例曾行allo-HSCT，1例于口服pidilizumab第21天外周幼稚細(xì)胞從50%降至5%，提示PD-1抑制劑的抗腫瘤效果。Ravandi等[20]曾在對AML患者的治療中應(yīng)用nivolumab，44例患者中有42例AML患者，2例MDS高?；颊撸o予患者誘導(dǎo)化療的同時，在第1～3天使用nivolumab，3 mg/kg，應(yīng)答者接受最多5個鞏固周期或行allo-HSCT，結(jié)果顯示44例患者中34例(78%)患者達(dá)到完全緩解(CR)或部分緩解(CRi)，其中在應(yīng)答時有微小殘留病的16例患者中9例(56%)給予了nivolumab維持治療并在1～3個月后微小殘留病轉(zhuǎn)為陰性。然而，PD-1抑制劑應(yīng)用有效的同時，GVHD似乎也有所增加或加重的可能。Ravandi等[20]研究的44例患者中18例行allo-HSCT，其中13例(Ⅰ～Ⅱ級8例，Ⅲ～Ⅳ級5例)發(fā)生aGVHD。Haverkos等[21]對接受PD-1抑制劑治療的31例allo-HSCT后復(fù)發(fā)的淋巴瘤患者進行了多中心回顧性分析，病例中8例(26%)死亡患者與抗PD-1治療后新發(fā)GVHD有關(guān)，17例(55%)在開始使用抗PD-1后出現(xiàn)治療應(yīng)急型GVHD(6例急性，4例重疊，7例慢性)，9例為Ⅲ～Ⅳ級的急性或重度慢性GVHD，表明PD-1抑制劑治療可能并發(fā)嚴(yán)重和難治的GVHD。雖然也有惡性腫瘤移植后復(fù)發(fā)的早期臨床試驗中，未發(fā)現(xiàn)ipilimumab治療會誘發(fā)或加劇GVHD[22]；Simonetta等[16]在分析T細(xì)胞表面PD-1的表達(dá)與移植后并發(fā)癥的關(guān)系時，也未檢測到aGVHD患者CD4+、CD8+T細(xì)胞上PD-1的表達(dá)有顯著差異，表明GVHD對allo-HSCT后T細(xì)胞上PD-1表達(dá)的影響很小。但PD-1抑制劑的臨床應(yīng)用在令研究者懷有希望的同時因是否直接影響GVHD的發(fā)生而受阻，如何分離GVL效應(yīng)和GVHD，在加強GVL效應(yīng)的同時最大程度的減少或減輕GVHD還需進一步研究，如聯(lián)合其他免疫檢查點抑制劑、減少應(yīng)用劑量等。

綜合文獻(xiàn)及研究結(jié)果，急性白血病患者移植后早期PD-1在CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞的表達(dá)較正常水平升高且隨移植時間呈現(xiàn)下降趨勢；在CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞的表達(dá)于移植后早期呈現(xiàn)一過性升高。早期應(yīng)用免疫抑制劑可能會減少復(fù)發(fā)，但對GVHD的相關(guān)性及預(yù)防需進一步研究。