厲為良 李永華 梁衛(wèi)娟 呂麗輝 高鵬帥 楊玉波

肺癌已經(jīng)成為主要的公共衛(wèi)生問題之一，是當今世上死亡率最高的惡性腫瘤[1-2]，盡管在肺癌的診治方面取得了重大進展，但肺癌的5年生存率即便是早期(Ⅰa1、Ⅰa2、Ⅰa3期)NSCLC也分別只有96.0%、87.2%和78.7%[3]，可見早期診斷、早期治療以提高肺癌長期生存率仍然任重而道遠。

CTC檢測是一種新興的液體活檢技術，在腫瘤的早期診斷、個體化治療等方面有較廣泛的應用。CTC可在腫瘤發(fā)生發(fā)展的各個階段檢測到,但陽性率在血樣本量為7.5 mL時也只有30.4%(38/125)～ 52.9% (18/34)[4-5]。CTC的陽性率低的原因除了CTC本身稀少、CTC富集方法不同[6-7]外，血樣本的來源不同可能是問題的關鍵，即外周動脈血的CTC含量可能與外周靜脈的CTC含量不同。鑒于此，本課題組對肺癌患者外周動、靜脈血中CTC含量進行了對比研究。

資料與方法

一、研究設計和病例選擇

本研究選取2018年3月至2019年7月在浙江大學明州醫(yī)院和寧波東海醫(yī)院經(jīng)病理確診肺癌患者46例進行外周動、靜脈血CTC的自身對照研究，并獲得其醫(yī)學倫理委員會的批準。所有患者均獲得知情同意。根據(jù)相關的臨床資料、全身計算機斷層掃描(CT)和正電子發(fā)射斷層掃描(PET)、腦磁共振成像(MRI)及病理結果，參照國際肺癌研究協(xié)會(The International Association for The Study of Lung Cancer，IASLC)的第八版TNM分期建議[8]確定腫瘤分期。

二、研究方法

所有納入研究的患者均同時在其同側肢體采取外周動脈血(A組)和外周靜脈血(V組)各5 mL,注入統(tǒng)一采用ACD 抗凝的真空采血管內(nèi)，密封后立即顛倒混勻8次，室溫(15～30 ℃)下保存，24小時內(nèi)進行檢測。采用免疫磁珠陰性富集聯(lián)合免疫熒光原位雜交法(immunofluorescence in situ hybridization, imFISH)對CTC進行富集計數(shù)和鑒定[9](由廣州達安臨床檢驗中心負責檢測，檢測血標本量為3.2 mL)，從3.2 mL血標本量中檢出1個CTC即確認為檢出CTC，以此計算CTC檢出率；以檢出CTC>=2個/3.2 mL為CTC陽性的診斷界值，計算CTC陽性率。

三、統(tǒng)計學方法

結 果

一、入組病例基線特征

共有46例肺癌納入本研究，其基線特征見表1。

二、CTC檢測結果

檢測結果顯示：46例肺癌患者外周動脈血(A組)CTC平均含量明顯高于外周靜脈血(V組)的CTC平均含量，兩組對比有顯著性差異(t=2.533，P=0.015)；A組的CTC檢出率(71.7%)明顯高于V組(52.2%)，且有顯著性差異(χ2=8.873，P=0.032)；A組的CTC陽性率(58.7%)明顯高于V組(30.4%)，且有顯著性差異(χ2= 8.435，P=0.040)。(見表2)。

不同TNM分期肺癌的外周動脈血和外周靜脈血CTC陽性率的差異在Ⅰ期最明顯，其外周動脈血CTC陽性率(50.0%)明顯高于外周靜脈血(14.3%)，且差異顯著(χ2=8.857，P=0.013)，而其它三期的動靜脈血CTC陽性率無明顯差異。(見表3)。

表3 46例肺癌患者TNM分期與外周動脈血和外周靜脈血CTC陽性率

討 論

外周靜脈采血是一種簡單、微創(chuàng)的方法，一般患者都能接受CTC檢測。但肺癌CTC的陽性率偏低，尤其在早期肺癌。Tanaka 等[4]用半自動系統(tǒng)(Semiautomated system)對125例確診的原發(fā)性肺癌(其中31例有遠處轉移)檢測其外周靜脈血CTC，檢測樣本量為7.5 mL，檢出率只有30.6%。Allard WJ等[6]報告用CellSearch系統(tǒng)檢測了964 例遠處轉移癌的2183份外周靜脈血標本，其CTC陽性率只有36%(診斷界值為CTC>=2個/7.5mL)。隨著CTC檢測技術的進步，CTC的檢測水平也得到提升。Devriese LA等[7]采用免疫磁珠富集法 (Immunomagnetic bead enrichment)檢測了46例晚期(advanced)非小細胞肺癌，其檢出率為46%。 最近，Duan等[5]報告，對34例確診的原發(fā)性肺癌(其中9例為浸潤性癌)采用循環(huán)上皮細胞采集器(GILUPI Cellcollector)及免疫熒光染色法檢測、鑒定其外周靜脈血CTC，其CTC檢出率可達52.9%(18/34)。

本研究同時對外周動脈血標本和外周靜脈血標本進行檢測，采用的是免疫磁珠陰性富集聯(lián)合免疫熒光原位雜交法(immunofluorescence in situ hybridization, imFISH)[9]，檢測血標本量為3.2mL。所得的外周靜脈血的CTC檢出率(52.2%)與最近的文獻[5]結果相近。而同一檢測方法所得的外周動脈血的CTC檢出率(71.7%)則明顯高于外周靜脈血，也遠遠高于前述研究報告[4-7]的結果。這一結果提示肺癌CTC在外周動、靜脈血中的含量是不同的。本研究發(fā)現(xiàn)，肺癌患者外周動脈血CTC含量(1.98 ± 1.73[個/3.2mL])明顯高于外周靜脈血CTC含量(1.39 ± 1.86 [個/3.2mL])(t=2.533，P=0.015)，驗證了上述推測，也即檢測外周動脈血CTC相比外周靜脈血可獲更高的檢出率。這對于采用液體活檢方法早期診斷肺癌和轉歸及療效隨訪可能具有重要意義。實際上，如果以檢出CTC>=2個/3.2mL為CTC陽性的診斷界值，本研究結果顯示，外周動脈血的CTC陽性率(58.7%)明顯高于外周靜脈血的CTC陽性率(30.4%)(χ2=8.435，P=0.040)，尤其在早期(Ⅰ期)肺癌更有其優(yōu)勢，外周動脈血的CTC陽性率(50.0%)明顯高于外周靜脈血的CTC陽性率(14.3%)(χ2=8.857，P=0.013)，提示檢測外周動脈血CTC相比外周靜脈血能獲得更早期的診斷，有利于肺癌的早期診治。

肺癌患者外周動脈血CTC含量明顯高于外周靜脈血CTC含量的原因可能是CTC在循環(huán)系統(tǒng)中的損耗不同。CTC在血液中循環(huán)時可能會被隔離、濾過、破壞或清除,也可能會凋亡，大約只有0.01%的CTC才能形成轉移灶[10-11]，這其中毛細血管網(wǎng)的作用更不能低估。眾所周知，如果肺癌CTC從支氣管靜脈入血，則外周靜脈血樣本中的肺癌CTC要經(jīng)過右心系統(tǒng)、肺動脈、肺循環(huán)毛細血管網(wǎng)、肺靜脈、左心系統(tǒng)、主動脈及其分支系統(tǒng)、體循環(huán)毛細血管網(wǎng)和體靜脈系統(tǒng)，其間要經(jīng)過兩個毛細血管網(wǎng)；而外周動脈血樣本中的肺癌CTC則避開了體循環(huán)毛細血管網(wǎng)和體靜脈系統(tǒng)。如果肺癌CTC自肺靜脈入血，則外周靜脈血樣本中的肺癌CTC雖然避開了肺循環(huán)毛細血管網(wǎng)，但也要經(jīng)過左心系統(tǒng)、主動脈及其分支系統(tǒng)、體循環(huán)毛細血管網(wǎng)和體靜脈系統(tǒng)，其間也要經(jīng)過一個毛細血管網(wǎng)；而外周動脈血樣本的肺癌CTC則只經(jīng)過左心系統(tǒng)和主動脈及其分支，完全避開了肺循環(huán)和體循環(huán)的兩個毛細血管網(wǎng)和體靜脈系統(tǒng)。從上可見，外周動脈血的肺癌CTC所受的損耗顯然應該比外周靜脈血的肺癌CTC少得多。也許，這就是肺癌患者外周動脈血CTC含量明顯高于外周靜脈血CTC含量的主要機理。

鑒于這一機理，對于肺癌來說，采集肺靜脈血送檢CTC以提高肺癌CTC檢出率和陽性率可能是最有效的方法，因為唯一的肺靜脈可接受整葉肺的腫瘤細胞入血，且不需要經(jīng)過漫長的血液循環(huán)和任何毛細血管網(wǎng)。Reddy等[12]為了證實早期肺癌CTC的存在，對32例原發(fā)肺癌在肺切除前抽取肺靜脈血檢測CTC，結果顯示其CTC檢出率達62.5%(20/32)，且其含量顯著高于外周靜脈血。但是，肺靜脈血標本只有在開胸手術的情況下才能采集，多為一次性。這是一種技術復雜、創(chuàng)傷較大、風險較高的非常規(guī)方法。為了診斷早期肺癌而去開胸采集肺靜脈血顯然是不現(xiàn)實的，它不適用于肺癌的早期診斷篩查和治療后病情轉歸的隨訪。而采集外周動脈血(如橈動脈血、股動脈血等)卻要簡單的多，一般患者都能接受，適用于肺癌的早期診斷的多次篩查，也適用于治療后病情轉歸的反復多次隨訪檢測，和采集外周靜脈血一樣，是一種技術簡單、創(chuàng)傷很小、風險很低、更有效，便于推廣的常規(guī)方法。

綜上所述，肺癌外周靜脈血CTC的稀有性導致其CTC的低檢測率和低陽性率，而外周動脈血CTC含量顯著高于外周靜脈血，檢測外周動脈血CTC，使其CTC檢出率和陽性率顯著提升，有利于肺癌的早期診斷和肺癌治療后療效觀察及轉歸隨訪。