錢佳銘，張顯波，董然然，曾 圣，李建光，陳飛雄

(1.貴州大學 動物科學學院，貴州 貴陽 5500025； 2.貴州省農業(yè)科學院 水產研究所，貴州 貴陽 550025)

0 引言

【研究意義】稀有鮈鯽(Gobiocyprisrarus)屬鯉科鮈鯽屬，是中國特有的一種小型魚類，被中國野生動物紅皮書和中國物種紅色名錄列為瀕危魚類，其個體小、易于養(yǎng)殖，已被多個實驗室用作科學研究試驗動物。實驗室養(yǎng)殖條件下，稀有鮈鯽性成熟快，周年多次產卵，是研究魚類卵子發(fā)生的理想材料。卵子發(fā)生是卵原細胞形成具有受精能力卵母細胞的過程，是物種傳宗接代和繁衍生息的基本前提。卵子發(fā)生在多個信號通路的共同調控下進行，mTOR通路是調控其發(fā)生的主要信號通路之一。用mTOR通路抑制劑雷帕霉素處理稀有鮈鯽，研究該通路在魚類卵子發(fā)生中的作用，對魚類生殖生理學和繁殖生物學研究有重要參考價值?！厩叭搜芯窟M展】在靜止期卵母細胞與原始濾泡顆粒細胞中，mTOR表達異常可導致細胞內蛋白合成增加，卵母細胞發(fā)育及顆粒細胞增值分化，使原始濾泡細胞被激活，引發(fā)原始濾泡庫過早耗竭，從而導致卵巢儲備能力降低。mTOR受2個蛋白分子(TscI、TscII)構成的異二聚體復合物的負反饋調控[1]。如小鼠卵母細胞中特異敲除TscI和TscII，原始濾泡細胞過早激活[2-3]。采用雷帕霉素(Rapamycin)抑制mTOR活性則導致原始濾泡細胞激活率下降[4]，這對卵子的發(fā)生影響較大?！狙芯壳腥朦c】魚類是研究脊椎動物卵子發(fā)生的重要模型，但mTOR通路在魚類卵子發(fā)生中的功能尚未得到驗證。【擬解決的關鍵問題】采用mTOR通路抑制劑雷帕霉素處理稀有鮈鯽，研究該通路在魚類卵子發(fā)生中的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用稀有鮈鯽從西南大學淡水魚類資源與生殖發(fā)育教育部重點實驗室引進，在貴州省農業(yè)科學院水產研究所實驗室培育繁殖，于自然光周期下26℃恒溫循環(huán)水系統(tǒng)中飼養(yǎng)?；旌贤段关S年蟲和升索微粒子飼料，早晚各1次。

雷帕霉素(S1039)購自美國Selleck生物科技有限公司，根據其說明書進行使用。

1.2 藥物處理

將雷帕霉素溶解于二甲基亞砜(DMSO)中，配置濃度為100 mg/mL的儲存液。將儲存液溶解于稀釋劑5.2%吐溫-80和5.2%聚乙二醇400溶液混合液中，配置濃度為1.0 mg/mL的工作液，過濾滅菌，按每份1 mL分裝于滅菌管中，-80℃保存。雷帕霉素處理采用腹腔注射方法，注射劑量為1 g魚注射5 μL工作液，對照同時注射等量不含雷帕霉素的稀釋劑和DMSO。從稀有鮈鯽3月齡(已達性成熟)開始注射，只注射雌魚(此時雌魚腹部膨大，可用此區(qū)分雌雄魚)，隔7 d注射1次，持續(xù)至4月齡停止，正常飼養(yǎng)至5月齡。分別在3、4、5月齡時隨機抽取6尾魚觀察其性腺發(fā)育情況。

1.3 卵巢組織學觀察

稱量3、4、5月齡試驗組和對照組魚的體重后，取出性腺稱重，并計算性腺指數(GSI=性腺重/體重×100%)。將稱重后的性腺迅速進行波恩氏液固定過夜后進行石蠟包埋、切片。制片后二甲苯脫蠟，梯度酒精復水，蘇木素、伊紅染色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，采用尼康電子顯微鏡觀察和成像。

1.4 基因表達檢測

從NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載稀有鮈鯽foxl2(JN200819)、fshr(KC464362)、cyp11a1(JN858106)、cyp19a1a(GU220394)、bmp15(KF934186)、figlα(KF318206)基因開放閱讀框序列。通過NCBI系統(tǒng)中Primer-BLAST在線軟件設計基因轉錄表達檢測引物，片段長度150～300 bp。引物合成由北京擎科新業(yè)生物技術有限公司完成。

提取3、4、5月齡試驗組和對照組稀有鮈鯽性腺總RNA，DNA酶Ⅰ去除DNA污染。第一鏈cDNA由Takara反轉錄試劑盒合成。Real-time PCR在實時定量PCR儀上進行，具體操作參照SYBR Premix Ex TaqTM II試劑盒說明書。Real-time PCR所用引物見表1。管家基因β-actin作為內參，目標基因mRNA的相對表達水平采用公式R= 2-△△Ct方法計算[5]，結果表示為Ct值的平均值±標準偏差(Mean±SD)，采用SPSS進行顯著性分析，組間差異采用單因素方差(one-way ANOVA)分析Duncan’s post-hoc檢驗，顯著性水平為P<0.05。

表1 Real time PCR引物 Table 1 Sequences of primers used for Real time PCR

2 結果與分析

2.1 卵子的發(fā)生情況

3月齡時檢測發(fā)現，稀有鮈鯽卵巢已具有Ⅳ時相卵母細胞(圖1 a、d)；雷帕霉素處理1月后(4月齡)，卵巢中只有Ⅰ、Ⅱ時相卵母細胞(圖1b)，而對照組中具有Ⅳ時相卵母細胞(圖1e)；正常飼養(yǎng)1個月后(5月齡)，處理組卵巢中觀察到Ⅲ時相卵母細胞(圖1c)，而對照組中始終具有Ⅳ時相卵母細胞(圖1f)。從圖2看出，處理組3、4、5月齡的性腺指數與對照組3月齡間無顯著差異，4月齡處理組顯著低于5月齡處理組，4月齡和5月齡處理組均顯著低于相應的對照組。

圖1 雷帕霉素處理稀有鮈鯽的卵巢組織Fig.1 Ovarian tissue of rare G. rarus treated with rapamycin

2.2 卵子的相關基因表達

從圖3看出，foxl2、fshr、cyp11a1、cyp19a1a和bmp15的基因相對表達量在3、4、5月齡對照組和3月齡處理組間無顯著差異，4月齡處理組顯著低于5月齡處理組，4月齡和5月齡處理組均顯著低于相應對照組；3、4、5月齡對照組的figlα與3月齡處理組間無顯著差異，4月齡處理組顯著高于5月齡處理組，4月齡和5月齡處理組均顯著高于相應對照組。

注：不同小寫字母表示差異達顯著水平(P<0.05)，下同。Note: Different lowercase letters indicate significance of difference at P<0.05 level.The same below.圖2 雷帕霉素處理稀有鮈鯽的性腺指數Fig.2 The gonad index of rare G. rarus treated with rapamycin

圖3 雷帕霉素處理稀有鮈鯽卵子發(fā)生相關基因表達Fig.3 Expression of genes related to oogenesis in rare G. rarus treated with rapamycin

3 討論

研究驗證了雷帕霉素處理對稀有鮈鯽卵子發(fā)生影響，進一步證明mTOR通路在魚類卵子發(fā)生中的作用。雷帕霉素處理后，稀有鮈鯽卵子發(fā)生出現障礙，卵母細胞只能發(fā)育至II時相，性腺指數顯著低于對照組。這與小鼠類似研究結果相似，即無論是隨著小鼠年齡增長而引起的卵巢儲備功能降低或化療藥物所導致的卵巢功能不全，應用mTOR抑制劑均能抑制原始濾泡的激活，使卵子發(fā)生不能正常進行[4, 6-7]。在小鼠初級濾泡顆粒細胞體外培養(yǎng)過程中，使用雷帕霉素處理后，顆粒細胞的增殖率呈劑量依賴性下降；并且停滯在有絲分裂G1期的GCs比例也呈劑量依賴性增加，僅有小部分GCs進入分裂期，且細胞分裂異常，抑制顆粒細胞活化[8-9]。說明，mTOR信號通路在脊椎動物卵巢發(fā)育中的作用比較保守，該通路被抑制時，卵子發(fā)生受阻，卵母細胞不能正常發(fā)育。在小鼠研究中還發(fā)現，通過特異性敲除卵巢顆粒細胞中Tsc1基因(mTOR信號通路的一個重要因子)后，顆粒細胞內mTOR磷酸化水平提高，信號通路過度激活，初級卵泡和排卵數增加[10]，進一步證明mTOR信號通路對脊椎動物卵子發(fā)生的重要性。此外，雷帕霉素抑制卵母細胞發(fā)育不是永久的，當停止處理后，卵子發(fā)生得以恢復。

Foxl2是1個轉錄因子，能夠調控脊椎動物類固醇發(fā)生相關的多種催化酶編碼基因表達，對卵巢發(fā)育必不可少，缺失后，卵巢發(fā)育不能正常進行，會逆轉為精巢[11-13]；Fshr是促性腺激素受體，主要在動物卵巢顆粒細胞中表達，對卵母細胞發(fā)育至關重要[14-15]；Cyp11a1和Cyp19a1a是類固醇發(fā)生過程中的催化酶，也主要在動物卵巢顆粒細胞中表達，其催化產物促進卵巢發(fā)育，缺一不可[13, 16-19]；Bmp15是TGFβ家族成員之一，敲除魚類該基因，卵巢顆粒細胞不能形成，卵母細胞不能維持[16, 20]；Figlα是最早表達的生殖細胞特異的性轉錄因子之一，對卵泡的早期發(fā)育有重要的調控作用，主要在魚類II時相卵母細胞中表達[21-23]。在4月齡和5月齡處理組中，foxl2、fshr、cyp11a1和cyp19a1a的表達都顯著低于對照組，說明雷帕霉素處理對類固醇發(fā)生通路具有一定抑制作用，從而影響卵母細胞發(fā)育。bmp15表達的下調說明雷帕霉素處理也影響到TGFβ信號通路的調控，但其間的調控關系和bmp15表達下調的原因還有待進一步研究。foxl2、fshr、cyp11a1和cyp19a1a基因均在動物卵巢體細胞中表達，而Figlα則在生殖細胞中高表達，主要定位于II時相卵母細胞。雷帕霉素處理后，卵母細胞發(fā)育停留在II時相，此時的II時相卵母細胞占比較高，顯然figlα表達出現上調。

4 結論

采用mTOR通路抑制劑雷帕霉素處理成年稀有鮈鯽，導致其卵子發(fā)生出現障礙。類固醇發(fā)生相關基因foxl2、fshr、cyp11a1、cyp19a1a和TGFβ信號通路基因bmp15表達在處理組中顯著下調，生殖細胞特異性轉錄因子figlα表達出現上調。說明，mTOR通路可能通過調節(jié)類固醇發(fā)生和TGFβ信號通路調控魚類卵子發(fā)生，促進卵母細胞的發(fā)育和成熟。