方改霞，王明月，侯凱玉，黃金絨，李冰冰*, 洪 軍

(1.河南城建學院 生命科學與工程學院，河南 平頂山 467036； 2.河南省健康食品工程技術研究中心，河南 平頂山 467036)

0 引言

【研究意義】球蟲病是一種體內(nèi)寄生蟲病，在畜牧業(yè)動物飼養(yǎng)中頻發(fā)，造成嚴重經(jīng)濟損失，尤其在兔養(yǎng)殖業(yè)中為最。球蟲孢子化卵囊經(jīng)口被兔攝入體內(nèi)[1]，經(jīng)1～2 d即可發(fā)育為感染性孢子化卵囊，感染宿主；兔感染球蟲，一般呈普遍性、混合性[2]等特點。目前，針對球蟲病常用手段多為化學藥物抑制，長期使用易產(chǎn)生耐藥性，對動物機體造成損害[3]，且使用的所有化學藥物均有耐藥性記錄[4]，故當前急需研發(fā)新型無毒害抗球蟲藥物。【前人研究進展】中草藥綠色安全，長期使用不易產(chǎn)生耐藥性，可有效提高動物機體的抗氧化水平，降低脂質過氧化，改善腸胃功能，增強動物免疫機能等[5-6]，越來越多的研究者嘗試篩選能預防和控制球蟲病的中草藥[7-9]。劉陽等[10]在前期探索了6種中草藥對球蟲卵的抑制作用；張國[11]探索了4種中草藥對兔球蟲卵囊孢子化的影響。然而這些研究選用的中草藥大多含有白頭翁、青蒿等，相對缺少對其他中草藥的研究?！狙芯壳腥朦c】目前桉葉、蛇床子、土荊皮、石榴皮、枯礬、穿心蓮和蒼術等8種中藥材對微生物抑制作用的研究較普遍，且均具較好的殺菌效果，而涉及抗球蟲卵囊孢子化作用研究較少。【擬解決的關鍵問題】探究桉葉、蛇床子、土荊皮、石榴皮、枯礬、(甘)川楝子、穿心蓮及蒼術等8種中藥材的抗球蟲卵囊孢子化作用，旨在篩選出對球蟲病具有抑制效果的中藥材，以期為中草藥應用于兔球蟲病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

初檢感染球蟲病死的幼兔盲腸內(nèi)容物或兔新鮮糞便，由平頂山市郊區(qū)某兔場提供。

中藥材：桉葉、蛇床子、土荊皮、石榴皮、枯礬、(甘)川楝子、穿心蓮及蒼術。其中桉葉購自方士居淘寶網(wǎng)店，其他均購自平頂山市張仲景大藥房。

試劑：氯化鈉(分析純)，購自天津市恒興化學試劑制造有限公司；重鉻酸鉀(分析純)，購自國藥集團化學試劑有限公司。生理鹽水、飽和食鹽水溶液和2.5%重鉻酸鉀溶液均為自制。

儀器：冷凍干燥機(型號為Scientz-12N)，寧波新芝生物科技股份有限公司生產(chǎn)；低速臺式離心機(型號為L530)，湖南湘儀離心機儀器有限公司；生化培養(yǎng)箱(型號為ZXSD-A1090)，上海智城分析儀器制造有限公司生產(chǎn)；高速離心機(型號為Centrifuge 5424)，德國艾本德有限公司生產(chǎn)；恒溫振蕩器(型號為THZ-98A)，上海一恒科學儀器有限公司生產(chǎn)；普通光學顯微鏡(型號為UB120i)，寧波舜宇儀器有限公司生產(chǎn)；高壓蒸汽滅菌鍋(型號為MJ-78A)，美國施都凱儀器設備有限公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 中藥材提取液制備 取50 g干燥中藥材用蒸餾水浸泡1 h，將其轉移到電動中藥鍋中，加3～5倍體積的水，先武火自動煎煮15 min 2次后文火手動煎煮15 min 1次。將煎出的藥劑先紗布過濾，再濾紙過濾，再抽濾1次，后凍干至粉末狀，凍存于冰箱。各藥材提取量分別為蛇床子5.3 g、土荊皮2.4 g、石榴皮3.4 g、枯礬50 g、(甘)川楝子4.3 g、穿心蓮2.7 g及蒼術9.6 g。

1.2.2 兔球蟲卵囊的分離收集 對初檢感染球蟲病死的幼兔盲腸內(nèi)容物或兔新鮮糞便采用飽和食鹽水漂浮法[12-13]分離并收集球蟲卵囊，置于2.5%重鉻酸鉀溶液中，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

用血球計數(shù)板進行卵囊計數(shù)并鏡檢分離的卵囊情況。初步鏡檢判定卵囊[14]為未孢子化的艾美耳球蟲。

1.2.3 8種中藥材的處理濃度及時間 將8種中藥材水煎提取物配制成濃度為125 mg/mL、100 mg/mL、75 mg/mL、50 mg/mL和25 mg/mL的溶液。分別對分離出的球蟲卵作用2 h、4 h、16 h，檢測每種中藥材提取物在不同濃度下作用不同時間對球蟲卵的抑/殺效果。每組試驗3次重復，以生理鹽水作空白對照。

1.2.4 8種中藥材水提物對兔球蟲卵的抑/殺效果 分別向2 mL無菌離心管中加1 mL濃度為104個/mL的卵囊液，4 000 r/min離心6 min，棄上清液，向沉淀中加1 mL藥液。同時，取1 mL生理鹽水作空白對照。混勻，20℃下分別培養(yǎng)2 h，4 h，16 h后，4 000 r/min離心6 min，棄上清液，向沉淀中加入1 mL生理鹽水，4 000 r/min離心6 min，棄上清液。重復上一步2次。最后1次向沉淀中加入1 mL重鉻酸鉀溶液，搖勻，29℃培養(yǎng)48 h后，取出后鏡檢，計數(shù)總卵囊數(shù)和孢子化卵囊數(shù)，計算球蟲卵囊孢子化率[15]。

卵囊孢子化率=孢子化卵囊數(shù)量/(孢子化卵囊數(shù)量+未孢子化卵囊數(shù)量)×100%

卵囊孢子抑制率=(試驗組平均未孢子化率—對照組平均未孢子化率)/(1—對照組平均未孢子化率)×100%

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 20. 0進行統(tǒng)計分析，以“平均值±標準誤差”表示，并進行方差分析、多重比較及不同因素間的主體間效應檢驗分析，主要對濃度、時間、濃度與時間3個因素進行主體間效應檢驗分析，

2 結果與分析

2.1 不同處理兔球蟲卵的卵囊孢子化率

2.1.1 卵囊孢子化率 從表1可知，不同濃度和處理時間下，土荊皮、桉葉、穿心蓮、枯礬、蛇床子、石榴皮、蒼術和川楝子對兔球蟲卵的卵囊孢子化率。

表1 8種中藥材提取物不同處理兔球蟲卵的卵囊孢子化率Table 1 Sporulation rate of rabbit coccidian oocysts treated with eight Chinese medicine extracts with different time

1) 土荊皮。兔球蟲卵的卵囊孢子化率，在土荊皮濃度為25 mg/mL和125 mg/mL時，不同處理時間差異極顯著，均表現(xiàn)為處理16 h的卵囊孢子化率最小，分別為29.22%和16.56%；在土荊皮濃度為50 mg/mL時，處理2 h與4 h間無顯著差異，二者與處理16 h間差異極顯著，處理16 h的卵囊孢子化率最小，為27.59%；土荊皮濃度為75 mg/mL和100 mg/mL時，處理2 h與16 h間無顯著差異，但二者與處理4 h間差異極顯著。當處理時間相同時(處理2 h、4 h和16 h)均表現(xiàn)為不同濃度間存在極顯著差異，且125 mg/mL的卵囊孢子化率最小。

2) 桉葉。在桉葉濃度相同時，不同處理時間兔球蟲卵的卵囊孢子化率均在處理16 h最小。桉葉濃度為25 mg/mL、50 mg/mL和 100 mg/mL時，不同處理時間間無顯著差異；桉葉濃度為75 mg/mL時，處理2 h與4 h無顯著差異，2 h與16 h間差異極顯著，4 h與16 h間無顯著差異；桉葉濃度125 mg/mL時，處理2 h與4 h、16 h間差異極顯著，處理4 h與16 h間無顯著差異。當桉葉處理時間相同，濃度不同時，均表現(xiàn)為125 mg/mL處理兔球蟲卵的卵囊孢子化率最小。當處理時間為2 h時，桉葉濃度125 mg/mL、100 mg/mL與25 mg/mL、50 mg/mL、75 mg/mL間差異極顯著，100 mg/mL與125 mg/mL間無顯著差異。在處理時間為4 h時，桉葉濃度25 mg/mL、50 mg/mL與75 mg/mL、100 mg/mL、125 mg/mL間差異極顯著，75 mg/mL與125 mg/mL間差異極顯著，100 mg/mL與125 mg/mL間差異顯著。在處理時間為16 h時，不同桉葉濃度間差異極顯著。

3) 穿心蓮。在穿心蓮濃度相同時，不同處理時間兔球蟲卵的卵囊孢子化率均在處理2 h最小。在穿心蓮濃度為25 mg/mL時，不同處理時間間差異極顯著；穿心蓮濃度為50 mg/mL時，4 h、16 h與2 h間呈極顯著差異，4 h與16 h間無顯著差異；穿心蓮濃度為75 mg/mL時，處理2 h、4 h與16 h間差異極顯著，處理2 h與4 h間無顯著差異；穿心蓮濃度為100 mg/mL時，處理2 h與4 h、16 h間差異極顯著，處理4 h與16 h間無顯著差異；穿心蓮濃度為125 mg/mL時，處理2 h與16 h差異極顯著，處理4 h與16 h、處理2 h與4 h間差異顯著。

在穿心蓮處理時間相同，濃度不同時，處理2 h以125 mg/mL處理兔球蟲卵的卵囊孢子化率最小，處理4 h和16 h時，均為100 mg/mL處理兔球蟲卵的卵囊孢子化率最小。當處理時間為2 h，穿心蓮濃度25 mg/mL、50 mg/mL、75 mg/mL與100 mg/mL、125 mg/mL間差異極顯著，100 mg/mL與125 mg/mL間無顯著差異。當處理時間為4 h，穿心蓮濃度100 mg/mL、125 mg/mL與25 mg/mL、50 mg/mL、75 mg/mL間差異極顯著，100 mg/mL與125 mg/mL間差異顯著。當處理時間為16 h，穿心蓮濃度100 mg/mL、125 mg/mL與25 mg/mL、50 mg/mL、75 mg/mL間差異極顯著，100 mg/mL與125 mg/mL、50 mg/mL與75 mg/mL間無顯著差異。

4) 枯礬。在枯礬濃度相同時，除125 mg/mL在處理2 h兔球蟲卵的卵囊孢子化率最小外，其余濃度均表現(xiàn)為處理16 h兔球蟲卵的卵囊孢子化率最小。枯礬濃度為25 mg/mL、50 mg/mL、75 mg/mL、125 mg/mL時，各處理時間間均無顯著差異；枯礬濃度為100 mg/mL時，處理2 h、4 h與16 h間差異極顯著，處理2 h與4 h間無顯著差異。

在枯礬處理時間相同時，均表現(xiàn)為枯礬濃度75 mg/mL處理兔球蟲卵的卵囊孢子化率最小。當處理時間為2 h與4 h時，枯礬濃度75 mg/mL與其余濃度處理間差異極顯著，其余濃度處理間無顯著差異；當處理時間為16 h時，枯礬濃度75 mg/mL和100 mg/mL與25 mg/mL、50 mg/mL、125 mg/mL間差異極顯著，75 mg/mL與100 mg/mL間，25 mg/mL、50 mg/mL與125 mg/mL間均無顯著差異。

5) 蛇床子。在蛇床子濃度相同時，除125 mg/mL在處理2 h兔球蟲卵的卵囊孢子化率最小外，其余濃度均表現(xiàn)為處理4 h兔球蟲卵的卵囊孢子化率最小。蛇床子濃度為25 mg/mL和100 mg/mL時，不同處理時間間無顯著差異；蛇床子濃度為50 mg/mL時，處理4 h與2 h、16 h間差異極顯著，處理2 h和16 h間無顯著差異；蛇床子濃度為75 mg/mL和125 mg/mL時，不同處理時間間差異極顯著。

當處理時間為2 h，蛇床子濃度為125 mg/mL處理兔球蟲卵的卵囊孢子化率最??；處理時間為4 h和16 h，蛇床子濃度均為75 mg/mL處理兔球蟲卵的卵囊孢子化率最小。處理時間2 h時，蛇床子濃度125 mg/mL與25 mg/mL、50 mg/mL、75 mg/mL、100 mg/mL間差異極顯著；處理時間4 h時，蛇床子濃度75 mg/mL與25 mg/mL、100 mg/mL、125 mg/mL間差異極顯著；處理時間16 h時，蛇床子濃度75 mg/mL與25 mg/mL、50 mg/mL、125 mg/mL間差異極顯著。

6) 石榴皮。在石榴皮濃度為25 mg/mL和50 mg/mL時，均表現(xiàn)為處理2 h兔球蟲卵的卵囊孢子化率最小，其余濃度均表現(xiàn)為處理4 h兔球蟲卵的卵囊孢子化率最小。石榴皮濃度為25 mg/mL、50 mg/mL和100 mg/mL時，不同處理時間兔球蟲卵的卵囊孢子化率差異極顯著。石榴皮濃度為75 mg/mL時，處理4 h與16 h、2 h與16 h間差異極顯著；石榴皮濃度為125 mg/mL時，處理4 h與2 h、2 h與16 h間差異極顯著，4 h與16 h間無顯著差異。相同處理時間，均以125 mg/mL處理兔球蟲卵的卵囊孢子化率最小，且與其余濃度處理間差異極顯著。

7) 蒼術。當蒼術濃度為25 mg/mL和50 mg/mL時，均表現(xiàn)為處理4 h兔球蟲卵的卵囊孢子化率最小，其余濃度均表現(xiàn)為處理16 h兔球蟲卵的卵囊孢子化率最小。蒼術濃度為25 mg/mL，處理4 h和2 h間無顯著差異，4 h和16 h、2 h和16 h間差異極顯著；蒼術濃度為50 mg/mL，處理4 h和2 h間差異極顯著，處理4 h和16 h、2 h和16 h間無顯著差異；蒼術濃度為75 mg/mL和 100 mg/mL，不同處理時間間無顯著差異。蒼術濃度為125 mg/mL，處理2 h與16 h間差異極顯著，處理2 h和4 h、4 h與16 h無顯著差異。

當蒼術處理時間相同，均表現(xiàn)為125 mg/mL處理兔球蟲卵的卵囊孢子化率最小，且與其余濃度處理間差異極顯著。

8) 川楝子。當川楝子濃度為25 mg/mL、100 mg/mL和125 mg/mL時，均表現(xiàn)為處理16 h兔球蟲卵的卵囊孢子化率最小，其余濃度均表現(xiàn)為處理4 h兔球蟲卵的卵囊孢子化率最小。川楝子濃度為25 mg/mL、75 mg/mL和100 mg/mL，不同處理時間間無顯著差異；川楝子濃度為50 mg/mL，處理4 h和2 h、16 h間差異極顯著，16 h和2 h間無顯著差異；川楝子濃度為125 mg/mL，處理16 h與2 h、4 h間差異極顯著，4 h和2 h間無顯著差異。

當川楝子處理時間相同，均表現(xiàn)為125 mg/mL處理兔球蟲卵的卵囊孢子化率最小，且與其余濃度處理間差異極顯著。

2.1.2 濃度、時間、濃度與時間的主體效應 對濃度、時間、濃度與時間進行主體間效應檢驗結果表明，三者對石榴皮、穿心蓮、土荊皮、川楝子、枯礬、蛇床子處理兔球蟲卵的卵囊孢子化率影響極顯著，其中對石榴皮、穿心蓮處理兔球蟲卵的卵囊孢子化率的影響依次為濃度>時間>濃度與時間；對土荊皮、川楝子、枯礬處理兔球蟲卵的卵囊孢子化率的影響依次為濃度>濃度與時間>時間；對蒼術處理兔球蟲卵的卵囊孢子化率的孢子化率影響顯著，依次為濃度>濃度與時間>時間；對蛇床子處理兔球蟲卵的卵囊孢子化率的影響依次為濃度與時間>濃度>時間。濃度、時間對桉葉處理兔球蟲卵的卵囊孢子化率影響極顯著，依次為濃度>時間。

2.2 不同處理兔球蟲卵的抑卵囊孢子率

由表2可知，土荊皮抑卵囊孢子率在同一時間梯度內(nèi)與藥液濃度呈正相關，同一濃度梯度內(nèi)與藥液作用時間亦呈正相關，且濃度125 mg/mL時，作用16 h后抑孢子化程度最好，抑制率達83.10%；桉葉抑卵囊孢子率在同一時間梯度內(nèi)與藥液濃度呈正相關，同一濃度梯度內(nèi)與藥液作用時間亦呈正相關，藥液濃度125 mg/mL時，作用4 h后抑孢子化程度最好，抑制率為80.83%；穿心蓮土荊皮抑卵囊孢子率在同一時間梯度內(nèi)與藥液濃度呈正相關，藥液濃度125 mg/mL時，作用2 h后抑孢子化程度最好，抑制率達55.65%；枯礬藥液濃度75 mg/mL時，作用4 h后抑孢子化程度最好，抑制率達53.45%；蛇床子藥液濃度75 mg/mL時，作用4 h后抑孢子化程度最好，抑制率達48.29%；石榴皮同一濃度梯度內(nèi)與藥液作用時間呈正相關，藥液濃度125 mg/mL時，作用4 h后抑孢子化程度最好，抑制率達33.45%；蒼術藥液濃度125 mg/mL時，作用16 h后抑孢子化程度最好，抑制率達13.88%；川楝子抑卵囊孢子率最弱，125 mg/mL作用16 h后抑制率僅達13.27%。

表2 8種中藥材提取物處理不同時間兔球蟲卵的抑卵囊孢子率 Table 2 Inhibitory rate of 8 Chinese medicine extracts treated rabbit coccidian oocysts with different time

3 討論

我國中藥材資源豐富，為篩選抗球蟲藥物提供了物質基礎。土荊皮是具有殺蟲、治癬疥等功效的常用中藥材，內(nèi)含土荊皮二萜酸、多酚(酸)類物質等多種化合物。桉葉主要含有桉葉油、黃酮類、有機酸類、酚類等具有較高生理活性的能抑制寄生蟲的有效成分。研究發(fā)現(xiàn)，土荊皮和桉葉均有很好的抑制兔球蟲卵囊孢子化的效果，可能與二者的主要化學成分有關?？莸\主要用于收濕斂瘡、止血化腐，對大腸桿菌、痢疾桿菌等致病菌也有明顯的抑菌作用。研究發(fā)現(xiàn)，枯礬的抑/殺球蟲孢子化的效果也較好。

周鈺奇等[16]用穿心蓮片飼喂感染柔嫩艾美耳球蟲的雞發(fā)現(xiàn)，200 mg組中感染雞的血便排出推遲1 d，且明顯降低血便記分和糞便卵囊排出量，同時給予穿心蓮片劑能部分緩解球蟲感染對中樞免疫器官發(fā)育的抑制作用。李宗波等[17]用川楝子治療雞球蟲病效果明顯，且能夠促進雞免疫器官的發(fā)育和增強機體的免疫力。研究發(fā)現(xiàn)，穿心蓮對兔球蟲卵有一定的效果，而川楝子效果最差，后期可考慮在兔體內(nèi)用藥做進一步研究。馬明智[18]用含有蛇床子、蒼術等中草藥煎劑飼飲患球蟲病獺兔，總有效率達90%。祝學珍[13]研究發(fā)現(xiàn)，蛇床子、蒼術有一定的抑制雞球蟲卵囊孢子化的效果，蒼術優(yōu)于蛇床子，但研究中蛇床子抑殺效果好于蒼術，蒼術的效果不明顯，可能與球蟲的種類不同有關，同時也提示蛇床子和蒼術不管在體內(nèi)還是體外對兔球蟲卵囊孢子化均有抑殺效果。王璽德等[19]研究發(fā)現(xiàn)，石榴皮水提物有較好的體外抑制兔球蟲卵囊孢子化的效果；但劉陽等[10]用石榴皮水提物直接對人工感染球蟲病的兔新鮮糞便進行孢子化抑制效果檢驗發(fā)現(xiàn)其抑制效果弱。研究發(fā)現(xiàn)，石榴皮對兔球蟲卵囊孢子化也有一定的抑制效果，但效果不佳，可能和藥液的用藥劑量有關。因此在尋找藥物時，不僅要關注藥物的品種，還要對藥物的不同質量濃度進行研究。多數(shù)中草藥以高濃度抑球蟲卵囊效果優(yōu)于低濃度。綜上，土荊皮、桉葉等中藥材對兔球蟲卵囊孢子化具有顯著抑制效果，川楝子對抑制兔球蟲卵囊孢子化效果不理想，下一步可以考慮將單味中藥材制成復合制劑。研究還發(fā)現(xiàn)，穿心蓮、川楝子、蛇床子、蒼術等藥物的體外抑殺球蟲效果與體內(nèi)用藥的報道不太一致，可能因為球蟲在體內(nèi)外的發(fā)育階段和環(huán)境不同所致。研究中大部分中草藥對球蟲卵囊孢子化的抑制是隨著濃度的增大而加強，與田美杰等[7]的研究結果一致。說明濃度是影響土荊皮等中藥材體外抗球蟲卵效果的重要因素。試驗所選用的中草藥均具有驅蟲殺蟲、祛濕、清熱解毒、止血等功用，但試驗結果表明，部分藥物對球蟲的抑/殺效果明顯，仍有一些藥物效果不太理想。因此，要篩選出有效的抗球蟲藥物，除考慮中草藥本身功用，或與其他藥物聯(lián)用外，還需進一步對中藥材作用的濃度和作用對象進行研究。研究表明，所選用的8味中藥材水提物對兔球蟲卵囊孢子化均具有不同程度的抑制作用，大部分中藥材濃度越高，抑制效果越好，與作用時間有一定的相關性。抑制兔球蟲卵囊孢子化的效果與藥材種類有關，蛇床子的抑殺效果與時間和濃度共同作用有關，土荊皮、桉葉、穿心蓮及枯礬等7種的濃度是影響體外抗球蟲卵效果的重要因素。

4 結論

根據(jù)卵囊孢子抑制率，125 mg/mL土荊皮作用16 h效果最好，其對兔球蟲卵的抑卵囊孢子率為83.10%；125 mg/mL川楝子作用16 h的效果最差，其對兔球蟲卵的抑卵囊孢子率為13.27%。