葉 瑩，曾怡林，虞凡霜，張凱東，強 遙，蔣軍喜

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，江西 南昌 330045)

0 引言

【研究意義】茄子褐紋病是國內(nèi)外茄子生產(chǎn)上的一種重要病害[1]，近年來在江西省南昌市普遍發(fā)生，給當(dāng)?shù)厍炎由a(chǎn)造成嚴(yán)重經(jīng)濟損失。【前人研究進展】該病由半知菌類真菌茄褐紋擬莖點霉(Phomopsisvexans)，有性世代為子囊菌門間座殼屬茄褐紋間座殼(Diaporthevexans)侵染所致[2]，主要危害茄子葉片、枝干和果實，常引起葉斑、枝枯和果腐等癥狀，以果腐損失最大[3-4]。自1892年HALSTED報道茄子褐紋病后，世界各地茄子栽培地區(qū)均有該病的研究報道，國內(nèi)外學(xué)者關(guān)于茄子褐紋病的研究主要集中在病原菌鑒定、致病機制、抗性遺傳及抗病品種篩選等方面[5-9]。目前，僅有吳仁鋒等[10]對武漢地區(qū)茄褐紋病菌的培養(yǎng)性狀進行相關(guān)研究，而對于茄子褐紋病菌的藥劑篩選僅有湖南、山東及安徽等地開展室內(nèi)毒力測定?！狙芯壳腥朦c】與其他地區(qū)相比，南昌市茄褐紋病的研究還不夠深入和系統(tǒng)，有關(guān)病原菌生物學(xué)特性和藥劑篩選方面的報道還很少見?！緮M解決的關(guān)鍵問題】鑒于此，開展南昌地區(qū)茄褐紋病菌生物學(xué)特性及其防治藥劑室內(nèi)毒力研究，以期為該病的藥劑防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 供試菌株H1由江西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)實驗室于2020年7月從南昌市郊茄褐紋病病葉中分離所得，經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定確定為茄褐紋病菌(Phomopsisvexans)，并經(jīng)致病性測定為強致病力菌株。該菌株用瓊脂培養(yǎng)基(PCA)斜面保存于4℃冰箱，試驗前在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)平板上活化。

1.1.2 培養(yǎng)基 試驗共選取8種培養(yǎng)基作為供試培養(yǎng)基，即茄葉煎汁培養(yǎng)基、PDA、馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(PSA)、燕麥片培養(yǎng)基(OMA)、玉米片培養(yǎng)基(CMA)、胡蘿卜培養(yǎng)基(CA)、水瓊脂培養(yǎng)基(WA)和查氏培養(yǎng)基(Czapek)，各培養(yǎng)基參照文獻[11]的方法配制。

1.1.3 藥劑 供試藥劑共8種，具體信息見表1。

表1 8種供試藥劑的基本情況Table 1 Eight fungicides used in the experiment

1.2 方法

1.2.1 試驗設(shè)計

1) 病原菌生物學(xué)特性測定。采用單因素試驗設(shè)計設(shè)置不同溫度、pH、光照條件、培養(yǎng)基、碳源和氮源等培養(yǎng)條件，測定茄褐紋病菌在不同條件下的生長狀況，以篩選其最適生長條件。在PDA平板上培養(yǎng)3 d的菌落邊緣打取直徑5 mm的菌餅，將菌餅接種在平板培養(yǎng)基的中央，按設(shè)置的不同條件培養(yǎng)，3次重復(fù)。試驗條件：溫度，將菌餅接種于PDA平板中央，分別放置于5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃和35℃的恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)；pH，將菌餅接種在用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH調(diào)配的pH分別為3、4、5、6、7、8、9、10、11、12和13的PDA平板上，25℃全黑暗培養(yǎng)[12-13]；光照條件，將接種的PDA平板分別置于24 h黑暗、12 h光暗交替和24 h光照條件下25℃培養(yǎng)[14]；培養(yǎng)基，將菌餅分別接種于PDA、PSA、OMA、CMA、CA、WA、Czapek和茄葉煎汁培養(yǎng)基共8種培養(yǎng)基上，25℃全黑暗培養(yǎng)；碳源，以Czapek培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用葡萄糖、纖維二糖、α-乳糖、麥芽糖、甘露醇、山梨醇和可溶性淀粉取代Czapek培養(yǎng)基中的蔗糖，配置成8種不同的碳源培養(yǎng)基[15]，將菌餅分別接種于8種不同碳源的培養(yǎng)基上25℃全黑暗培養(yǎng)；氮源，以Czapek培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用硝酸鉀、磷酸二氫銨、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、硝酸銨和氯化銨取代Czapek培養(yǎng)基中的硝酸鈉，配置成8種不同的氮源培養(yǎng)基[15]，將菌餅分別接種于8種不同的氮源培養(yǎng)基上25℃全黑暗培養(yǎng)。

2) 病原菌室內(nèi)毒力測定。采用菌絲生長速率法[16]測定8種藥劑對菌株H1的毒力，在預(yù)實驗的基礎(chǔ)上，先將各藥劑按其有效成分分別稀釋為9個質(zhì)量濃度梯度。各藥劑分別與PDA培養(yǎng)基按1∶9混合均勻后倒入滅菌的培養(yǎng)皿中，制成濃度為1×103μg/mL、2.5×102μg/mL、6.3×101μg/mL、1.6×101μg/mL、3.9×100μg/mL、1×100μg/mL、2.4×10-1μg/mL、6.1×10-2μg/mL和1.5×10-2μg/mL的含藥平板，同時以等量的無菌水代替藥液制作對照平板。將直徑5 mm的適齡菌餅接種于不同濃度梯度的含藥和對照平板中央，3次重復(fù)，25℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)。

1.2.2 指標(biāo)測定 接種培養(yǎng)6 d后，采用“十字交叉法”[12]測量菌落直徑，計算菌絲生長速率并根據(jù)菌絲生長速率大小判斷生長條件優(yōu)劣；以藥劑濃度的對數(shù)為自變量(x)，相對抑制率的概率值為因變量(y)，擬合8種殺菌劑對茄褐紋擬莖點霉的獨立回歸方程，計算各藥劑的抑菌率、抑制中質(zhì)量濃度(EC50)及相關(guān)系數(shù)(R)，根據(jù)EC50判斷各藥劑的毒力大小，即藥劑的EC50越小，其對病原菌毒力越強[17]。

菌絲生長速率=(菌落生長直徑-菌餅直徑)/菌落培養(yǎng)天數(shù)

抑菌率=(對照組凈菌落直徑-處理組凈菌落直徑)/對照組凈菌落直徑×100%

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

利用SPSS 22和Excel 2010對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌生物學(xué)特性研究

從圖1看出，病原菌P.vexans在不同溫度、pH、光照條件、培養(yǎng)基、碳源和氮源等培養(yǎng)條件下生長速率存在差異。

2.1.1 溫度 病原菌P.vexans在10～30℃條件下均能生長，隨著溫度升高菌絲生長速度呈先升后降趨勢，生長速率依次為 25℃>20℃>30℃>15℃>35℃>10℃>5℃。各處理間均存在顯著差異，其中，5℃停止生長，≥35℃幾乎不生長，25℃時菌絲生長最快，生長速率達(dá)11.06 mm/d。表明，該菌的最適生長溫度為25℃。

2.1.2 pH 病原菌P.vexans在pH為3～12時均能生長，隨著pH增大菌絲生長速度呈先升后降趨勢，生長速率依次為6>5>4=7>8>9>10>3>11>12>13。其中，pH 13時停止生長，pH 4～7時適宜病菌生長，pH 6時菌絲生長最快，達(dá)12.50 mm/d，顯著高于其余處理，pH 4和pH 7時病菌的生長速率相等。表明，病原菌P.vexans生長最適pH為6，喜偏酸性環(huán)境。

2.1.3 光照條件 病原菌P.vexans在連續(xù)黑暗、光暗交替和連續(xù)光照3種光照條件下均能生長，其生長速率分別為11.00 mm/d、10.92 mm/d和9.36 mm/d，各處理間均存在顯著差異，其中，在連續(xù)黑暗條件下生長速率最快，顯著高于其余2個處理，光暗交替下的生長速率顯著高于連續(xù)光照。表明，黑暗條件更有利于病原菌P.vexans的菌絲生長。

2.1.4 培養(yǎng)基 病原菌P.vexans在8種不同培養(yǎng)基上均能生長，生長速率為5.06～12.36 mm/d，依次為馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基>馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基>胡蘿卜培養(yǎng)基>燕麥片培養(yǎng)基>玉米片培養(yǎng)基>茄葉煎汁培養(yǎng)基>查氏培養(yǎng)基>水瓊脂培養(yǎng)基，各處理間均存在差異。病原菌在PSA培養(yǎng)基上生長速率最快，菌絲發(fā)達(dá)，生長速率達(dá)12.36 mm/d，其次為PDA、CA、OMA、CMA和茄葉煎汁培養(yǎng)基，生長速率分別為11.63 mm/d、11.08 mm/d、10.44 mm/d、9.44 mm/d和8.25 mm/d，在Czapek培養(yǎng)基和WA培養(yǎng)基上生長速率最緩慢，且菌絲極不發(fā)達(dá)，不適合該病原菌生長。

注：不同大小寫字母分別表示差異達(dá)極顯著(P<0.01)和顯著水平(P<0.05)。Note：Different capital and lowercase letters indicate significance of difference at P<0.01 and P<0.05 level.圖1 不同溫度、pH、光照條件、培養(yǎng)基、碳源和氮源處理病原菌菌絲的生長速率Fig.1 Growth rate of pathogen mycelium treated with different temperature, pH, light condition, culture media, carbon source and nitrogen source

2.1.5 碳源 病原菌P.vexan在8種供試碳源培養(yǎng)基上均能生長，生長速率為5.86～9.00 mm/d，依次為麥芽糖>可溶性淀粉>葡萄糖>纖維二糖>α-乳糖>查氏>甘露醇，各處理間存在顯著差異。其中，在以麥芽糖為碳源的平板上生長最快，菌絲生長速率達(dá)9.00 mm/d，極顯著高于其余處理；其次是可溶性淀粉和葡萄糖，分別為7.55 mm/d和7.50 mm/d，二者差異不顯著，但均極顯著高于其余處理；在以甘露醇為碳源的平板上生長最慢，其菌絲生長速率僅為5.86 mm/d，顯著低于其余處理。表明，麥芽糖為病原菌P.vexan最適生長碳源。

2.1.6 氮源 病原菌P.vexan在8種供試氮源培養(yǎng)基上均能生長，生長速率為5.19～8.03 mm/d，依次為蛋白胨>氯化銨>酵母膏>查氏>牛肉膏>磷酸二氫銨>硝酸鉀>硝酸銨，處理間存在顯著或極顯著差異。其中，蛋白胨平板上菌絲生長最快，生長速率達(dá)8.03 mm/d，極顯著高于其余處理；其次是氯化銨和酵母膏，分別為6.83 mm/d和6.64 mm/d，二者差異不顯著，但均極顯著高于除查氏外的其余處理；氯化銨為氮源的菌絲生長速率顯著高于查氏；硝酸銨平板上菌絲生長最慢，生長速率僅為5.19 mm/d。表明，蛋白胨為病原菌P.vexan最適生長氮源。

2.2 8種殺菌劑對病原菌的室內(nèi)毒力

2.2.1 毒力回歸方程 從表2看出，通過擬合得到8種殺菌劑對茄褐紋病病原菌P.vexan的毒力回歸方程：y40%氟硅唑=0.381x+1.719(R=0.944)，y15%三唑酮=0.328x+0.500(R=0.993)，y70%丙森鋅=0.586x+0.996(R=0.938)，y50%戊唑醇·25%嘧菌酯=1.268x+1.445(R=0.915)，y70%甲基硫菌靈=1.283x+1.146(R=0.934)，y43%戊唑醇=1.769x+1.463(R=0.977)，y50%異菌脲=1.281x+0.791(R=0.949)，y40%嘧霉胺=1.265x-1.144(R=0.926)，相關(guān)系數(shù)R均>0.9，表明，各藥劑濃度與抑制率間存在良好的線性關(guān)系。

表2 8種殺菌劑對茄褐紋病菌的室內(nèi)毒力強度Table 2 Indoor virulence intensity of eight fungicides against P. vexans

2.2.2 毒力強度 從表5看出，各藥劑的EC50為0.012～8.013 μg/mL，依次為40%氟硅唑<15%三唑酮<70%丙森鋅<50%戊唑醇·25%嘧菌酯<70%甲基硫菌靈<43%戊唑醇<50%異菌脲<40%嘧霉胺，表明，40%氟硅唑?qū)Σ≡囊种菩Ч詈?，EC50為0.012 μg/mL；其次是15%三唑酮、70%丙森鋅和50%戊唑醇·25%嘧菌酯，EC50分別為0.02 μg/mL、0.03 μg/mL和0.072 μg/mL，均<0.10 μg/mL；40%嘧霉胺抑制效果相對最差，EC50為8.013 μg/mL。

3 討論

吳仁鋒等[10]研究武漢市茄褐紋病菌生物學(xué)特性發(fā)現(xiàn)，菌絲生長最適溫度為30℃，最適培養(yǎng)基為PDA，最適pH為6，最適光照條件為24 h全光照，最佳碳源和氮源分別為麥芽糖和硝酸鈉。與該研究結(jié)果存在明顯差異，表明，茄褐紋病菌內(nèi)部存在較明顯的生理分化現(xiàn)象。該生理分化現(xiàn)象是否與茄褐紋病菌致病性有關(guān)有待進一步研究。馬珂[18]篩選到咪鮮胺、撲海因和甲基硫菌靈等對安徽和縣茄褐紋病菌毒力較高的藥劑；王姝瑋等[19]篩選到咪鮮胺、甲基硫菌靈和苯醚甲環(huán)唑等對湖南新化茄褐紋病菌表現(xiàn)高效的藥劑；李艷青等[20]研究表明，多菌靈對山東壽光茄褐紋病菌具有強毒力。由于藥劑在田間的實際防效受寄主、病原和環(huán)境條件等特性及相互關(guān)系的影響，因此，該研究篩選出的氟硅唑、三唑酮、丙森鋅、戊唑醇·嘧菌酯、甲基硫菌靈、戊唑醇和異菌脲等7種殺菌劑對南昌市茄褐紋病菌的防效還有待進一步的田間藥效試驗進行驗證，以確定真正有效的藥劑種類和使用濃度。

4 結(jié)論

研究結(jié)果表明，該菌生長最適溫度為25℃，最適pH為6，全黑暗條件下菌絲生長速率最快，最適培養(yǎng)基為PSA，最佳碳源和氮源分別為麥芽糖和蛋白胨。氟硅唑、三唑酮、丙森鋅、戊唑醇·嘧菌酯、甲基硫菌靈、戊唑醇和異菌脲7種殺菌劑對南昌市茄褐紋病菌均具有強毒力，嘧霉胺的毒力則較弱，可推薦前7種殺菌劑在當(dāng)?shù)厣a(chǎn)上防控茄褐紋病使用。該研究為茄褐紋病發(fā)病規(guī)律研究奠定了一定的基礎(chǔ)，同時，上述藥劑可為今后開展田間藥效試驗提供參考。