劉 輝，周玉鋒*，周羅娜，趙興麗，羅林麗，賀圣凌，張 欣

(1.貴州省農業(yè)科學院 生物技術研究所，貴州 貴陽 550006； 2.貴州省農業(yè)生物技術重點實驗室，貴州 貴陽 550006)

0 引言

茶餅病是由壞損外擔菌(ExobasidiumvexansMassee)侵染引起的一種茶樹真菌病害，主要危害茶樹嫩葉、新梢，不僅影響產量，而且用感病芽葉生產的茶葉易碎且味苦，茶葉品質顯著下降，嚴重影響茶農經(jīng)濟效益[1]。1868年首次報道在印度阿薩姆地區(qū)發(fā)現(xiàn)該病菌，其于1908年成為當?shù)夭鑸@的地方??；1947年首次報道該病在斯里蘭卡規(guī)?；l(fā)生，之后相繼在印度、印度尼西亞、馬來西亞及日本等國發(fā)現(xiàn)[2]；我國(安徽)最早于1903年記載茶餅病的發(fā)生[3]。20世紀40年代末，各國學者展開了對茶餅病病原物生物學、流行和預測及防治技術等方面的研究[3-9]。茶餅病主要分布在南緯8°至北緯35°，東經(jīng)75°～138°的區(qū)域，亞洲各產茶國及歐洲部分地區(qū)如意大利均有發(fā)生[4]。我國的產茶區(qū)，除江北茶區(qū)外，均有茶餅病的發(fā)生，尤以西南和中南產茶區(qū)的高山茶園發(fā)生較嚴重[5]。茶餅病屬于低溫高濕型病害，尤以濕度對茶餅病的影響最大[6]。當連續(xù)10～14 d保持11 h空氣相對濕度均>80%時，壞損外擔菌擔孢子隨風飄落至茶樹嫩葉或新梢上的水滴中，在水環(huán)境中萌發(fā)侵入茶葉，后經(jīng)3～18 d長出子實層，形成病斑。成熟擔孢子可進行飛散傳播，從而導致茶園大面積感染[7]。日照也是影響茶餅病流行的主要因子之一，在發(fā)病期晨照連續(xù)<4 h，可促進發(fā)?。蝗羧照?4 h，則可抑止病害流行。發(fā)病適宜氣溫為15～20℃，若氣溫>31℃，則可抑止病害發(fā)生[8-9]。因此，茶樹有大量嫩梢、嫩葉存在及溫和濕潤的氣候條件是該病流行所需的兩大重要條件[5]。我國茶區(qū)茶餅病的流行一般在3-4月，9-10月為流行盛期[9]。關于茶餅病的流行規(guī)律、病原菌分離及防治技術等已有大量研究報道，但鮮見關于病原菌與寄主互作機制的研究報道。為科學、高效、綠色地防控及進一步研究茶餅病提供理論依據(jù)，從茶餅病病原菌、病原菌與茶樹互作機制等方面對2010年以來國內外相關研究進展進行綜述。

1 病原菌

1.1 形態(tài)特征

茶餅病病原菌為壞損外擔菌(ExobasidiumvexansMassee)，屬擔子菌亞門外擔菌目外擔菌屬真菌。病葉泡狀區(qū)的橫切面觀察結果(圖1)表明，壞損外擔菌菌絲體生長在植物細胞間并形成手指狀吸器結構侵入到葉片薄壁細胞中。菌絲體生長到一定時期，在感病葉底面的上表皮細胞中形成子實層。子實層密集地排列著無數(shù)棍棒型、單胞、無色的擔子，形成柵欄結構。擔子大小為(30～50)μm×(3～6)μm，頂生3～4個小梗，每個小梗上頂生1個擔孢子。擔孢子呈腎形或橢圓形，頂端略圓，基部稍尖，大小為(9～16)μm×(3.5～6)μm。感病茶樹葉片上的白色粉末即為無數(shù)的擔子和擔孢子[4]。

1.2 培養(yǎng)條件

目前，關于茶餅病病原種類的報道不多，原因在于E.vexans曾被認為是絕對寄生的專性活體營養(yǎng)真菌，其生活史只能在茶樹上完成[10]。而后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，E.vexans也能在maltsalep、馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(PSA)和馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)等培養(yǎng)基上生長，但需要添加一些天然活性物質，如水溶性維生素B[11]，菌落形成時間大致為20～30 d，而在茶樹上完成一個世代的時間大致為11～28 d；在適宜條件下，病原可完成多個世代的繁殖[12]。盡管如此，仍未能形成穩(wěn)定有效且可重復的培養(yǎng)基。為篩選穩(wěn)定可靠的茶餅病病原菌體外培養(yǎng)基，CHALIHA等[13]采用響應面法優(yōu)化適宜茶餅病病原孢子生長的培養(yǎng)基發(fā)現(xiàn)，最優(yōu)查氏(Czapek dox)培養(yǎng)基配方為1 000 mL體系中添加6 g碳源、15%(W/V)茶葉提取物、0.4 g CaCO3，pH 6.5和25℃培養(yǎng)溫度；最優(yōu)PDA培養(yǎng)基為3 g碳源、30%(W/V)茶葉提取物、0.4 g CaCO3，pH 6.5和25℃培養(yǎng)溫度；最優(yōu)V8 Juice配方為0.35 g碳源、7.5%(W/V)茶葉提取物、0.6 g CaCO3，pH 5.75和27.5℃培養(yǎng)溫度。在上述3種配方培養(yǎng)基上，E.vexans可獲得最大量的可育菌絲，且可存活5周，為下一步研究茶餅病的發(fā)病機理、設計防治策略奠定關鍵基礎。

1.3 生理小種

VENKATE等[14]報道，E.vexans可能存在多個生理小種。ABEYSINGHE等[15-16]研究證實，采自斯里蘭卡不同地區(qū)的E.vexans具有不同長度和寬度的孢子形態(tài)，RAPD-PCR和ITS序列分析結果也表明其存在基因型變異和遺傳多樣性。最新研究結果表明，茶餅病是由多種病原菌共存和協(xié)同作用引起的茶樹病害，導致茶餅病發(fā)病機制的研究變得異常復雜。BARMAN等[17]從多種茶樹病葉中收集不同發(fā)病時期的茶餅病病斑，從中分離得到42種病菌，根據(jù)菌落、菌絲和孢子形態(tài)觀察，以及ITS-RFLP鑒定和體外致病性測定發(fā)現(xiàn)，Pestalotiopsis和Nigrospora是茶餅病中協(xié)同存在的2種主要病菌，其可以在茶餅病發(fā)生期間誘發(fā)茶樹并發(fā)癥，并反過來促進茶餅病的流行。此研究有助于茶餅病的新型有效防控技術策略的研發(fā)，但由于田間環(huán)境的復雜性，此研究結果仍需進一步驗證。

2 病原菌與茶樹互作機制

2.1 病原菌的侵染過程

前人研究發(fā)現(xiàn)，可將茶餅病的發(fā)生時期分為7個階段：第1階段，從病原菌穿透角質層第3天開始，直至產生直徑<0.5 mm的半透明斑點；隨著斑點逐漸擴大，危害過渡到2～4階段；第5階段，病害損害開始膨脹，典型癥狀為葉正面凹陷平滑且發(fā)亮，葉背面凸出，暗色、灰色，呈粉末狀增厚，最后變?yōu)榧儼咨禊Z絨狀，此階段E.vexans可擴展到海綿組織的細胞間；第6階段，少量孢子形成；第7階段，大量孢子形成[10,12]。趙曉珍等[12]通過過碘酸-希夫(氏)(PAS)、甲苯胺藍(TBO)、臺盼藍(Trypan blue)和伊文思藍(Evans blue)組織染色觀察，將茶餅病在茶葉上的侵染過程分為4個階段(圖2)：第1階段，孢子侵染的0～24 h，擔孢子利用芽管穿過葉片下表皮表皮細胞合縫處的角質層，也可通過氣孔到達海綿組織的細胞間進行增殖。第2階段，孢子侵染的1～7 d，孢子萌發(fā)階段，在此期間茶葉組織仍保持較完整的細胞結構；但PAS染色結果表明，海綿組織細胞中紅色顆粒堆積增多，邊界明顯。第3階段，孢子侵染的7～14 d，吸器形成階段，可觀察到病害侵染的典型特征；伴隨E.vexans對茶樹葉片組織細胞營養(yǎng)物質的利用，茶樹葉片細胞營養(yǎng)耗竭，而細胞和病原都趨向死亡。但同時也誘導了植物的防御機制，對病原的擴展起到抑制作用，可見著色的死亡擔孢子和菌絲體。第4階段，孢子侵染的14～20 d時，孢子形成以及進行2次侵染。

注：A、B，感病葉片的橫切面；C，子實層中的棒狀菌絲結構；D，擔子和擔孢子結構；E、F，含有明顯分割層的成熟擔孢子；G，萌發(fā)中的孢子結構(含頂端長有吸器結構的萌發(fā)管)。Note: A and B, transverse section of diseased leaves; C, club-shaped hyphae structure in the hymenial layer; D, basidium and basidiospore structures; E and F, mature basidiospores with clearly segmented layer; G, spore structure in germination(containing a germinating tube with a haustorium structure at the end).圖1 茶餅病病原菌的形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of pathogen in tea blister blight

注：A，健康茶葉葉片；B～D，病原侵染茶樹葉片1～3階段。上表皮層，Up-epidermis (up-EP)；柵欄組織，Palisade tissue(PT)；海綿組織，Spongy tissue(ST)；下表皮層，Down-epidermis(down-EP)。箭頭所指為Exobasidium vexans的擔孢子、擔子及菌絲。Note: A, leaf of healthy tea; B-D, 1-3 stages of pathogen infected tea leaves. up-EP, Up-epidermis; PT, Palisade tissue; ST, Spongy tissue; down-EP, Down-epidermis. The arrows indicate the basidiospore, basidium and hyphae of Exobasidium vexans.圖2 PAS染色觀察E. vexans侵染茶樹真葉的組織結構Fig.2 Tissue structure of E. vexans infected tea leaves by using PAS staining

2.2 茶餅病病原菌與茶樹互作的生理和分子機制

2.2.1 分子機制 經(jīng)長期進化，植物形成了一套復雜的免疫系統(tǒng)。植物自身可以通過模式識別受體(pattern recognition receptors，PRR)識別病原體相關分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)并觸發(fā)早期防御機制，包括活性氧爆發(fā)(ROS burst)、絲裂原活化蛋白激酶(smitogen-activated protein kinases，MAPK)激活、胼胝質沉積(callose deposition)及抗性蛋白和防御酶基因表達等，從而調控茶餅病響應過程中的各種生理和生化反應過程，也叫系統(tǒng)獲得性抗性(systemic acquired resistance，SAS)。同時，病原菌可以向植物細胞遞送效應物以抑制病原相關分子模式誘導的免疫系統(tǒng)(PAMP-triggered immunity，PTI)，但是一些效應物可以被植物抗性蛋白識別并激活效應子誘導的免疫系統(tǒng)(effector-triggered immunity，ETI)。ETI是一種強烈的防御反應，引起細胞程序性死亡以及一些信號分子如水楊酸(SA)、茉莉酸(JA)及脫落酸(ABA)等的積累[18]。當前，只有少部分有關茶餅病抗性基因在茶樹中被鑒定，通過細胞組學技術可以系統(tǒng)揭示茶樹對茶餅病的響應機制。BHORALI等[19]利用cDNA-AFLF和抑制性消減雜交(SSH)技術，從E.vexans感染的茶樹嫩葉中篩選鑒定得到部分防御相關的新基因；同時發(fā)現(xiàn)，茶樹中能量代謝、運輸、蛋白修飾、細胞壁防御、氧化脅迫響應及信號傳導相關蛋白與抗茶餅病顯著相關。利用RNA sequencing技術從茶樹葉片中鑒定得到149個基因參與茶餅病免疫響應過程，包括30個防御相關酶，25個resistance genes(R基因)，9個耐藥轉運蛋白，65個轉錄因子，9個逆轉錄轉座子和其他防御相關基因，其中大部分基因上調表達；茶樹可以通過核苷酸結合富亮氨酸重復序列(Nucleotide Binding Leucine Rich Repeat)介導ETI系統(tǒng)的激活、激活R基因介導SA信號通路以誘導次級代謝產物產生和細胞程序性死亡等以抵御茶餅病病原菌的侵染(圖3)[20]，這些基因也為茶樹抗茶餅病基因的功能鑒定提供了候選基因。

圖3 茶樹對茶餅病的防御機制Fig.3 Defense mechanism in tea trees against blister blight

寄主植物在病原菌入侵過程中可識別某些病原菌中保守物質而激發(fā)植物的免疫機制，如真菌細胞壁中的幾丁質和β-葡聚糖[21]。植物在響應病原菌侵染的過程中可誘發(fā)許多病程相關基因表達〔pathogenesis-related (PR) genes〕，此PR基因既可在病原感染處表達，亦可在非感染區(qū)域表達，在非感染區(qū)域表達的PR蛋白可誘發(fā)植物系統(tǒng)獲得性抗性，對提升植物抵抗病原菌二次攻擊的能力至關重要[22]。幾丁質酶和β-1,3-葡聚糖酶是其中比較典型的具有水解能力的PR蛋白，其中幾丁質酶可催化病原菌細胞壁中幾丁質N-乙酰葡糖胺同聚體間的β-1,4-連接鍵水解，β-1,3-葡聚糖酶則可水解細胞壁上的多聚糖形成低聚糖，從而破壞病原菌細胞壁，使其失去侵染能力[23-24]。研究發(fā)現(xiàn)，通過農桿菌轉馬鈴薯I型幾丁質酶基因和內源1,3-β-D-葡聚糖酶基因能提高茶葉對E.vexans的抗性[25-26]。同時，轉內源1,3-β-D-葡聚糖酶基因茶樹植株中的I型幾丁質酶和類甜蛋白基因表達水平顯著上升，超敏反應增強，進一步證明幾丁質酶和類甜蛋白在茶樹抗茶餅病中的重要作用[25]。

植物病原菌和寄主植物中含有一些以蛋白質、糖蛋白及復雜的碳水復合物聚合體等為存在形式的特異抗原決定簇和識別因子[27]。大量研究證實，植物品種對病害的抗性與寄主植物和病原共有抗原水平有關，共有抗原水平越高的植物品種，其抗病性越差[28]。CHAKRABORTY等[28]研究發(fā)現(xiàn)，茶餅病病原菌E.vexans與不同茶樹品種中可交叉反應的抗原水平越高，茶樹抗茶餅病能力越弱，該抗原物質主要存在于茶樹葉片細胞的葉綠體和細胞質中。因此，該抗原物質可以用于茶樹抗茶餅病品種的鑒定，也可作為一些殺菌劑的靶標，還可作為抗茶餅病茶樹品種分子標記育種的Marker[29]。KARUNARATHNA等[30-31]利用分子標記輔助育種和批量隔離分析技術，從茶樹中成功鑒定得到 SSR DNA marker EST SSR 073，此分子標記與光系統(tǒng)I亞基D(PsaD I)相關，是一種E.vexans抗性蛋白，對提升茶樹抗茶餅病能力和揭示其抗性機理至關重要。

茶樹SAS的激活除了可以通過病原菌侵染誘導外，一些生物或化學誘抗劑也能激活茶樹體內的SAS[32-33]，如水楊酸、苯并噻二唑、CaCl2、殼聚糖及生防菌等可促進茶樹體內防御酶(苯丙氨酸解氨酶、過氧化物酶、抗氧化酶、β-1,3-葡聚糖酶、幾丁質酶和超氧化物歧化酶等)活性、提升木質素含量以增強細胞壁功能、促進一些抗菌物質(黃酮類、原花青素及多酚類等)的生物合成、通過NO通路調控下游功能基因表達等，這既為茶餅病的綠色高效防治提供了藥劑選擇，也為茶樹抗茶餅病機理的揭示奠定關鍵基礎[33-40]。

2.2.2 生理機制 病菌基因和蛋白對植物的危害以最終代謝產物的作用體現(xiàn)。植物中某些特定的黃酮類物質對植物真菌病有抑菌效果。研究發(fā)現(xiàn)，植物特定細胞液泡中的各種原花青素占葉肉細胞的30%～40%，其對植物各種病原菌具有顯著的毒害作用，如，樟子松、番茄枝及桂皮中的原花青素對水稻紋枯病菌、葡萄灰霉病菌等具有顯著抑菌效果，其主要作用靶標包括病原菌的蛋白激酶、對二苯代乙烯氧化酶、脂肪酸合成酶和脂氧合酶等[41]。植物中原花青素有2個合成途徑：一是通過無色花色素還原酶將兒茶素還原成原花青素；一是在花色素還原酶的作用下，將表兒茶素轉換成原花青素。在茶樹葉片中檢測到花色素還原酶活性，并利用cDNA文庫法擴增得到2個花色素還原酶基因CsANR1和CsANR2，表明茶葉是通過表兒茶素途徑合成原花青素[42-47]。PUNYASIRI等[42]研究發(fā)現(xiàn)，E.vexans侵染可促進易感茶樹品種葉片中原花青素的2,3-反式結構異構化為順式結構，并促進其沒食子酸酯化，從而導致其易感茶餅病。

E.vexans入侵茶樹葉片后，葉片中除原花青素對茶餅病能起到抑菌效果外，還發(fā)生一系列其他內在變化，包括一些抗菌代謝物含量的降低，如咖啡堿、多糖類物質、槲皮素、山奈酚糖苷、芹黃素、楊梅酮苷、單萜類和雙萜類物質、倍半萜烯類物質等，同時干擾信號傳導物質水楊酸和茉莉酸的合成，以方便E.vexans在茶樹體內的定植和生長[45，48-49]。在生理水平方面，抗病和感病茶樹品種對茶餅病的響應存在差異，感病葉片的光合速率、蒸騰速率、氣孔導度及水分利用效率明顯下降，同時，E.vexans入侵可導致葉片中總糖、氨基酸、蛋白質和多酚等物質的含量顯著降低，且抗性品種的降低程度顯著低于易感品種[50-51]。另外，E.vexans侵染可改變葉片代謝調控，導致γ-氨基丁酸、茶氨酸、賴氨酸、色氨酸及精氨酸等含量發(fā)生變化[52]。

3 結語

茶餅病感染初期可導致茶樹葉片的光合作用和蒸騰作用效率下降，并顯著影響茶樹氨基酸代謝、蛋白質合成及糖代謝等生物學過程。隨著病原菌的進一步侵染，病斑在擴大到一定程度時就受到限制。與病原菌誘導寄主產生系統(tǒng)獲得性抗性(SAS)機制有關，其主要機制包括：防御酶(苯丙氨酸解氨酶、過氧化物酶、抗氧化酶、β-1,3-葡聚糖酶、幾丁質酶及超氧化物歧化酶等)活性增強，提升木質素含量以增強細胞壁功能，促進一些抗菌物質(黃酮類、原花青素、多酚類及萜類物質等)的生物合成，通過NO、JA及SA信號通路調控下游功能基因表達等。由于相關功能基因的鑒定與驗證工作仍較缺乏，今后還需加強茶樹抗茶餅病病原相關基因的篩選、鑒定和功能驗證研究，為茶樹抗茶餅病品種的培育提供候選基因。