張 欣，盧聲潔，程宇豪，劉思睿，王坤英，趙興麗，羅林麗，周玉鋒*

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 生物技術(shù)研究所，貴州 貴陽(yáng) 550006； 2.貴州大學(xué) 茶學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025； 3.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 茶葉研究所，貴州 貴陽(yáng) 550006)

0 引言

【研究意義】茶輪斑病是茶樹(shù)的一種常見(jiàn)病害，致使茶葉品質(zhì)和產(chǎn)量下降，限制茶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。該病曾造成印度南部茶產(chǎn)業(yè)損失約17%[1]，日本茶葉減產(chǎn)10%～20%[2]。因此，探明茶輪斑病的病原及其防治方法具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】擬盤(pán)多毛孢屬(Pestalotiopsis)是植物常見(jiàn)的病原菌，寄主范圍廣泛，可引起多種植物病害，如P.Neglecta可引起樟子松黑斑病[3]；P.clavispora可引起藍(lán)莓葉斑病[4]；P.versicolor和P.microspora可引起楊梅輪斑病[5]；P.theae可引起茶輪斑病[6]。MAHARACHCHIKUMBURA等[7]聯(lián)合ITS、β-tubulin和tef1基因?qū)M盤(pán)多毛孢屬的分類(lèi)進(jìn)行修訂，從中劃分出新擬盤(pán)多毛孢屬(Neopestalotiopsis)和假擬盤(pán)多毛孢屬(Pseudopestalotiopsis)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在擬盤(pán)多毛孢屬、新擬盤(pán)多毛孢屬和假擬盤(pán)多毛孢屬內(nèi)，可以引起茶輪斑病的病原菌多達(dá)23種[8]?！狙芯壳腥朦c(diǎn)】近年來(lái)，貴州省大力發(fā)展茶產(chǎn)業(yè)，種植面積位居全國(guó)第一[9]。然而，隨著茶樹(shù)種植面積的不斷擴(kuò)大，在高溫高濕等氣候的影響下，茶輪斑病容易大面積發(fā)生。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】鑒于此，于2020年7月從貴州省銅仁市石阡縣采集茶輪斑病標(biāo)本，經(jīng)分離鑒定確定該病由棕櫚擬盤(pán)多毛孢(P.trachicarpicola)引起，在此基礎(chǔ)上開(kāi)展該病原菌生長(zhǎng)的最適溫度、pH、培養(yǎng)基和碳氮源等生物學(xué)特性研究，以期為茶輪斑病防治藥劑的篩選和田間綜合防治措施的制定提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病原菌菌株 菌株SQ-20-1于2020年7月從貴州省銅仁市石阡采集，經(jīng)形態(tài)學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育分析鑒定，確定該菌株為Pestalotiopsistrachicarpicola，菌株保存于貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所。

1.1.2 試劑 蔗糖、乳糖、木糖、葡萄糖、可溶性淀粉、果糖和麥芽糖，亞硝酸鈉、L-丙氨酸、蛋白胨、硝酸鉀、硫酸銨和甘氨酸，鹽酸和氫氧化鈉，市購(gòu)。

1.1.3 培養(yǎng)基 參照方中達(dá)[10]的方法制備馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(PDA)、察氏培養(yǎng)基、燕麥瓊脂培養(yǎng)基(OA)、麥芽浸膏瓊脂培養(yǎng)基(MEA)、水瓊脂培養(yǎng)基(WA)和合成低營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(SNA)，滅菌后備用。

1.2 方法

1.2.1 材料預(yù)處理 菌株SQ-20-1在PDA培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)14 d后，于菌落邊緣取直徑6 mm的菌餅備用。

1.2.2 不同因素對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

1) 培養(yǎng)基。試驗(yàn)設(shè)5個(gè)處理，根據(jù)培養(yǎng)基類(lèi)型依次為PDA、OA、MEA、SNA和WA，將菌餅分別接種至各培養(yǎng)基中央，每個(gè)處理3次重復(fù)，于25℃下培養(yǎng)。

2) 碳源。試驗(yàn)設(shè)8個(gè)處理，以亞硝酸鈉為固定氮源，不同碳源用等量的木糖、乳糖、可溶性淀粉、葡萄糖、麥芽糖和果糖代替察氏培養(yǎng)基(基礎(chǔ)培養(yǎng)基)中的蔗糖，以不含任何碳源的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照(CK)。將菌餅分別接種至不同碳源培養(yǎng)基平板中央，每個(gè)處理3次重復(fù)，于25℃下培養(yǎng)。

3) 氮源。試驗(yàn)設(shè)7個(gè)處理，以蔗糖為固定碳源，不同氮源用等量的L-丙氨酸、蛋白胨、硝酸鉀、硫酸銨和甘氨酸代替察氏培養(yǎng)基(基礎(chǔ)培養(yǎng)基)中的亞硝酸鈉，以不含任何氮源的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照(CK)。將菌餅分別接種至含有不同氮源的培養(yǎng)基平板中央，每個(gè)處理3次重復(fù)，于25℃下培養(yǎng)。

4) pH。試驗(yàn)設(shè)6個(gè)處理，分別用1 mol/L鹽酸溶液和1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié) PDA培養(yǎng)基pH為6、7、8、9、10、11。將菌餅分別接種至相應(yīng)pH的PDA培養(yǎng)基中，每個(gè)處理3次重復(fù)，于25℃下培養(yǎng)。

5) 溫度。試驗(yàn)設(shè)5個(gè)處理，培養(yǎng)溫度分別為19℃、22℃、25℃、28℃和31℃。將菌餅接種至PDA培養(yǎng)基上，分別置于相應(yīng)溫度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.2.3 指標(biāo)測(cè)定 培養(yǎng)7 d后，觀(guān)察各處理菌株SQ-20-1的生長(zhǎng)情況，采用十字交叉法測(cè)量其菌落直徑，3次重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，并應(yīng)用Duncan新復(fù)極差法檢驗(yàn)差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基處理菌株SQ-20-1的菌落形態(tài)及直徑

2.1.1 菌落形態(tài) 從圖1看出，菌株SQ-20-1在PDA、OA、MEA、SNA和WA共5種培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)。其中，菌株SQ-20-1在PAD培養(yǎng)基上菌落呈乳白色，絨狀，氣生菌絲發(fā)達(dá)，中央菌絲淡黃色，背面中央黃褐色向邊緣白色過(guò)渡；在OA培養(yǎng)基上氣生菌絲稀疏，埋生菌絲發(fā)達(dá)，菌落白色，中央產(chǎn)生黑色分生孢子盤(pán)；在MEA培養(yǎng)基上菌落呈白色，氣生菌絲發(fā)達(dá)，絮狀，菌落中央整齊，其背面中央黃色向白色過(guò)渡；在WA培養(yǎng)基中菌落生長(zhǎng)緩慢，無(wú)氣生菌絲，僅有一層稀疏的埋生菌絲；在SNA培養(yǎng)基上菌落呈白色，氣生菌絲絮狀，菌落生長(zhǎng)整齊，背面白色。

注：a-b，PDA培養(yǎng)基(正面，反面)；c-d，OA培養(yǎng)基(正面，反面)；e-f，MEA培養(yǎng)基(正面，反面)；g-h，WA培養(yǎng)基(正面，反面)；i-j，SNA培養(yǎng)基(正面，反面)。Note: a-b, PDA medium(front side, reverse side); c-d, OA medium(front side, reverse side); e-f，MEA medium(front side, reverse side); g-h, WAmedium(front side, reverse side); i-j，SNA medium(front side, reverse side).圖 1 不同培養(yǎng)基處理菌株 SQ-20-1的菌落形態(tài) Fig.1 Colony morphology of strain SQ-20-1 treated with different media

注：不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。Note: Different lowercase letters indicate significance of difference at P<0.05 level. The same below.圖2 不同培養(yǎng)基處理菌株SQ-20-1的菌落直徑Fig.2 Colony diameter of strain SQ-20-1 treated with different media

2.1.2 菌落直徑 從圖2看出，菌株SQ-20-1在各培養(yǎng)基上的菌落直徑為PDA>OA>MEA>SNA>WA，其中，在PDA培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速度最快，培養(yǎng)7 d時(shí)菌落直徑為7.70 cm，顯著高于其余處理，為最適培養(yǎng)基；其次為OA處理，培養(yǎng)7 d，菌落直徑為6.00 cm，與其余處理差異顯著；MEA和SNA處理差異不顯著，但均顯著高于WA處理；WA處理相對(duì)較差，菌落直徑為3.50 cm。

2.2 不同碳源處理菌株 SQ-20-1的菌落形態(tài)及生長(zhǎng)狀況

從圖3和表1看出，菌株SQ-20-1在乳糖、木糖、葡萄糖、可溶性淀粉、果糖、蔗糖及麥芽糖等不同碳源培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)，但菌落生長(zhǎng)速度和菌絲豐度存在差異。

注：a，乳糖；b，木糖；c，葡萄糖；d，可溶性淀粉；e，果糖；f，蔗糖；g，麥芽糖; h，缺碳。Note: a, lactose; b, xylose; c, glucose; d, soluble starch; e, fructose; f, sucrose; g, maltose; h, lacking carbon.圖3 不同碳源處理菌株 SQ-20-1的菌落形態(tài)Fig.3 Colony morphology of strain SQ-20-1 treated with different carbon sources

表1 不同碳源處理菌株 SQ-20-1的生長(zhǎng)狀況Table 1 Growth status of strain SQ-20-1 treated with different carbon sources

2.2.1 菌落形態(tài) 菌株SQ-20-1在果糖處理培養(yǎng)基上略呈淺黃色，其余處理培養(yǎng)基上的菌落多呈白色和米白色。果糖、木糖和乳糖處理的菌絲豐度較好。其中，果糖處理的菌落生長(zhǎng)圓形，菌絲濃厚緊密，呈絨狀；木糖處理的菌絲排列稀疏，絮狀；乳糖處理的氣生菌絲發(fā)達(dá)，菌落中央凹陷，邊緣隆起，菌絲呈絮狀。蔗糖和麥芽糖處理的菌絲豐度次之，二者菌落生長(zhǎng)均不規(guī)則，菌絲稀疏，呈絮狀。葡萄糖和可溶性淀粉處理的菌絲最為稀疏，僅有一層匍匐的氣生菌絲。

2.2.2 菌株的生長(zhǎng) 各處理菌株SQ-20-1的菌落直徑和菌絲生長(zhǎng)速率均為乳糖>麥芽糖>果糖>蔗糖>木糖>缺碳>葡萄糖>可溶性淀粉。其中，乳糖處理生長(zhǎng)速度最快，培養(yǎng)7 d時(shí)菌落直徑為5.57 cm，平均生長(zhǎng)速率達(dá)0.80 cm/d，顯著高于其余處理；麥芽糖、果糖和蔗糖處理生長(zhǎng)速率次之，培養(yǎng)7 d時(shí)平均生長(zhǎng)速率分別為0.68 cm/d、0.55 cm/d和0.51 cm/d，麥芽糖和果糖處理間的生長(zhǎng)速率存在差異顯著；葡萄糖和果糖處理對(duì)菌株SQ-20-1的生長(zhǎng)影響不大，二者處理之間生長(zhǎng)速率差異不顯著。

2.3 不同氮源處理菌株 SQ-20-1的菌落形態(tài)及生長(zhǎng)狀況

從圖4和表2看出，菌株SQ-20-1在以L(fǎng)-丙氨酸、蛋白胨、硝酸鉀、硫酸銨、亞硝酸鈉及甘氨酸等不同氮源培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況存在差異。

表2 不同氮源處理菌株 SQ-20-1的生長(zhǎng)狀況 Table 2 Growth status of strain SQ-20-1 under different nitrogen sources

2.3.1 菌落形態(tài) 各處理菌株SQ-20-1的菌落均呈白色。蛋白胨和硫酸銨處理的菌絲豐度較好，呈絮狀，其中，蛋白胨菌絲排列緊密，大于硫酸銨的菌絲豐度。硝酸鉀、L-丙氨酸和甘氨酸處理的菌絲豐度次之，其中硝酸鉀的菌絲豐度最好，菌落中央菌絲排列緊密，邊緣稀疏，呈絮狀。亞硝酸鈉處理的菌絲豐度最差，菌落生長(zhǎng)緩慢，僅在菌餅邊緣有一層亞透明菌絲。

注：a，L-丙氨酸；b，蛋白胨；c，硝酸鉀；d，硫酸銨；e，亞硝酸鈉；f，甘氨酸；g，缺氮。Note: a, L-alanine; b, peptone; c, potassium nitrate; d, ammonium sulfate; e, sodium nitrite; f, glycine; g, lacking nitrogen.圖4 不同氮源處理菌株 SQ-20-1的菌落形態(tài)Fig.4 Colony morphology of strain SQ-20-1 under different nitrogen sources

2.3.2 菌株的生長(zhǎng) 各處理菌株SQ-20-1的菌落直徑和生長(zhǎng)速度均為L(zhǎng)-丙氨酸>硫酸銨>硝酸鉀>蛋白胨>甘氨酸>缺氮>亞硝酸鈉。其中，菌株在L-丙氨酸為氮源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度最快，培養(yǎng)7 d，菌落直徑達(dá)7.85 cm，平均生長(zhǎng)速度為1.12 cm/d，顯著高于其他處理；其次為硝酸鉀、硫酸銨、蛋白胨和甘氨酸，菌落直徑分別為6.77 cm、6.82 cm、6.73 cm和6.45 cm，菌絲生長(zhǎng)速率分別為0.97 cm/d、0.97 cm/d、0.96 cm/d和0.92 cm/d，各處理間的菌落直徑和生長(zhǎng)速率的差異不顯著；菌株在以亞硝酸鈉為氮源的培養(yǎng)基上的菌落直徑和生長(zhǎng)速度最小/慢，分別為1.73 cm和0.25 cm/d，幾乎不能生長(zhǎng)。

2.4 不同溫度處理菌株 SQ-20-1的菌落直徑

從圖5看出，菌株SQ-20-1在19～28℃均能生長(zhǎng)，各處理菌落直徑為25℃>22℃>19℃>28℃>31℃，處理間存在明顯差異。其中，最適生長(zhǎng)溫度為25℃，培養(yǎng)7 d菌落直徑為8.5 cm，顯著高于除22℃外的其余處理；其次是22℃，菌落直徑為8.27 cm，與25℃差異不顯著，但顯著高于除19℃外的其余處理；19℃處理的菌落直徑為7.87 cm，顯著高于28℃和31℃。當(dāng)溫度>28℃時(shí)，菌絲生長(zhǎng)明顯受到抑制。

圖5 不同溫度處理菌株 SQ-20-1的菌落直徑Fig.5 Colony diameter of strain SQ-20-1 treated with different temperatures

2.5 不同 pH處理菌株 SQ-20-1的菌落直徑

從圖6看出，菌株SQ-20-1在pH 6～11均能生長(zhǎng)，各處理菌落直徑隨pH增大呈下降趨勢(shì)，即pH 6>pH 7>pH 8>pH 9>pH 10>pH 11，處理間存在差異。其中，適宜生長(zhǎng)的pH為6～7。pH 6時(shí)，菌落生長(zhǎng)速度最快，培養(yǎng)7 d菌落直徑為6.97 cm，顯著高于除pH 8和pH 9外的其余處理；pH 7和pH 8時(shí)，菌落生長(zhǎng)速度其次，菌落直徑分別為6.88 cm和6.57 cm，二者顯著高于pH 9～11；pH 9時(shí)，培養(yǎng)7 d菌落直徑為6.4 cm，與pH 10、pH 11(菌落直徑均為6.22 cm)差異不顯著。當(dāng)pH≥9時(shí)，隨pH的增高，菌落直徑趨于穩(wěn)定。

圖6 不同pH處理菌株 SQ-20-1的菌落直徑Fig.6 Colony diameter of strain SQ-20-1 treated with different pH

3 討論

棕櫚擬盤(pán)多毛孢(P.trachicarpicola)寄主范圍廣泛，可引起多種植物病害，如藍(lán)莓葉斑病[11]、黃精褐斑病[12]、松樹(shù)枝枯病[13]和茶樹(shù)輪斑病[14]。已有文獻(xiàn)報(bào)道P.trachicarpicola的體外生物學(xué)特性，但是，P.trachicarpicola作為引起茶輪斑病的病原菌，其生物學(xué)特性的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。劉思睿等[12]研究發(fā)現(xiàn)，棕櫚擬盤(pán)多毛孢是引起貴州省黃精褐斑病的病原菌，其菌株HGUP17281在PDA培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)速度最好，其生長(zhǎng)最適溫度為28℃，最適pH為5，在以葡萄糖為碳源、酵母浸膏為氮源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速度最快。

4 結(jié)論

研究結(jié)果表明，菌株SQ-20-1在溫度為25℃，pH為6，以乳糖為碳源，L-丙氨酸為氮源的培養(yǎng)基中菌絲生長(zhǎng)最佳。說(shuō)明，從不同植物上分離得到的同一種菌株，其體外生物學(xué)特性也存在明顯差異，此差異與植物寄主、溫度和海拔有關(guān)。該研究從溫度、pH、培養(yǎng)基和碳氮源營(yíng)養(yǎng)元素等方面探討茶輪斑病病原菌P.trachicarpicola的體外生物學(xué)特性，可為今后茶輪斑病防治藥劑的篩選和田間防控措施的制定提供理論基礎(chǔ)。