徐 媛，陳錦玲，陳玉梅，李璐璐，李惠敏，秦新民

(廣西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，廣西 桂林 541004)

0 引言

【研究意義】花生(ArachishypogaeaL.)是我國(guó)重要的油料作物，也是植物油和蛋白質(zhì)的來(lái)源之一。2014年我國(guó)花生種植面積達(dá)460.39萬(wàn)hm2，總產(chǎn)量為1 648.2萬(wàn)t，成為產(chǎn)量最大的油料作物[1]。我國(guó)花生產(chǎn)區(qū)主要分布在干旱、半干旱地區(qū)。干旱是花生生產(chǎn)上影響最大的限制因素，據(jù)統(tǒng)計(jì)，由于干旱引起的花生減產(chǎn)占全國(guó)總產(chǎn)的20%以上[2]。干旱除引起減產(chǎn)外，還使花生品質(zhì)下降、黃曲霉污染及病蟲(chóng)害加重等[3]。因此，開(kāi)展花生響應(yīng)干旱的分子機(jī)制研究，在提高花生抗逆性、增加產(chǎn)量和提高品質(zhì)方面均極為重要?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來(lái)，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)在花生干旱研究中得到廣泛應(yīng)用，為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)花生抗旱分子機(jī)制提供了重要依據(jù)。趙小波等[4]利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)抗旱花生品種J11在干旱脅迫下轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)變化分析，發(fā)現(xiàn)236個(gè)差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子。孫愛(ài)清等[5]利用 Solexa 高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)干旱脅迫下的花生葉片 cDNA文庫(kù)進(jìn)行差異基因表達(dá)譜分析，發(fā)現(xiàn)9個(gè)類(lèi)黃酮代謝相關(guān)基因在干旱脅迫下顯著上調(diào)表達(dá)，推測(cè)類(lèi)黃酮在干旱脅迫下可能發(fā)揮重要作用。萬(wàn)麗云等[6]通過(guò)對(duì)10個(gè)不同的花生材料苗期進(jìn)行干旱-復(fù)水試驗(yàn)，篩選抗感材料進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)抗感材料的差異表達(dá)基因主要富集在氧化磷酸化、光合作用和植物代謝途徑。胡述浩[7]研究發(fā)現(xiàn)花生60條保守miRNA序列，其靶基因?yàn)?92個(gè)，這些靶點(diǎn)包括編碼轉(zhuǎn)錄因子和其他功能蛋白，如NAC轉(zhuǎn)錄因子、乙酰輔酶A羧化酶、色氨酸合成酶α鏈、葉綠體核糖核酸蛋白等，同時(shí)發(fā)現(xiàn)隨著高滲溶液濃度升高，miR2111、miR482的表達(dá)量明顯降低，而分別對(duì)應(yīng)的靶基因表達(dá)量則顯著升高，植株的抗旱能力也隨之增加?！狙芯壳腥朦c(diǎn)】花生在干旱脅迫過(guò)程中，差異基因和miRNA的表達(dá)變化以及差異表達(dá)的miRNA所調(diào)控基因種類(lèi)和功能尚需深入研究。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】近年來(lái)，PEG6000常用于植物模擬干旱研究[8-11]，通過(guò)對(duì)干旱脅迫下花生根系進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和miRNA測(cè)序，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)中基因的表達(dá)水平和miRNA測(cè)序中靶基因的表達(dá)水平進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，旨在挖掘出與抗旱相關(guān)的關(guān)鍵基因和miRNA，為花生的抗旱分子機(jī)理研究與抗旱育種提供分子依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

花生品種為桂花37，廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所選育的珍珠豆型高油酸花生新品種。

1.2 方法

1.2.1 花生種子干旱處理 花生種子經(jīng)75%酒精消毒10 min，在28℃培養(yǎng)箱黑暗條件下蒸餾水浸泡10 h后種在滅過(guò)菌的蛭石中，澆灌蒸餾水，待其發(fā)芽后澆灌霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液；用營(yíng)養(yǎng)液配置15%濃度的PEG6000，待花生長(zhǎng)至3葉一心時(shí)，選擇生長(zhǎng)健壯、長(zhǎng)勢(shì)一致的花生苗小心沖洗根部，將其進(jìn)行15% PEG6000脅迫處理0 d、1 d、2 d和 3 d。收集處理后的花生根系，貯存在-80℃的冰箱，作為轉(zhuǎn)錄組和miRNA測(cè)序的材料。0 d、1 d、2 d、3 d處理后的材料分別以HS15-0、HS15-1、HS15-2和HS15-3命名。

1.2.2 花生總RNA的提取、文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序 樣品總RNA的提取按照trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。通過(guò)Agilent 2100 Bioanalyzer分析儀和紫外分光光度計(jì)對(duì)總RNA的質(zhì)量、濃度和完整性進(jìn)行檢測(cè)。4個(gè)RNA文庫(kù)(HS15-0、HS15-1、HS15-2、HS15-3)構(gòu)建及測(cè)序由華大基因科技有限公司完成。

1.3 數(shù)據(jù)處理和分析

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和miRNA測(cè)序數(shù)據(jù)的處理分別參照文獻(xiàn)[12-13]進(jìn)行。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)使用過(guò)濾軟件SOAPnuke對(duì)BGISEQ-500平臺(tái)測(cè)序獲得的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選,去除包含接頭的reads、未知堿基N含量大于5%的reads,以及去除低質(zhì)量的reads。得到clean reads之后,以花生基因組 (ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/Arachis_duranensis)作為參考基因組，使用HISAT (http://www.ccb.jhu.edu/software/hisat)將 clean reads比對(duì)到參考基因組序列,使用Cufflinks(http://cole-trapnell-lab.github.io/cufflinks)將比對(duì)結(jié)果組裝構(gòu)建轉(zhuǎn)錄本。miRNA測(cè)序?qū)@得的sRNA經(jīng)過(guò)blast或者bowtie比對(duì)到miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)，鑒定得到已知的miRNA。新miRNA采用華大自主開(kāi)發(fā)的Mireap進(jìn)行預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組序列的拼接與組裝

轉(zhuǎn)錄組HS15-0、HS15-1、HS15-2和HS15-3 4個(gè)文庫(kù)分別獲得43 625 768、44 792 456、43 100 476和36 638 768條Clean reads，過(guò)濾后的Reads數(shù)比對(duì)到參考基因組(花生：NCBI_Aradu1.1 ftp://ftp.ncbi.nlm.nih. gov/genomes/ Arachis_duranensis/)，比對(duì)上參考基因組的占比分別是77.19%、74.76%、69.83%和51.78%。同時(shí)，測(cè)序數(shù)據(jù)表明具有蛋白編碼潛力的轉(zhuǎn)錄本有13 387條，其中屬于已知基因的具有編碼潛力的轉(zhuǎn)錄本為11 590條，占86.57%，而屬于新基因的具有編碼潛力的轉(zhuǎn)錄本為1 797條，占13.42%。

2.2 轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)基因

按照FPKM法計(jì)算差異基因的表達(dá)量，當(dāng)倍數(shù)變化>0時(shí)為上調(diào)表達(dá)，反之，則為下調(diào)表達(dá)。同時(shí)以log(FPKM)≥2、FDR≤0.001為條件，篩選顯著差異表達(dá)基因。在HS15-0與HS15-1比較組中，差異基因總數(shù)為14 018個(gè)，其中上調(diào)和下調(diào)差異表達(dá)的基因分別為3 836個(gè)和10 182個(gè)；HS15-1與HS15-2比較組中，差異基因總數(shù)是8 811個(gè)，其中上調(diào)和下調(diào)差異表達(dá)的基因分別有2 068個(gè)和6 743個(gè)；HS15-2與HS15-3比較組中，基因總數(shù)是5 936個(gè)，其中上調(diào)和下調(diào)差異表達(dá)的基因分別為2 264個(gè)和3 672個(gè)。

2.2.1 差異基因的GO功能 將3個(gè)比較組的差異基因進(jìn)行GO功能分類(lèi)，在HS15-0與HS15-1組的差異表達(dá)基因中，共有44個(gè)功能小類(lèi)：其中分子功能有12類(lèi)，共28 479個(gè)差異表達(dá)基因；細(xì)胞組分有14類(lèi)，共20 730個(gè)差異表達(dá)基因；生物過(guò)程有18類(lèi)，共24 065個(gè)差異表達(dá)基因。HS15-1與HS15-2組的差異表達(dá)基因中，共有為44小類(lèi)：11類(lèi)分子功能、14類(lèi)細(xì)胞組分及19類(lèi)生物過(guò)程，差異表達(dá)基因分別為19 032個(gè)、13 898個(gè)和16 107個(gè)。HS15-2與HS15-3組的差異表達(dá)基因中，共有42小類(lèi)：10類(lèi)分子功能、14類(lèi)細(xì)胞組分以及18類(lèi)生物過(guò)程，差異表達(dá)基因分別為12 065個(gè)、8 841個(gè)和10 631個(gè)。

2.2.2 差異基因的GO功能富集 對(duì)各個(gè)比較組中的差異表達(dá)基因富集到的GO Term進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，HS15-0與HS15-1組的差異表達(dá)基因被富集到4 160個(gè)GO Term中，其中生物過(guò)程2 377個(gè)、細(xì)胞組分545個(gè)、分子功能1 238個(gè)；HS15-1與HS15-2組的差異表達(dá)基因被富集到3 867個(gè)GO Term中，其中生物過(guò)程2 210個(gè)、細(xì)胞組分500個(gè)、分子功能1 157個(gè)；HS15-2與HS15-3組中的差異表達(dá)基因被富集到3 398個(gè)GO Term中，其中生物過(guò)程1 946個(gè)、細(xì)胞組分472個(gè)、分子功能980個(gè)。從3個(gè)功能(生物過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能)被富集到的條目數(shù)發(fā)現(xiàn)，3個(gè)比較組中參與生物過(guò)程差異表達(dá)基因的數(shù)目最多，而細(xì)胞組分的差異基因數(shù)目最少。

2.2.3 差異基因的KEGG代謝通路 對(duì)HS15-0與HS15-1、HS15-1與HS15-2、HS15-2與HS15-3 3個(gè)比較組中的差異基因進(jìn)行KEGG Pathway注釋分類(lèi)，共分為6個(gè)分支：細(xì)胞過(guò)程(Cellular Processes)、環(huán)境信息處理(Environmental Information Processing)、人類(lèi)疾病(Human Disease)(僅限動(dòng)物)、遺傳信息處理(Genetic Information Processing)、有機(jī)系統(tǒng)(Organismal Systems)和代謝(Metabolism)。3個(gè)比較組差異基因在代謝分支中的注釋的數(shù)目最多。

根據(jù) KEGG Pathway 注釋分類(lèi)結(jié)果，采用函數(shù)進(jìn)行富集分析得出，3個(gè)比較組中的差異表達(dá)基因共同富集到133個(gè)代謝通路中。在HS15-0與HS15-1比較組中，植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Plant hormone signal transduction)、MAPK信號(hào)通路-植物(MAPK signaling pathway - plant)、核糖體(Ribosome)、植物病原體互作(Plant-pathogen interaction)、碳代謝(Carbon metabolism)通路中差異基因數(shù)目比較多，分別為368個(gè)、357個(gè)、341個(gè)、339個(gè)和319個(gè)。在HS15-1與HS15-2比較組中，核糖體(Ribosome)氨基酸的生物合成(Biosynthesis of amino acids)、碳代謝(Carbon metabolism)植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Plant hormone signal transduction)和RNA轉(zhuǎn)運(yùn)(RNA transport)通路中的差異基因數(shù)目比較多，分別為251個(gè)、241個(gè)、207個(gè)和202個(gè)；在HS15-2與HS15-3比較組中，核糖體(Ribosome)、氨基酸的生物合成(Biosynthesis of amino acids)、碳代謝(Carbon metabolism)、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Plant hormone signal transduction)、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)遺傳信息處理(RNA transport Genetic Information Processing)通路中的差異基因數(shù)目比較多，分別為251個(gè)、241個(gè)、207個(gè)和202個(gè)；核糖體(Ribosome)、氨基酸的生物合成(Biosynthesis of amino acids)、碳代謝(Carbon metabolism)、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)、植物病原菌互作(Plant-pathogen interaction)通路中的基因數(shù)目最多，分別為251個(gè)、172個(gè)、172個(gè)、144個(gè)和143個(gè)。

2.2.4 持續(xù)上調(diào)和下調(diào)表達(dá)基因 在3個(gè)比較組中共篩選出13個(gè)持續(xù)上調(diào)的差異基因，其中7個(gè)為HSP分子伴侶家族基因、2個(gè)RING E3泛素連接酶、1個(gè)為谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、1個(gè)柱頭特異性STIG1樣蛋白1、1個(gè)免疫球蛋白結(jié)合蛋白和1個(gè) DnaJ同源B亞家族成員13。同時(shí)篩選到13個(gè)持續(xù)下調(diào)的差異基因。其表達(dá)量及注釋見(jiàn)表1。

表1 持續(xù)上調(diào)和下調(diào)基因的表達(dá)量及注釋Table 1 Expression and annotation of continuously up- and down-regulated gene

2.3 樣品miRNA的測(cè)序

對(duì)HS15-0、HS15-1、HS15-2 和HS15-3 4個(gè)樣品進(jìn)行的miRNA測(cè)序，分別獲得30 182 740條、29 044 095條、29 702 900條和28 200 685條 Raw reads，去除低質(zhì)量、沒(méi)有3’接頭序列、5’接頭污染、小于18nt和包含poly A的序列，分別獲得28 005 836條、26 862 969條、26 668 939條和25 970 037 條clean reads。將4個(gè)樣本中所有的 clean reads 和已知的miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)(miRBase、Rfam、siRNA、piRNA、snoRNA等)進(jìn)行比對(duì)，能比對(duì)上的 reads 分別有21 804 361條、21 797 056條、21 192 973條和15 074 860條，分別占 clean reads 的 77.86%、81.14%、79.47%和 58.05%。

2.3.1 已知 miRNAs的鑒定 將HS15-0、HS15-1、HS15-2和 HS15-3 4個(gè)樣本文庫(kù)中比對(duì)上基因組的sRNA比對(duì)到miRbase數(shù)據(jù)庫(kù)中，分別鑒定到 28個(gè)、27個(gè)、27個(gè)和 26個(gè)已知miRNA，其中4個(gè)文庫(kù)中共有的已知 miRNA有25個(gè)。

2.3.2 新miRNA的鑒定 在樣本HS15-0、HS15-1、HS15-2和 HS15-3中分別鑒定出116個(gè)、113個(gè)、110個(gè)和106個(gè)新的miRNA，其中有105個(gè)新 miRNAs在4個(gè)樣本中為共表達(dá)。

2.4 差異表達(dá)miRNA

2.4.1 差異表達(dá)miRNA的篩選 在HS15-0與HS15-1比較組中，差異表達(dá)的miRNA有23個(gè)，其中有7個(gè)為上調(diào)差異miRNA，16個(gè)為下調(diào)差異miRNA；在HS15-1與HS15-2比較組中，差異表達(dá)的miRNA有36個(gè)，其中11個(gè)為上調(diào)差異miRNA，25個(gè)為下調(diào)差異miRNA；在HS15-2與HS15-3比較組中，差異表達(dá)的miRNA有57個(gè)，其中7個(gè)為上調(diào)差異miRNA，50個(gè)為下調(diào)差異miRNA。在3個(gè)比較組中，下調(diào)差異表達(dá)的miRNA數(shù)目多于上調(diào)差異表達(dá)的miRNA。

2.4.2 差異表達(dá)miRNA的靶基因 利用Target Finder等軟件對(duì)差異表達(dá)miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)。HS15-0與HS15-1比較組中15個(gè)miRNAs為差異表達(dá)，共預(yù)測(cè)到 392個(gè)靶基因，其中5個(gè)已知 miRNA調(diào)控 330個(gè)靶基因，10個(gè)新 miRNA調(diào)控62個(gè)靶基因；HS15-1與HS15-2比較組中有25個(gè)差異表達(dá) miRNAs，預(yù)測(cè)到的靶基因數(shù)為913個(gè)，其中6個(gè)已知miRNA調(diào)控440個(gè)靶基因，19個(gè)新miRNA調(diào)控473個(gè)靶基因；HS15-2與HS15-3比較組中的 44個(gè)miRNAs呈現(xiàn)出差異表達(dá)，預(yù)測(cè)的靶基因?yàn)? 718個(gè)，其中8個(gè)已知miRNA調(diào)控的的靶基因數(shù)為1 007個(gè)，而36個(gè)新 miRNA僅調(diào)控 711個(gè)靶基因。

2.4.3 差異表達(dá)miRNA靶基因的GO和KEGG富集 將3個(gè)比較組的差異表達(dá) miRNA的靶基因進(jìn)行GO功能分類(lèi)。在HS15-0與HS15-1比較組差異表達(dá)miRNA靶基因中，生物過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能三大類(lèi)所占的靶基因數(shù)目分別為495個(gè)、429個(gè)和246個(gè)；HS15-1與HS15-2比較組的靶基因數(shù)目分別是1 089個(gè)、860個(gè)和504個(gè)；HS15-2與HS15-3比較組的靶基因數(shù)目分別是1 479個(gè)、1 324個(gè)和766個(gè)。數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，HS15-2與HS15-3比較組中差異表達(dá)miRNA的靶基因數(shù)最多，HS15-0與HS15-1比較組最少。在GO分類(lèi)中，3個(gè)比較組的功能分類(lèi)模式相似。在生物過(guò)程分類(lèi)中，3個(gè)比較組注釋到差異表達(dá)miRNA的靶基因數(shù)主要分布在細(xì)胞過(guò)程(cellular process)和代謝過(guò)程(metabolic process)類(lèi)別中；在細(xì)胞組分分類(lèi)中，3個(gè)比較組中的靶基因主要集中在細(xì)胞(cell)、膜(membrane)、膜部分(membrane part)和細(xì)胞器(organelle)4個(gè)小類(lèi)別中；在分子功能類(lèi)別中，3個(gè)比較組中的差異表達(dá)miRNA靶基因主要分布在結(jié)合(binding)和催化活性(catalytic activity)類(lèi)型中。該分類(lèi)結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到的差異基因注釋分類(lèi)結(jié)果一致。在HS15-0與HS15-1比較組中，共富集到76條代謝通路，其中代謝途徑(Metabolic pathways)、次生代謝產(chǎn)物的生物合成(Biosynthesis of secondary metabolites)、晝夜節(jié)律-植物(Circadian rhythm - plant)和類(lèi)黃酮生物合成(Flavonoid biosynthesis)通路中差異miRNA靶基因的數(shù)目比較多，分別為98個(gè)、80個(gè)、27個(gè)和21個(gè)。在HS15-1與HS15-2比較組中，共富集到91條代謝通路，其中代謝途徑(Metabolic pathways)、次生代謝產(chǎn)物的生物合成(Biosynthesis of secondary metabolites)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工(Protein processing in endoplasmic reticulum)和剪接體(Spliceosome)通路中差異miRNA靶基因數(shù)目比較多，分別為123個(gè)、53個(gè)、45個(gè)和44個(gè)；在HS15-2與HS15-3比較組中，共富集到105條代謝通路，其中代謝途徑(Metabolic pathways)、次生代謝產(chǎn)物的生物合成(Biosynthesis of secondary metabolites)、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Plant hormone signal transduction)和胞吞作用(Endocytosis)通路中差異miRNA靶基因數(shù)目比較多，分別為205個(gè)、104個(gè)、69個(gè)和65個(gè)。數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，在花生干旱脅迫下，有較多的靶基因參與調(diào)控代謝和次生代謝產(chǎn)物的生物合成途徑。

2.5 與花生干旱相關(guān)的miRNA及靶基因預(yù)測(cè)

通過(guò)miRNA的靶基因功能注釋分析發(fā)現(xiàn)，有13條miRNA的靶基因注釋為與干旱相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子或基因，其中9條為持續(xù)下調(diào)miRNA，涉及35個(gè)基因，源異型域-亮氨酸拉鏈蛋白(homeobox-leucine zipper protein, HD-Zip)編碼基因1個(gè)、MYB類(lèi)LHY基因2個(gè)，WRKY轉(zhuǎn)錄因子編碼基因3個(gè)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase，GST)基因2個(gè)、 SPL轉(zhuǎn)錄因子(Squamosa promoter binding protein-like)基因20個(gè)、 CCCH型鋅指蛋白(zinc finger CCCH domain protein)基因7個(gè)(表2)。ahy-miR156a分別參與WRKY轉(zhuǎn)錄因子、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶和SPL轉(zhuǎn)錄因子基因的調(diào)控。

表2 花生干旱相關(guān)的靶基因功能注釋及miRNATable 2 Functional annotation and miRNA of target gene related to peanut under drought stress

續(xù)表2

3 討論

3.1 抗旱功能相關(guān)基因

植物熱激蛋白(HSPs)在植物減輕逆境脅迫引起的傷害方面發(fā)揮作用[14]。王利彬等[15]發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)HSP70煙草的耐旱性和耐熱性得到顯著提高。WANG等[16]在研究大麥干旱脅迫差異基因時(shí)發(fā)現(xiàn)HSP90蛋白在不同處理上出現(xiàn)差異表達(dá)。西瓜在水分脅迫時(shí)熱激蛋白也出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)[17]。此外，在小麥研究中也發(fā)現(xiàn)干旱脅迫會(huì)誘導(dǎo)抗旱小麥材料中HSP60和HSP90表達(dá)上調(diào)[18]。最近有研究表明，泛素連接酶E3在植物的抗旱功能中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[19-20]，持續(xù)上調(diào)的RING finger E3泛素連接酶可通過(guò)調(diào)控脫落酸(ABA)信號(hào)通路參與干旱脅迫響應(yīng)[21]。XERICO是一種RING-H2E3泛素連接酶，ZENG等[22]發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)XERICO能增強(qiáng)ABA的生物合成，從而提高擬南芥的抗旱性。谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)是一類(lèi)重要的多功能超家族酶，GSTs可通過(guò)親電取代反應(yīng)、降低毒害作用和過(guò)氧化酶清除功能，增加植物適應(yīng)各種逆境脅迫的能力[23-24]。如過(guò)表達(dá)PjGSTU1基因可提高煙草的抗旱能力[25]。近年來(lái)，DnaJ蛋白在植物干旱脅迫的研究方面取得了較大進(jìn)展[26]。SCHAFLITNER等[27]鑒定出6 個(gè)受干旱脅迫誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)的DnaJ蛋白基因。RODRIGUES等[28]從甘蔗中鑒定出 3個(gè)DnaJ蛋白基因，并發(fā)現(xiàn)其中有 1個(gè)在耐旱品種中下調(diào)表達(dá)，而在不耐旱品種中則上調(diào)表達(dá)。THUMMA等[29]鑒定出1個(gè)桉樹(shù)DnaJ蛋白，發(fā)現(xiàn)在干旱脅迫條件下，其3個(gè)等位基因的表達(dá)差異極其顯著。研究結(jié)果表明，在HS15-0與HS15-1、HS15-1與HS15-2和HS15-2與HS15-3 3個(gè)比較組中共篩選出13個(gè)持續(xù)上調(diào)表達(dá)基因，分別為7個(gè)HSP分子伴侶家族基因、2個(gè)RING E3泛素連接酶、1個(gè)GSTs，1個(gè)柱頭特異性STIG1樣蛋白1、1個(gè)免疫球結(jié)合蛋白和1個(gè) DnaJ同源B亞家族成員13。其中HSPs分子伴侶家族基因、 RING E3泛素連接酶、 GSTs和DnaJ基因很可能與花生應(yīng)激干旱脅迫相關(guān)。而柱頭特異性STIG1樣蛋白1和免疫球結(jié)合蛋白基因也為持續(xù)上調(diào)表達(dá)，但目前尚未見(jiàn)這2個(gè)基因與植物干旱脅迫相關(guān)的研究報(bào)道。此外，13個(gè)持續(xù)下調(diào)表達(dá)的基因其功能注釋與花生干旱脅迫的關(guān)系也不明確，有待深入研究。

3.2 花生根系抗旱功能相關(guān)miRNA

HD-Zip是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，其可通過(guò)與相關(guān)激素基因及其下游基因互作增強(qiáng)植物耐逆性[30]。研究中miRNA中novel_mir70的靶基因?yàn)橥串愋陀?亮氨酸拉鏈蛋白基因。隨著脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，novel_mir70表達(dá)持續(xù)減少，通過(guò)負(fù)調(diào)控機(jī)制使得靶基因表達(dá)增強(qiáng)，有利于植物抗旱能力的提高。MYB-related transcription factor LHY屬于生物鐘節(jié)律基因，其主要功能不僅調(diào)控生物晝夜節(jié)律，還可以通過(guò)識(shí)別脅迫信號(hào)通路基因上游的調(diào)控元件，調(diào)控植物對(duì)非生物脅迫作出反應(yīng)[31]。PATADE等[32]在甘蔗的PEG脅迫中發(fā)現(xiàn)MYB和ahy-miR159的表達(dá)水平彼此相反。

ahy-miRNA159可以通過(guò)控制ABI3的表達(dá)來(lái)調(diào)控 MYB33轉(zhuǎn)錄因子的含量，從而參與ABA信號(hào)通路響應(yīng)干旱[33]。研究中靶向MYB-related transcription factor LHY的2條miRNA ahy-miR156b-3p和ahy-miR159均呈持續(xù)下降的表達(dá)模式，可能通過(guò)負(fù)調(diào)控來(lái)增強(qiáng)花生的抗旱性。WKRY基因家族是高等植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，其蛋白結(jié)構(gòu)基本含有 1～2個(gè) WRKY結(jié)構(gòu)域，參與非生物逆境應(yīng)答如干旱、澇漬、高鹽、高溫、低溫、損傷等，如BhWRKY1 與BhGolS1(半乳糖醇合成酶)啟動(dòng)子的 W-box 結(jié)合，轉(zhuǎn)錄激活BhGolS1的表達(dá)，可以提高擬南芥的耐旱性[34]。研究發(fā)現(xiàn)ahy-miR156a、novel_mir103和 novel_mir115靶向4個(gè)WKRY轉(zhuǎn)錄因子基因，其中ahy-miR156a和novel_mir103在脅迫的1～3 d過(guò)程中表達(dá)量也表現(xiàn)為逐步下降模式，使得靶基因WKRY轉(zhuǎn)錄因子基因高表達(dá)，從而提高花生的抗旱能力。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)為細(xì)胞內(nèi)多功能蛋白，在植物體內(nèi)參與初生代謝、次生代謝、解毒以及非生物脅迫過(guò)程[35-36]。研究發(fā)現(xiàn)2個(gè)miRNA(novel_mir83和ahy-miR156a)的靶基因?yàn)楣入赘孰腟-轉(zhuǎn)移酶基因，其表達(dá)量在脅迫過(guò)程中呈持續(xù)下降趨勢(shì)。 該結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組中GSTs基因表達(dá)持續(xù)上調(diào)一致，推測(cè)novel_mir83和ahy-miR156a通過(guò)負(fù)調(diào)控作用，增加GSTs基因的表達(dá)，增強(qiáng)花生的抗旱能力。

鱗狀啟動(dòng)子結(jié)合蛋白樣(Squamosa promoter binding protein-like，SPL)是植物中特有的轉(zhuǎn)錄因子。已有研究證明SPL可以增強(qiáng)植物在干旱脅迫下的耐受性[37]。在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中miR156與SPL的表達(dá)水平通常呈負(fù)相關(guān)，miR156可以通過(guò)mRNA剪切或翻譯抑制來(lái)調(diào)控SPL的表達(dá)[38]。研究共篩選到2個(gè)下調(diào)表達(dá)的miR156家族蛋白(ahy-miR156a和ahy-miR156b-5p)，所靶向的20個(gè)靶基因功能均注釋為SPL轉(zhuǎn)錄因子。由此推斷，干旱脅迫下ahy-miR156a、ahy-miR156b-5p通過(guò)下調(diào)，使其靶基因表達(dá)水平增強(qiáng)來(lái)提高自身的抗逆作用。CCCH型鋅指蛋白(zinc finger CCCH domain protein)是一類(lèi)重要的調(diào)控因子，在動(dòng)植物生長(zhǎng)發(fā)育以及對(duì)外界逆境的反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。徐倩倩[39]研究發(fā)現(xiàn)，PEG可以誘導(dǎo)玉米中的ZmC3H54的表達(dá)，干旱處理下過(guò)表達(dá)的 Zm C3H54 轉(zhuǎn)基因水稻植株抗旱性增強(qiáng)。本研究中發(fā)現(xiàn)1個(gè)下調(diào)的ahy-miR167-5p，其7個(gè)靶基因功能注釋為CCCH型鋅指蛋白，由此推測(cè)干旱脅迫下ahy-miR167-5p可能負(fù)調(diào)控CCCH型鋅指蛋白，從而減少逆境對(duì)植物的傷害。

以上幾個(gè)家族的miRNA可能通過(guò)作用于各自的靶基因參與到花生的干旱脅迫中，但這些miRNAs參與花生干旱脅迫應(yīng)答機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

研究采用15% PEG6000對(duì)花生幼苗進(jìn)行了干旱脅迫處理，通過(guò)對(duì)材料的轉(zhuǎn)錄組和miNRA測(cè)序，在轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)了13個(gè)顯著持續(xù)上調(diào)的差異基因和13個(gè)顯著下調(diào)的差異基因；在miRNA測(cè)序數(shù)據(jù)中篩選到8個(gè)持續(xù)下調(diào)表達(dá)的miRNA，分別為ahy-mir156-3p、 ahy-miR159、ahy-miR167-5p、ahy-miR156a、ahy-miR156b-5p、novel_mir103、novel_mir83和novel_mir70。這些差異表達(dá)基因和miRNA參與了花生的干旱脅迫過(guò)程。