米曉云，吳建勇，馬文戈，日孜瓦古·努爾東，王琦，盛肖剛，黃炯，魏玉榮*

（1新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所，新疆 烏魯木齊，830013）

（2巴音郭楞職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆 庫爾勒，841000）

（3新疆維吾爾自治區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所，新疆 烏魯木齊，830013）

鴿圓環(huán)病毒（Pigeon circovirus，PiCV，又稱Colum?bid circovirus，CoCV）是已知最小的致病性病毒，呈二十面體對稱球形，無囊膜，直徑為17～22 nm，基因組由大約1.7～2.3 kb的單鏈環(huán)狀DNA組成［1?2］。PiCV于1993年在美國被首次報道，此后許多國家和地區(qū)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)該?。??4］。余旭平等［5］于2009年在浙江地區(qū)鴿群中檢測并報道了國內(nèi)首例PiCV。隨后，福建、江蘇、上海、山東、河北、安徽、廣東等地均有PiCV病例報道［6］。PiCV的全基因組于2000年首次被克?。?］。國內(nèi)全基因組克隆并序列分析的毒株有ZJ1株、ZJ2株、FJ1株及JS15?1株［5,8?9］。雖然不同毒株之間有著微小的長度變化，但是基因組均含5個開放閱讀框（ORF），分別是V1、C1、C2、以及3'基因間區(qū)和5'基因間區(qū)［10?11］。ORF V1 以 ATG 為起始密碼子編碼含315～318個氨基酸的復(fù)制相關(guān)蛋白（Rep）。ORF C1以ATG/ATA為起始密碼子編碼含270～274個氨基酸的病毒外殼蛋白（Cap）［11］。其他ORF的功能目前未知。

本文根據(jù)已發(fā)表的PiCV全基因組序列設(shè)計引物，對采集于和田地區(qū)墨玉縣種鴿場已檢測呈PiCV陽性的病料進行全基因組序列克隆和測序，并進行序列分析，為疫苗候選開發(fā)提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

新疆和田地區(qū)墨玉縣規(guī)模化種鴿場3—4月齡病鴿樣本（心、肝、肺、大腸及喉管），采集后?20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑

TIANamp Virus DNA/RNA Kit、2xPCR MasterMix購自天根生化科技（北京）有限公司；5 000 bp DNA Marker購自寶生物工程（大連）有限公司；Wizard?SV Gel and PCR Clean?Up System、Wizard? Plus SV Minipreps DNA Purification System購自普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司；pEASY?T1載體、Trans1?T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank中已發(fā)表的PiCV基因組序列（GenBank登錄號：KX108805），設(shè)計引物，見表1，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，用于PiCV完整基因序列擴增。

表1 引物序列

1.4 病毒DNA提取

前期檢測并測序鑒定其攜帶PiCV的病鴿肝臟組織取10 g于研缽中剪碎備用［12］。將剪碎的病料組織置于無菌研缽中，按1:5比例加入無菌PBS（pH 7.4），并加入少許石英砂研磨勻漿，勻漿混合液收集于50 mL離心管中，反復(fù)凍融3次，取上清液，12 000 rpm離心5 min，再次取上清液，按TIANamp Virus DNA/RNA Kit試劑盒說明書提取病毒DNA。

1.5 基因組克隆與測序

將提取的DNA樣品作為模板擴增PiCV的全基因，PCR擴增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR擴增體系（總體積為25μL）：模板2μL，2×PCR MasterMix 12.5μL，PiCV?1?U/D上下引物各0.5μL，RNase Freed ddH2O 9.5μL。PCR擴增程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，59℃退火40 s，72℃延伸100 s，共30個循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。將特異性PCR產(chǎn)物膠回收純化后與pEASY?T1載體連接，轉(zhuǎn)化至Trans1?T1感受態(tài)細(xì)胞，篩選、初步鑒定陽性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.6 基因組結(jié)構(gòu)分析

測序結(jié)果經(jīng)BLASTn比對分析確認(rèn)。測序序列用DNAStar軟件進行整理、校對并拼接及核苷酸同源性比較。對獲得的序列用Vector NTI進行ORF查找及相關(guān)特征性序列分析。用MEGA5.0軟件采用Neighbor?Joining法，p?distance模式，以鵝圓環(huán)病毒株（GenBank登錄號：GU320569）GoCV作為外支，用步展值（Bootstrap）重復(fù)1 000次對進化樹的可靠性進行評估。

2 結(jié)果與分析

2.1 全基因組擴增結(jié)果

將前期鑒定攜帶PiCV的鴿肝樣本DNA作為模板，進行PiCV的全基因組PCR擴增，電泳結(jié)果顯示擴增樣品約2 031 bp的特異性片段，與預(yù)期大小相符（見圖1）。目的條帶切膠回收，連接pEASY?T1載體用于基因測序。

圖1 XJ1株基因組擴增結(jié)果

2.2 新疆株P(guān)iCV基因組結(jié)構(gòu)分析

測序序列拼接得到完整的PiCV基因序列（Gen?Bank登錄號：MT614188）。完整序列比對分析表明，XJ1株基因組全長為2 031 bp，編碼5個ORF，分別為ORF V1（41～994 nt）、ORF C1（1 166～1 981 nt）、ORF C2（410～790 nt）、ORF C3（2～292 nt）和 ORF C4（739～984 nt）（圖2）。其中ORF V1編碼含317個氨基酸的復(fù)制相關(guān)蛋白Rep，ORF C1編碼含271個氨基酸的衣殼蛋白Cap，其余3個ORF編碼功能未知。與文獻(xiàn)報道一致，XJ1具有PiCV的共有特征：ORF V1和ORF C1起始之間有一莖環(huán)結(jié)構(gòu)，莖環(huán)上有9堿基保守序列TAGTATTAC；莖環(huán)附近有反向重復(fù)序列CACG?GAGCCAYATCGC，此序列可能是PiCV復(fù)制酶的結(jié)合位點［7］。莖環(huán)附近還有4個正向重復(fù)序列GGAGCC；Rep蛋白中包括3個與滾環(huán)復(fù)制相關(guān)的保守基序（FTLNNP、TPHLQG、YCSK）及其他保守基序（WWDGY、DDFYGWLP、DRYP）［13］。

圖2 XJ1株環(huán)形基因組的線性圖譜

2.3 全基因組的同源性分析

用DNAStar軟件中的MegAlign對自測的XJ1株與GenBank中，國內(nèi)外其他24株P(guān)iCV毒株的全基因序列進行比對（參考毒株見表2）。結(jié)果顯示XJ1株與其他24株全基因組核苷酸同源性在87.3%～94.9%之間，與GF17（KX108806）的同源性最高達(dá)94.9%；而其他毒株之間核苷酸同源性在85.2%～97.8%之間（表3）。

表2 PiCV毒株概況

表3 PiCV XJ1株與其他毒株基因組核苷酸同源性比較

2.4 全基因組進化樹分析

以GoCV作為外支，用MEGA5.0軟件Neighbor?Joining法，p?distance模式，Bootstrap檢驗1 000次重復(fù)，對25株P(guān)iCV全基因組構(gòu)建遺傳進化樹，分析不同來源鴿圓環(huán)病毒的親緣關(guān)系（見圖3）。結(jié)果可見，25株P(guān)iCV在遺傳進化上依據(jù)核衣殼蛋白Cap的起始密碼子不同（見表2）而分為明顯的2個分支，即分為ATA分支和ATG分支?；贑ap蛋白的遺傳進化樹顯示XJ1與ATG分支中GF82（GF82/Guangdong/2014）、GF17（GF17/Guangdong/2014）及 GH1834（GH1834/GuangDong/2014）親緣關(guān)系最近。

圖3 基于Cap蛋白的鴿圓環(huán)病毒基因遺傳進化分析

3 討論

PiCV是一種免疫抑制病原，主要感染青年賽鴿及肉鴿，以4月齡以下的鴿子最為易感染，因此又稱為“青年鴿病綜合征”（young pigeon disease syndrome，YPDS）。PiCV既可通過污染的糞便、飼料及飲水等方式水平傳播，又可經(jīng)鴿胚胎垂直傳播［14,15］。2014年，ZHANG Z等［16］對華東地區(qū)六個鴿場進行流行病學(xué)調(diào)查，結(jié)果顯示PiCV在病鴿群和外觀健康鴿群陽性率分別是80.7%（88/109）和63.3%（31/49）。2017年，HUANG Y等［17］對淘汰賽鴿中164羽死亡鴿子進行PiCV檢測，結(jié)果陽性率為96.95%（159/164）。本實驗室調(diào)查發(fā)現(xiàn)新疆和田地區(qū)墨玉縣種鴿場鴿群存在一定比例PiCV感染，陽性率為47.29%（96/203）［12］。

PiCV感染會造成鴿免疫系統(tǒng)損傷，繼而增加感染其他病原體的潛在風(fēng)險。MANKERTZ A等［7］根據(jù)PiCV基因組序列特征，首次將PiCV歸入圓環(huán)病毒科的圓環(huán)病毒屬。鴿圓環(huán)病毒基因序列特性的深入研究，有助于病毒致病機理探索、診斷方法建立及防控產(chǎn)品的開發(fā)［18,19］。

本研究測序株XJ1基因組全長為2 031 bp，全基因組序列核苷酸相似性比較結(jié)果顯示XJ1與GF17（GF17/Guangdong/2014）和 GH1834（GH1834/Guang?dong/2014）的同源性最高（均為94.9%），與Ita 4B株同源性最低，僅為87.3%。XJ1全基因組編碼ORF V1、ORF C1、ORF C2、ORF C3和ORF C4等5個編碼框，在編碼框外還存在與其復(fù)制、增殖相關(guān)的5'端基因間隔區(qū)和3'端基因間隔區(qū)。5'端基因間隔區(qū)位于ORF C1和ORF V1之間，有一莖環(huán)結(jié)構(gòu)，莖環(huán)上有9堿基保守序列TAGTATTAC；莖環(huán)附近有反向重復(fù)序列（CACGGAGCCATATCGC和GCGATATGGCTCC?GTG及2個GGAGCC和GGCTCC）；XJ1株5'端基因間隔區(qū)長度為90 nt，與其他參考毒株略有差異。3'端基因間隔區(qū)位于ORF C1和ORF V1之間（995～1 165 nt），長度為 171 nt。與文獻(xiàn)報道一致，XJ1 株Rep蛋白中也包括3個與滾環(huán)復(fù)制相關(guān)的保守基序（FTLNNP、TPHLQG、YCSK）及其他保守基序（WWDGY、DDFYGWLP、DRYP）［13］。

ORF C1編碼的Cap蛋白有ATG和ATA兩類起始密碼子（表2）。萬春和等［8］認(rèn)為起始密碼子的不同與3'端基因隔區(qū)長度相關(guān)，當(dāng)3'端基因間隔區(qū)長度為171 nt時，Cap蛋白的起始密碼子為“ATG”，而長度是170 nt時，Cap蛋白的起始密碼子為“ATA”。然而，TODD D等［11］在鴿圓環(huán)病毒序列組成研究中列表比較分析了12個序列的Cap蛋白起始密碼子，研究結(jié)果正好與萬春和等人相反，即當(dāng)3'端基因間隔區(qū)長度為171 nt時，起始密碼子為“ATA”，而長度是170 nt時，起始密碼子為“ATG”。但是，仔細(xì)對比萬春和及TODD等學(xué)者文章中列舉的毒株序列位點，結(jié)合本研究中下載自GenBank中序列及XJ1基因序列分析，結(jié)果顯示這兩種起始密碼子在Cap蛋白中呈隨機分布，與3'端基因隔區(qū)長度相關(guān)性不大。XJ1株與國內(nèi)外發(fā)表的24株鴿圓環(huán)病毒序列全基因作基于Cap蛋白的遺傳進化分析，PiCV在遺傳進化中具有明顯的ATA分支和ATG分支，與Cap蛋白起始密碼子相一致（表2）。國內(nèi)毒株雖處于不同亞群但均處于ATG分支，且大部分毒株（14/17）3'端基因間隔區(qū)長度為171 nt，僅浙江株（ZJ1和ZJ2）及JS15?1株（3/17）的3'端基因間隔區(qū)長度為170 nt。XJ1株與ATG分支中的廣東毒株 GF82（GF82/Guangdong/2014）、GF17（GF17/Guangdong/2014）及 GH1834（GH1834/Guang?dong/2014）可能來源相同。

基于流行病學(xué)結(jié)果，PiCV感染及繼發(fā)感染已經(jīng)給國內(nèi)養(yǎng)鴿業(yè)造成嚴(yán)重?fù)p失。但迄今為止，PiCV還無法體外細(xì)胞培養(yǎng)，極大限制了PiCV各方面的深入研究。本研究對新疆PiCV基因序列特性的深入研究，有助于通過基因工程手段開發(fā)疫苗產(chǎn)品用于該病的防控。

4 結(jié)論

XJ1株基因組全長為2 031 bp，有5個閱讀框；基因間隔區(qū)長度分別為90 nt和171 nt。XJ1全基因組序列與國內(nèi)GF17和GH1834的同源性最高（均為94.9%）?；贑ap基因遺傳進化樹顯示，XJ1株與Cap蛋白起始密碼子“ATG”分支中GF82、GF17及GH1834親緣關(guān)系最近。這是新疆首次測定PiCV全基因組序列，有助于PiCV疫苗開發(fā)。