張曉 秦偉偉 李秋杰 孫立新 馬福國 韓偉

1青島市市立醫(yī)院麻醉科266071;2青島市市立醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科266071

急性肺損傷 (acute lung injury,ALI)患者通常需要機械通氣以維持氧合,然而機械通氣使用不當可能加重先前存在的肺損傷,稱為機械通氣肺損傷 (ventilator-induced lung injury,VILI)[1]。近幾年的研究多集中于由炎癥介質、細胞因子和炎性細胞參與的生物傷,而瘦素是脂肪細胞分泌的一種脂肪因子,與IL-6 和IL-12 有相似的結構,被認為是一種炎癥因子,參與Ⅰ型免疫反應[2],外源瘦素可能在膿毒癥導致的ALI中起肺保護作用[3],而瘦素改善ALI的機制尚不清楚。核苷酸結合寡聚化結構域樣受體是固有免疫系統重要組成部分,能夠在機械刺激的作用下形成炎癥小體。NLRC4是核苷酸結合寡聚化結構域樣受體家族成員之一,能夠感知損傷相關分子模式,導致炎癥介質IL-1β和IL-18 的分泌[4]。但瘦素是否能夠通過影響NLRC4炎癥小體的表達減輕VILI的發(fā)生,未見相關研究。本研究通過使用瘦素干預VILI模型大鼠,試圖闡明瘦素對VILI大鼠NLRC4炎癥小體表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級雄性SD 大鼠36只,體質量200～250 g (購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司),實驗動物合格證號:SCXK (魯)2014-0007。恒溫環(huán)境中飼養(yǎng),自由飲水和進食,所有動物按照實驗動物管理和使用指南進行飼養(yǎng)。實驗經青島市實驗動物倫理委員會核實批準。

1.2 主要材料和試劑 外源性瘦素 (美國Santa Cruz公司),酶聯免疫試劑盒 (上海碧云天生物技術研究所),小動物呼吸機 (深圳沃瑞德生命科技有限公司),血氣分析儀(美國雅培公司),Imager圖像分析儀 (美國Bio-Rad公司),離心機 (上海安亭科學儀器廠),移液槍 (法國Eppendorf公司),NLRC4抗體(美國Abcam 公司),caspase-1抗體(美國Abcam 公司),內參照β-actin (北京Bioeasy公司)等。

1.3 方法

1.3.1 動物分組與造模 采用隨機數字表法將大鼠分為3組:對照組、VILI模型組和瘦素組,每組12只。實驗前禁食12 h,自由飲水,腹腔注射3%戊巴比妥鈉40 mg/kg,麻醉后行氣管切開,插入氣管導管并固定。對照組不行機械通氣,自主呼吸空氣4 h；VILI模型組和瘦素組連接小動物呼吸機行機械通氣4 h；機械通氣前瘦素組腹腔注射瘦素50μg/kg,對照組和VILI模型組腹腔內分別注射等量生理鹽水。3組均股動脈插管監(jiān)測動脈壓和采血,股靜脈插管建立液體通道,維持室溫26～28℃,麻醉維持采用靜脈輸注戊巴比妥鈉2 mg·kg-1·h-1。呼吸機參數設置:潮氣量為40 ml/kg,呼吸頻率為60 次/min,吸呼比為1∶1,呼氣末正壓為0 mm Hg (1 mm Hg=0.133 k Pa),吸入氧濃度為21%。

1.3.2 標本采集 機械通氣4 h后采集股動脈血樣,進行動脈血氣分析,記錄PaO2,剩余血樣以1 500 r/min 的轉速離心10 min (離心半徑15 cm)。收集血清,凍存于-80 ℃冰箱,用于血清中炎性因子IL-1β、IL-18含量測定。采集血液標本后麻醉處死大鼠,于4℃下分離兩側肺組織,結扎右主支氣管,左支氣管穿刺插管后用4 ℃PBS行左側肺灌洗,每次2 ml(回收率＞80%),反復3 次, 收 集 約 4 ml 支 氣 管 肺 泡 灌 洗 液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF),4 ℃下3 000 r/min離心10 min (離心半徑15 cm)后取上清液。ELISA 法檢測血清及BALF 中IL-1β、IL-18的濃度。取右肺上葉甲醛固定,右肺中葉計算濕/干重比值,右肺下葉組織投入液氮快速冷凍后-80 ℃貯存。

1.3.3 組織病理檢測 取右肺上葉組織,經10%中性甲醛固定、石蠟包埋、切片、HE 染色,光鏡下觀察肺組織病理學結果,并行病理損傷評分。觀察肺間質、肺泡、中性粒細胞和肺泡內充血4項指標并進行評分,無改變或非常輕微改變?yōu)?分；輕度、中度、重度、極重度改變依次為1、2、3、4分,4項累計總分即為肺損傷評分。

1.3.4 肺濕/干重比值測定 取右肺中葉稱取濕重,置于70 ℃干燥箱中烘干至恒重,稱取干重,計算比值。

1.3.5 蛋白質印跡法檢測肺組織中caspase-1、NLRC4蛋白表達水平 于冰盒上迅速取出肺組織研磨后加入蛋白裂解液,低溫高速離心,取上清后采用BCA 法進行蛋白定量。根據蛋白定量結果,加入相應體積的總蛋白上樣,SDS-PAGE 電泳。將凝膠上分離到的蛋白條帶通過轉移電泳方式轉印至固相支持物上,然后分別用非標記一抗及辣根過氧化物酶標記的二抗對其進行孵育、檢測。分離后的蛋白轉至硝酸纖維素濾膜后加入一抗兔多克隆抗體NLRC4 抗體 (稀釋度1∶1 000,美國Abcam公司)、caspase-1 抗體 (稀釋度1∶1 000,美國Abcam 公司),內參照β-actin (稀釋度1∶5 000,北京Bioeasy公司),4℃過夜,TBST洗膜5 min×3次,加入羊抗兔二抗 (1∶5 000,深圳Bioeasy公司),孵育30 min后,用TBST 洗膜5 min×3次。化學凝膠成像系統曝光成像后用Image J軟件分析灰度值,以目的蛋白與內參照β-actin的灰度值比值代表目的蛋白表達量。

1.4 統計學分析 采用SPSS 19.0軟件進行分析。正態(tài)分布的計量資料以±s表示,組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肺組織病理學結果 通氣4 h后,對照組肺組織結構正常,無明顯炎性細胞浸潤,無紅細胞或蛋白滲出；VILI模型組機械通氣后肺組織明顯充血、水腫,大量炎性細胞浸潤；瘦素組充血、水腫程度減輕。見圖1。

2.2 肺損傷評分、肺濕/干重比值和PaO2變化 3 組之間比較,肺損傷評分、肺濕/干重比值、PaO2差異均有統計學意義 (F值分別為30.77、31.68、71.80,P值均＜0.01)。VILI模型組、瘦素組肺損傷評分、肺濕/干重比值明顯高于對照組,PaO2顯著低于對照組 (P值均＜0.01)。瘦素組肺損傷評分、肺濕/干重比值低于VILI模型組,PaO2高于VILI模型組(P值均＜0.05)。見表1。

表1 各組大鼠肺損傷評分、肺濕/干重比值和PaO2 的比較 (±s)

表1 各組大鼠肺損傷評分、肺濕/干重比值和PaO2 的比較 (±s)

注:VILI為機械通氣肺損傷；與對照組比較,a P ＜0.01；與VILI模型組比較,b P ＜0.05；1 mm Hg=0.133 kPa

組別 鼠數 肺損傷評分(分)肺濕/干重比值PaO2(mm Hg)對照組 12 3.2±1.8 2.9±1.1 84±6 VILI模型組 12 11.1±2.3a 8.8±2.2a 54±7a瘦素組 12 8.3±3.2ab 6.5±2.0ab 62±6ab F 值 30.77 31.68 71.80 P 值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.3 血清和BALF 中IL-18、IL-1β濃度 3組之間比較,血清中IL-18和IL-1β、BALF中IL-18和IL-1β差異均有統計學意義 (F值分別為63.40、87.37、98.10、381.20,P值均＜0.01)。VILI模型組、瘦素組血清中IL-18 和IL-1β、BALF 中IL-18和IL-1β 濃度顯著高于對照組 (P值均＜0.01)；瘦素組血清中IL-18 和IL-1β、BALF 中IL-18和IL-1β濃度低于VILI模型組 (P值均＜0.05)。見表2。

圖1 各組大鼠肺組織病理學結果 A:對照組；B:機械通氣肺損傷模型組；C:瘦素組 HE ×200

表2 各組大鼠血清及BALF中IL-18、IL-1β濃度的比較 (ng/L,±s)

表2 各組大鼠血清及BALF中IL-18、IL-1β濃度的比較 (ng/L,±s)

注:BALF 為支氣管肺泡灌洗液；VILI為機械通氣肺損傷；與對照組比較,a P ＜0.01；與VILI模型組比較,b P ＜0.05

組別 鼠數 血清BALF IL-18 IL-1β IL-18 IL-1β對照組 12 32±15 43±13 40±12 136±27 VILI模型組 12 124±24a 142±19a 132±22a 505±41a瘦素組 12 99±22ab 119±24ab 111±15ab 463±38ab F 值 63.40 87.37 98.10 381.20 P 值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.4 肺組織中NLRC4、caspase-1蛋白表達 3組之間比較,肺組織中NLRC4、caspase-1蛋白相對表達量差異有統計學意義 (F值分別為28.85、34.72,P值均＜0.01)。VILI 模型組、瘦素組NLRC4、caspase-1蛋白表達顯著高于對照組 (P值均＜0.01),瘦素組NLRC4、caspase-1 蛋白表達低于VILI模型組 (P值均＜0.05)。見圖2、表3。

圖2 各組大鼠肺組織中NLRC4、caspase-1蛋白質印跡檢測結果

表3 各組大鼠肺組織中NLRC4、caspase-1蛋白表達的比較 (±s)

表3 各組大鼠肺組織中NLRC4、caspase-1蛋白表達的比較 (±s)

注:VILI為機械通氣肺損傷；與對照組比較,a P ＜0.01；與VILI模型組比較,b P ＜0.05

組別 鼠數 NLRC4蛋白相對表達量caspase-1蛋白相對表達量對照組 12 0.50±0.16 0.42±0.12 VILI模型組 12 1.18±0.27a 0.98±0.21a瘦素組 12 0.92±0.22ab 0.79±0.16ab F 值 28.85 34.72 P 值 ＜0.01 ＜0.01

3 討論

動物研究結果顯示,外源瘦素可能在膿毒癥導致的ALI中起肺保護作用[3],抑制炎癥小體的激活、減輕炎癥反應對ALI有重要的保護作用[5-7]。然而瘦素是否能通過作用于NLRC4炎癥小體減輕大鼠VILI尚無相關研究。因此,本實驗通過預實驗結合前期研究成果[8],應用外源性瘦素 (50μg/kg)預處理VILI模型大鼠,以探討瘦素預處理在大鼠VILI發(fā)病過程中的作用機制。

有研究顯示[8-9],不同劑量外源性瘦素的應用能不同程度地緩解炎癥的發(fā)展,對炎癥性疾病有良好的治療作用,瘦素對細胞感染和損傷的調控機制可能是通過各種細胞因子來實現的。此外,肺氣道上皮細胞被激活后,瘦素可合成并產生黏附分子和細胞因子,延長了肺氣道上皮細胞的生存期限[10]。NLRC4是由N 端的天冬氨酸蛋白水解酶募集結構域 (caspase recruitment domain,CARD)、中間的核苷酸結合寡聚化結構域和C 端的亮氨酸聚集結構域組成。NLRC4 炎癥小體是由NLRC4 和caspase-1組成的多蛋白復合物,當細胞受細胞外信號(如胞質細菌鞭毛蛋白、革蘭染色陰性的Ⅲ型分泌系統、脂多糖等)刺激后,NLRC4 N 端的CARD 通過與caspase-1的CARD 相互作用,產生IL-18和IL-1β等炎癥因子,可廣泛參與調節(jié)免疫功能、炎癥反應、焦亡等有關的基因轉錄和表達[11-13]。有研究表明[14],腺苷酸激活蛋白激酶的磷酸化能減少NLRC4炎癥小體的激活,但具體機制有待進一步探討,而瘦素已經被證明能激活不同的信號通路,包括腺苷酸激活蛋白激酶、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B和激活的Janus激酶/信號轉導通路52 等[15-16]。因此,瘦素可能通過抑制NLRC4炎癥小體活性發(fā)揮抗炎的潛能。本實驗顯示,對照組肺組織中僅有少量NLRC4炎癥小體表達；VILI模型組NLRC4 炎癥小體表達增強,說明VILI大鼠肺組織中NLRC4炎癥小體激活明顯增加；瘦素組肺組織中NLRC4 炎癥小體表達較VILI模型組減少,證明瘦素預處理可以抑制NLRC4炎癥小體的激活。

在VILI發(fā)病過程中,IL-1β具有促進肺泡上皮細胞中p38磷酸化和趨化因子上調的能力,從而加重ALI,IL-1β還可激活炎性細胞并釋放氧自由基,直接造成肺組織損傷；而組織蛋白酶D 抑制劑pepstatin A 抑制IL-1β表達,減輕ALI[17]。另有研究表明,具有生物活性的IL-18可進一步放大炎癥反應,并誘導更多炎癥因子和趨化因子的產生,例如IL-1β、IL-6 和單核細胞趨化蛋白1 等,是ALI發(fā)病過程中合成的主要炎癥因子之一[18]。此外,IL-1β已被證明可通過減少上皮鈉通道而導致肺水腫[19]。而IL-18已被證實與ALI的發(fā)生有關[20]。兩者的高濃度與危重患者的ALI風險以及發(fā)病率和死亡率指標有關[21]。因此,抑制IL-1β和IL-18是減少ALI和維持免疫穩(wěn)態(tài)的重要治療靶標。但有實驗表明單純阻斷IL-1β或IL-18可能不足以抑制過度的免疫反應[22]。因此,同時抑制IL-1β和IL-18產生的抑炎效應可能對ALI的治療有效。本研究顯示,在VILI模型中,肺NLRC4炎癥小體及其介導的IL-1β、IL-18 炎癥因子被激活,表達量較對照組明顯增加；而應用瘦素后其表達量明顯降低,說明瘦素預處理可以抑制NLRC4介導的炎癥因子的表達。提示NLRC4炎癥小體依賴的炎癥因子途徑很可能是瘦素調節(jié)VILI的分子機制之一(圖3),但其具體機制有待進一步研究。

綜上,本研究結果表明,瘦素預處理可減少機械通氣大鼠肺組織NLRC4炎癥小體表達而失去活性,抑制肺NLRC4炎癥通路激活,減輕肺損傷,從而發(fā)揮肺保護作用,但其肺保護作用的機制和最適劑量仍有待進一步探討。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

圖3 瘦素在大鼠機械通氣肺損傷中的作用及其可能機制的信號通路