劉 燁，解雅英

（1.天津市北辰醫(yī)院麻醉科，天津 300400；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院麻醉科）

OJ是臨床上比較常見的復(fù)雜疾病，內(nèi)蒙各地區(qū)由于地理?xiàng)l件和生活習(xí)慣等因素影響已經(jīng)成為OJ的高發(fā)地區(qū)。OJ 可導(dǎo)致臟器損害更甚至導(dǎo)致多器官功能衰竭，而肝臟是最早受累的器官，同時(shí)也是其它器官損害的重要誘因。所以選對肝臟保護(hù)作用的麻醉藥物對OJ患者疾病的發(fā)展、并發(fā)癥的預(yù)防防治、以及疾病的預(yù)后康復(fù)具有重要的臨床意義。Dex 可以調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，并具有抗炎、鎮(zhèn)靜作用。PI3K/Akt 通路是細(xì)胞膜受體介導(dǎo)的直接作用于細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，調(diào)控凋亡特異性蛋白維持細(xì)胞存活和增殖，抑制細(xì)胞凋亡[1]。有學(xué)者[2]研究表明，Dex激活PI3K/Akt信號(hào)通路，上調(diào)Bcl-2的表達(dá)，抑制下游caspase-3的活化，減少離體胎鼠海馬神經(jīng)元的凋亡，具有神經(jīng)保護(hù)作用。此次實(shí)驗(yàn)制作OJ大鼠模型，模型造好后72h 腹腔注射一定劑量的Dex進(jìn)行干預(yù)，同時(shí)設(shè)立PI3K 特異性抑制劑LY294002的對照組，在給藥后3h取肝右外葉組織，進(jìn)行HE染色觀察肝組織病理學(xué)變化；Western Blot 法測定肝組織 Akt、磷酸化 Akt（p-Akt）的表達(dá)水平；TUNEL 法計(jì)算肝細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）；免疫組化法檢測肝組織Bcl-2 及Bax 陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)。通過此次研究得出的結(jié)果，在進(jìn)一步分析再論證Dex對OJ大鼠肝細(xì)胞凋亡的影響，同時(shí)明確該影響是否與Dex 激活PI3K/Akt 信號(hào)通路有關(guān)，與調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因Bax/Bcl-2的表達(dá)相關(guān)，可為臨床上OJ引起的肝損傷的防治和在肝保護(hù)藥物選擇方面可以提供新的思路。

1 材料與方法

Wistar 雄性清潔大鼠為 40 只，均為7～9 周齡，體重在220～270g，均來自內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK（蒙）2015-0001。由動(dòng)物實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，規(guī)定適應(yīng)喂養(yǎng)7 天的標(biāo)準(zhǔn)條件。大鼠隨機(jī)分為4 組，每組10 只：梗阻性黃疸組（OJ組）；LY294002+右美托咪定組（L組）；假手術(shù)組（S組）；右美托咪定組（D組）。

參考Assimakopoulos[3]方法建立大鼠梗阻性黃疸模型，4 組大鼠術(shù)前不禁水、均需禁食12h。L、OJ及D 組：稱重后腹腔注射10%水合氯醛3mL/kg，麻醉起效后將大鼠固定在動(dòng)物解剖臺(tái)上，備皮、碘伏消毒，取上腹正中2.5cm切口進(jìn)入腹腔，沿十二指腸找到一條纖細(xì)、透亮、淡黃色的細(xì)管通向十二指腸，即膽總管，然后用4-0 絲線雙重結(jié)扎。結(jié)扎完成術(shù)野無出血后，逐層縫合切口關(guān)腹，放入籠內(nèi)繼續(xù)飼養(yǎng)。S組：麻醉同前，僅行膽總管游離后縫合切口關(guān)腹。給藥劑量參照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)》[4]。

L 和 D 組造模后 3 天腹腔注射 100μg/kg 右美托咪定注射液（批號(hào)：20170802，江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司），S 和OJ 組注射同等量0.9%的無菌生理鹽水。并使L 組在Dex 給藥的10min 前尾靜脈泵入PI3K 特 異 性 抑 制 劑 LY294002（10%DMSO 配 置10mmol/L）0.3mg/kg。均根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)定時(shí)間點(diǎn)在給藥后3h 使用10%水合氯醛劑量為：3mL/kg 腹腔內(nèi)注射麻醉，循縫合后原切口切開后進(jìn)腹，在活體狀態(tài)下取大鼠肝右外葉1.0cm×1.0cm× 0.5cm 2 份，一份放入-80℃冰箱保存，通過Western blot法（抗體采購于Cell signaling）檢測肝臟組織Akt、p-Akt的表達(dá)，加入含PMSF 裂解液中，離心后取上清液，用電轉(zhuǎn)移法將分離的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，4℃溫育并過夜，再加入封閉液稀釋后濃度為1:50000 的二抗（HRP 標(biāo)記羊抗小鼠）37℃搖床孵育2h，使用抗β-actin 兔多克隆抗體作為對照，進(jìn)行曝光成像[5]。使用BandScan分析膠片的灰度值，通過目標(biāo)蛋白條灰度值與內(nèi)參β-actin 蛋白條帶灰度值的比值，來表示肝臟組織Akt、p-Akt的相對表達(dá)水平。

另一份標(biāo)本放置于4%多聚甲醛中固定，進(jìn)行脫水、固定、石蠟切片、HE 染色，再光學(xué)顯微鏡（Olympus 公司，日本）下觀察肝組織病理學(xué)變化。將制好的石蠟切片烤片和脫蠟后，TUNEL法計(jì)算肝細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI），免疫組化法測定肝組織Bcl-2及Bax 陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)[5]。

采用了SPSS 13.0軟件包對其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，使用Shapiro-Wilk 方法進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，并用定量資料以表示，而組間比較采用單因素方差分析法，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Dex對OJ大鼠肝臟病理學(xué)改變

S組伴有少量炎癥細(xì)胞浸潤肝細(xì)胞；OJ 組肝細(xì)胞壞死伴大量炎性細(xì)胞浸潤;L 組肝細(xì)胞形態(tài)較D組異常，肝竇淤血加重，炎性細(xì)胞浸潤明顯增多；D組肝細(xì)胞形態(tài)較OJ 組正常，肝竇充血及炎性細(xì)胞浸潤少，但門靜脈及小葉靜脈仍有增生（見圖1）。

圖1 四組大鼠肝臟病理結(jié)果

2.2 Dex對OJ大鼠肝細(xì)胞凋亡的影響

OJ 組較 S 組肝細(xì)胞 TUNEL 檢測值升高（P＜0.05），L 組大鼠肝細(xì)胞 TUNEL 檢測水平高于 D 組（P＜ 0.05），D 組大鼠肝細(xì)胞TUNEL 檢測值明顯低于OJ組（P＜ 0.05）（見表1，圖2）。

表1 各組肝細(xì)胞凋亡指數(shù)（，n＝10）

表1 各組肝細(xì)胞凋亡指數(shù)（，n＝10）

注：與S組相比，＊P＜0.05；與OJ組相比，#P＜0.05；與DEX組相比，＊＊P＜0.05。

L組19.31±0.43**凋亡指數(shù)S組0.81±0.12 OJ組22.53±0.17*DEX組8.40±0.18#

圖2 四組大鼠肝臟TUNEL染色結(jié)果

2.3 Dex對OJ大鼠肝組織Bax和Bcl-2表達(dá)的影響

與S組進(jìn)，OJ組大鼠肝組織中Bcl-2和Bax的表達(dá)均升高（P＜0.05）；D 組較 OJ 組大鼠肝組織中Bcl-2 表達(dá)上調(diào)，Bax 表達(dá)下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；相比于D 組，L 組大鼠肝組織中Bcl-2表達(dá)下調(diào)，Bax表達(dá)上調(diào)（P＜0.05）（見表2）。

表2 各組Bcx/Bc1-2陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)（，n＝10）

表2 各組Bcx/Bc1-2陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)（，n＝10）

注：與S組相比，＊P＜0.05；與OJ組相比，#P＜0.05；與DEX組相比，＊＊P＜0.05。

images/BZ_86_254_446_377_508.pngimages/BZ_86_377_446_549_508.pngimages/BZ_86_549_446_764_508.pngimages/BZ_86_764_446_983_508.pngimages/BZ_86_254_571_377_633.pngBc1-2 images/BZ_86_377_571_549_633.png0.6±0.52images/BZ_86_549_571_764_633.png8.64±0.51*images/BZ_86_764_571_983_633.png34.75±3.53#L組15.99±1.50**31.75±0.39**

2.4 Dex 對 OJ 大鼠肝 組 織 Akt 和 p-Akt 表達(dá)水平的影響

各組p-Akt均有不同程度的變化，但總Akt蛋白變化含量不大。S組較OJ組大鼠肝組織中p-Akt 蛋白表達(dá)下調(diào)（P＜0.05）；相比于OJ組，D組大鼠肝組織中p-Akt 顯著上調(diào)（P＜0.05）；與D組相比，L組大鼠肝組織中p-Akt表達(dá)降低（P＜0.05）。（見表3，圖3）。

表3 各組Akt/P-Akt表達(dá)情況（，n＝10）

表3 各組Akt/P-Akt表達(dá)情況（，n＝10）

注：與S組相比，＊P＜0.05；與OJ組相比，#P＜0.05；與DEX組相比，＊＊P＜0.05。

images/BZ_86_257_1439_379_1502.pngAkt images/BZ_86_379_1439_575_1502.pngS組0.6±0.01images/BZ_86_575_1439_790_1502.pngOJ組0.59±0.03images/BZ_86_790_1439_1010_1502.pngDEX組0.57±0.06 L組0.59±0.05 0.31±0.01**

圖3 各組大鼠Akt/p-Akt表達(dá)水平

3 討論

本實(shí)驗(yàn)大鼠梗阻性黃疸模型中行雙重結(jié)扎膽總管的手術(shù)方式，3 天后觀察到大鼠一般身體狀態(tài)下降明顯，伴隨食欲明顯下降，尿液顏色呈現(xiàn)深黃，尾部、耳廓等區(qū)域毛發(fā)覆蓋少處皮膚顏色變黃，紅色鞏膜處變淺，大便變成白陶土色，各種現(xiàn)象表明模型制備成功。

此次應(yīng)用了TUNEL 染色法觀察到以下幾點(diǎn)：（1）OJ 組大鼠有出現(xiàn)肝細(xì)胞凋亡現(xiàn)象；（2）與S 組相比，OJ 組、D 組和 L 組大鼠肝細(xì)胞凋亡明顯增多，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞比較明顯，這表明OJ會(huì)直接導(dǎo)致肝細(xì)胞的凋亡，從而引起肝功能受損。通過以往研究表明，OJ時(shí)肝細(xì)胞發(fā)生凋亡的情形可能有：（1）膽鹽排泄障礙[6]；（2）線粒體功能障礙以及肝臟能荷的消耗[7]；（3）氧自由基生成增加[8]；（4）鈣超載[9]；（5）釋放大量細(xì)胞因子[10，11]等，但其具體分子機(jī)制仍未闡明。

PI3K/Akt通路是細(xì)胞膜受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，通過調(diào)控凋亡特異性蛋白維持細(xì)胞存活和增殖，抑制細(xì)胞凋亡[12]。同時(shí)，Tüfek A 等發(fā)現(xiàn)，抗凋亡蛋白Bcl-2 表達(dá)于OJ 大鼠肝組織中，并且其表達(dá)水平隨OJ 時(shí)間的延長、肝細(xì)胞凋亡的增加而增加，說明OJ 時(shí)PI3K/Akt 信號(hào)通路參與肝細(xì)胞凋亡的過程[13]。故我們選擇大鼠肝臟組織p-Akt 和凋亡相關(guān)基因Bcl-2/Bax的表達(dá)水平作為大鼠OJ時(shí)肝細(xì)胞凋亡的檢測指標(biāo)。

Dex 是一種新型的高選擇性的α2-腎上腺素受體激動(dòng)劑，廣泛應(yīng)用于臨床，具有鎮(zhèn)靜、催眠、鎮(zhèn)痛、抗交感神經(jīng)等作用，可用于麻醉和重癥監(jiān)護(hù)[14]。近年在基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，Dex 所發(fā)揮作用的機(jī)理一般主要包括中樞機(jī)制以及外周機(jī)制，并通過下調(diào)因創(chuàng)傷所導(dǎo)致的脂質(zhì)過氧化而應(yīng)激反應(yīng)[15]，從而有效降低傷害性刺激所引起的免疫性炎癥反應(yīng)介導(dǎo)促炎性細(xì)胞因子的過度生成，從而有效保護(hù)脆弱的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，減弱由于臟器缺血再次灌注損傷中產(chǎn)生的細(xì)胞凋亡結(jié)局，對腦、肺、心、腎等多種臟器具有正向作用。

在此次實(shí)驗(yàn)中，我們詳細(xì)分析了OJ 時(shí)肝組織Bax/Bcl-2 陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)及p-Akt 的表達(dá)水平，D 組中Bax/Bcl-2 陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)有所增加，但OJ 組Bax表達(dá) D 組弱，Bcl-2 表達(dá) D 組強(qiáng)，OJ 組和 D 組 p-Akt表達(dá)均有所增加，D組比OJ組p-Akt表達(dá)增加，給予PI3K 特異性抑制劑LY294002 后OJ 組肝細(xì)胞凋亡程度又明顯加重，提示Dex 通過激活PI3K/Akt 信號(hào)通路，來調(diào)節(jié)大鼠肝臟組織中Bax 和Bcl-2 的表達(dá)水準(zhǔn)來抑制肝細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)探討了Dex 對梗阻性黃疸大鼠肝細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果表明Dex 可明顯改善梗阻性黃疸引起的肝組織結(jié)構(gòu)損傷，減少肝細(xì)胞凋亡，肝組織中p-Akt表達(dá)上升，上調(diào)抵抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)水平，下調(diào)促進(jìn)凋亡基因Bax的表達(dá)水平。這表示，PI3K/Akt 信號(hào)通路的激活可能是右美托咪定對梗阻性黃疸患者肝臟發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制之一。