鄭啟煒，塔拉，白瑞霞

（內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010017）

胃癌是一種發(fā)生在人的胃黏膜上皮細(xì)胞中的惡性腫瘤。我國(guó)胃癌高發(fā)，據(jù)統(tǒng)計(jì)每年胃癌新增病例接近40 萬(wàn)[1，2]。并且胃癌在我國(guó)各種惡性腫瘤中發(fā)病率居首位，每年約17 萬(wàn)人死于該病。miR-365抑制胃癌細(xì)胞的增殖，并普遍參與多種消化道腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[3]。細(xì)胞周期失控、超常運(yùn)行等情況都會(huì)導(dǎo)致癌瘤的發(fā)生，如果停滯不前細(xì)胞將衰老和凋亡。其中Cyclin D1在細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，也決定著細(xì)胞能否能繼續(xù)的生長(zhǎng)與增殖[4]。p21 基因是細(xì)胞周期蛋白依靠性激酶抑制劑家族中的一個(gè)重要成員[5]。與腫瘤的抑制作用密切相關(guān)[4]。本研究通過(guò)探究miR-365對(duì)胃癌細(xì)胞的影響，以期為新的調(diào)控胃癌的發(fā)生、發(fā)展，具體機(jī)制的研究以及治療來(lái)開(kāi)辟新的思路和途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

大學(xué)病原生物與免疫學(xué)研究室惠贈(zèng)RGM-1 細(xì)胞和SGC-7901 細(xì)胞；轉(zhuǎn)染試Lipofectamine2000（Invitrogen），實(shí)時(shí)熒光定量PCR 等實(shí)驗(yàn)所用試劑均購(gòu)于大連寶生物工程公司；由上海英濰捷基貿(mào)易服務(wù)有限公司合成實(shí)驗(yàn)所需的質(zhì)粒表達(dá)載體。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法檢測(cè)miR-365 的表達(dá)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC-7901 細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA 設(shè)計(jì)miR-365 及內(nèi)參基因的PCR引物，以相應(yīng)的cDNA 作為模板，擴(kuò)增按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC-7901 的細(xì)胞收集，隨機(jī)分為3 組：miR-365 轉(zhuǎn)染組，陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染組和空白對(duì)照組。轉(zhuǎn)染組中加入3μg的miR-365 mimics 和300 μL脂質(zhì)體。將質(zhì)粒和脂質(zhì)體分混合均勻后加入培養(yǎng)基中。培養(yǎng)了48 h后，將3組的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞分別收集好后，每組細(xì)胞中miR-365的表達(dá)采用RT-PCR方法檢測(cè)，觀察其轉(zhuǎn)染效果。

1.2.4 MTT 法繪制生長(zhǎng)曲線取三組細(xì)胞，每組接種6 個(gè)孔，于96 孔板。培養(yǎng)24h 以后，再分別于第1、2、3、4、5 天的時(shí)候在每個(gè)復(fù)孔中分別加入20μL 50mg/mL 的MTT 液體，繼續(xù)培養(yǎng)24h 后，檢測(cè)各組細(xì)胞的光吸收值（A值），時(shí)間為x 軸，A值為y 軸，繪制出胃癌SGC-7901 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線（酶聯(lián)儀570nm波長(zhǎng)條件下檢測(cè)）。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡上流式細(xì)胞儀檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染48h 后的三組細(xì)胞，分別檢測(cè)每組的凋亡率。

1.2.6 Western blotting檢測(cè)蛋白 收集轉(zhuǎn)染48 h 后三組細(xì)胞，提取蛋白。12% 的SDS-PAGE 凝膠電泳。轉(zhuǎn)移到NC 膜，用5%脫脂奶粉封閉，然后加入一抗（1:800），放置于4 ℃冰箱過(guò)夜。第二天取出并加入對(duì)應(yīng)的1:3 000 的堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗（羊抗兔IgG），室溫放置反應(yīng)1 h。最后電化學(xué)發(fā)光顯色拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 20.0 的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組時(shí)為t檢驗(yàn)，多組時(shí)為單因素方差分析。結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-365的表達(dá)及其轉(zhuǎn)染效果

胃癌SGC-7901細(xì)胞中miR-365的表達(dá)水平顯著低于RGM-1 細(xì)胞（P＜0.05）（見(jiàn)表1）。轉(zhuǎn)染組中miR-365 表達(dá)較陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組均有顯著升高（P＜0.05），陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組miR-365的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（見(jiàn)表2）。

表1 RGM-1細(xì)胞和SGC-7901細(xì)胞miR-365的表達(dá)水平

表2 miR-365的表達(dá)水平

2.2 miR-365對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖的作用

miR-365轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞生長(zhǎng)速度從第三天開(kāi)始變慢，明顯低于陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染組和空白對(duì)照組細(xì)胞的生長(zhǎng)速度（P＜0.05）；而陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染組與空白對(duì)照組細(xì)胞的生長(zhǎng)速度相比沒(méi)有明顯差異（P＞0.05）（見(jiàn)圖1）。

圖1 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

2.3 miR-365對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響

miR-365 對(duì)胃癌SGC-7901 細(xì)胞的凋亡是有促進(jìn)作用（見(jiàn)表3，圖2）。

表3 轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組細(xì)胞的凋亡率

圖2 miR-365 對(duì)胃癌胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡的作用

2.4 miR-365 對(duì)胃癌 SGC-7901 細(xì)胞 p21、Cyclin D1蛋白表達(dá)的影響

用Western blotting 的方法檢測(cè)p21 蛋白和Cyclin D1蛋白的表達(dá)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染48h 的Cyclin D1 蛋白表達(dá)量顯著降低，而p21 蛋白表達(dá)量較空白組相比顯著升高（P＜0.05）（見(jiàn)圖3、4）。

圖3 Cyclin D1、p21的western blot 結(jié)果

圖4 Cyclin D1、p21蛋白表達(dá)量

3 討論

MicroRNAs是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)并研究較熱的一類很重要的基因調(diào)節(jié)分子。有研究表明在一些惡性腫瘤中，有些microRNAs 表達(dá)與相應(yīng)癌旁對(duì)照存在明顯不同，另外microRNAs在生物體的發(fā)育、腫瘤的發(fā)生等生理及病理過(guò)程中發(fā)揮著某些重要的作用。很多研究結(jié)果顯示腫瘤患者的預(yù)后與microRNAs的表達(dá)水平有一定關(guān)系。這就提示我們，尋找那些在腫瘤中發(fā)揮作用的microRNAs 并研究它們的作用機(jī)制，可為microRNAs 在腫瘤中的作用的研究提供新的思路，同時(shí)也為其在腫瘤的診斷和治療方面進(jìn)一步開(kāi)拓思路[6～8]。

Cyclin 參與調(diào)控細(xì)胞周期的進(jìn)程。CyclinD1 的蛋白分子量接近34KD，是與細(xì)胞周期關(guān)系密切一個(gè)關(guān)鍵性的基因，除了主要參與調(diào)控細(xì)胞G1 期限制點(diǎn)，同時(shí)也是參與調(diào)控細(xì)胞增殖，其在細(xì)胞從Gl期進(jìn)入S 期的過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，甚至決定著細(xì)胞能否繼續(xù)增殖與生長(zhǎng)。CyclinD1的表達(dá)異常會(huì)引起的細(xì)胞周期的失控進(jìn)而會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖并癌變[9]。有研究證明CyclinD1 與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，因此，近些年里有大量研究CyclinD1在乳腺癌、胃癌等癌細(xì)胞中的作用[4]。

胃癌的發(fā)生過(guò)程是一個(gè)極其復(fù)雜的，癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡受阻、惡性增殖及具體的作用機(jī)制等都有待進(jìn)一步研究[10]。miR-365 在多種腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-365 在胃癌SGC-7901細(xì)胞中呈低表達(dá)，通過(guò)轉(zhuǎn)染的方法，表明miR-365表達(dá)能夠明顯，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，同時(shí)使細(xì)胞凋亡的重要調(diào)控成員Cyclin D1 表達(dá)下調(diào)，p21 蛋白的表達(dá)上調(diào)，提示miR-365 可能通過(guò)下調(diào)cyclin D1 和上調(diào) p21 蛋白的表達(dá)來(lái)抑制胃癌細(xì)胞的增殖[9，11，12]。本研究結(jié)果或可作為胃癌的早期篩查以及胃癌的治療潛在的靶分子，并為下一步的臨床研究奠定基礎(chǔ)。也希望后期有更多實(shí)驗(yàn)多方來(lái)論證。