李雨彌，唐 勇

（成都市第二人民醫(yī)院急診科，四川 成都 610011）

急性腦梗死（acute cerebral infarction，ACI）是腦部供血動脈形成血栓、發(fā)生粥樣硬化或異物流入頸動脈、腦動脈等引起腦部供血不足，進而引發(fā)腦組織壞死或軟化的心血管疾病，其發(fā)病率、致死率極高，嚴重威脅病人生命安全[1]。ACI 發(fā)病除糖尿病、高血壓、高血脂等傳統(tǒng)因素外，表達失衡的微小RNA（microRNA，miRNA）是影響動脈粥樣硬化、炎癥反應(yīng)的重要因素，miRNA可能在心腦血管疾病的發(fā)展進程中發(fā)揮重要作用[2]。miR-29b 是miRNA 其中一員，其在ACI 病人血清中表達下調(diào)，與促炎細胞因子水平有關(guān)，其有望成為ACI 診治、預(yù)后評估的標志物[3]。微小RNA-23b（miRNA-23b，miR-23b）在腦外傷中表達異常，其可減輕腦水腫，抑制神經(jīng)元凋亡，緩解長期神經(jīng)功能缺失，miR-23b其可能是腦外傷的潛在治療靶標[4]。微小RNA-34a（miRNA-34a，miR-34a）可調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞凋亡，與腦水腫和動脈硬化、血管性癡呆等疾病有關(guān)，其可能成為缺血性血管損傷類疾病治療靶標[5]。但miR-23b、miR-34a 在ACI 病人血清中的水平及與頸總動脈內(nèi)膜中層厚度（intima-media thickness，IMT）的關(guān)系尚未有相關(guān)報道?；诖?，本研究通過檢測miR-23b、miR-34a 在ACI 病人血清中的表達水平、分析兩者與IMT的關(guān)系，以期為早期防治ACI提供可靠憑據(jù)。

1 一般資料與方法

1.1 一般臨床資料

選取2016-06～2019-01 于本院診治的ACI 病人168 例進行研究（ACI 組），其中男88 例，女80 例；年齡37～79歲，平均年齡（59.64±5.80）歲；身體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）為18.94～26.02 kg/m2，平均 BMI 為（22.84±2.45）kg/m2。并以同時間段內(nèi)于本院體檢正常者172 例進行對照研究（對照組），其中 男 91 例 ，女 81 例 ；年 齡 39～78 歲 ，平 均年齡（58.95±5.71）歲；BMI 為 18.09～26.15 kg/m2，平均BMI為（22.63±2.38）kg/m2。兩組性別、年齡、BMI等方面比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。收集兩組總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白等生化指標水平。

診斷標準：參照《中國急性缺血性腦卒中診治指南2014》ACI相關(guān)評判標準[6]。納入標準：（1）符合ACI診斷標準；（2）所有病人均經(jīng)MRI/頭顱CT 影像學(xué)檢查、確診；（3）病人發(fā)病入院就診時間≤72 h；（4）所有病人均首次發(fā)病；（5）生理病理檢查資料齊全者。

排除標準：（1）合并短暫性腦出血、心肌梗死或其他心腦血管疾病者；（2）合并心、肝、腎并發(fā)癥，嚴重感染者；（3）合并惡性腫瘤、手術(shù)誘發(fā)卒中者；（4）合并凝血功能障礙、痛風(fēng)、自身免疫性疾病、精神障礙、惡性腫瘤者；（5）近期使用抗炎藥物、抗血小板凝集、免疫抑制劑者。

所有病人家屬簽署知情同意書，且該項研究方法符合相關(guān)倫理學(xué)要求，經(jīng)本院倫理委員會審核批準后施行本項研究。

1.2 主要試劑與儀器

TRIzol 試劑（貨號：YDJ2531）購買于上海羽朵生物科技有限公司，TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit（貨號：4366596）購買于上海睿鉑賽生物科技有限公司，TaqMan?Universal PCR Master Mix（貨號：AB-4324018）購買于上海嶸崴達實業(yè)有限公司；人血管細胞粘附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）酶聯(lián)免疫吸附劑測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（貨號：EK0537）購買于上海和序生物科技有限公司；人腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA 試劑盒（貨號：EH009）購買于上海吉泰依科賽生物科技有限公司。

Implen 超微量紫外分光光度計（型號：NP-80）購買于無錫萊弗思生物實驗器材有限公司，ABI stepone plus 實時熒光定量PCR（Quantitative Realtime PCR，qRT-PCR）儀（型號：美國ABI StepOne-Plus）購買于北京安麥格貿(mào)易有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集與預(yù)處理收集ACI 病人入院后次日和健康體檢者體檢當(dāng)日空腹肘靜脈血約5mL，靜置35min，3500r/min 離心13min，分離得上層血清，分裝并密封保存于20℃冰箱中，用于miR-23b、miR-34a、VCAM-1、TNF-α水平檢測。

1.3.2 qRT-PCR 法檢測血清中 miR-23b、miR-34a表達水平從冰箱中取出凍存血清樣本，無菌環(huán)境下冰上解凍，加適量TRIzol 裂解液，提取血清總RNA，具體操作流程參考TRIzol 試劑說明書。采用紫外分光光度計檢測抽提RNA完整性、純度及濃度。依照TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit 說明書操作，得 cDNA。按照 TaqMan?Universal PCR Master Mix 操作步驟將 cDNA 擴增，并進行 PCR 檢測。miR-23b、miR-34a 均以U6 為內(nèi)參，采用2-△△CT法計算miR-23b、miR-34a相對表達量（見表1）。

1.3.3 兩組頸動脈IMT 檢測采用彩色多普勒超聲儀掃描雙側(cè)頸總、頸外及頸內(nèi)動脈，測量IMT，所用探頭頻率為7.5MHz。

1.3.4 ELISA 法檢測血清VCAM-1、TNF-α 水平 檢測兩組受試者血清VCAM-1、TNF-α 水平，檢測步驟嚴格參照相應(yīng)試劑盒說明書。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計學(xué)軟件分析所得實驗數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差描述，比較兩組間實驗數(shù)據(jù)，進行雙邊t 檢驗；計數(shù)數(shù)據(jù)以“例”表示，行χ2檢驗；采用Pearson 法分析ACI病人血清miR-23b、miR-34a、IMT 水平與VCAM-1、TNF-α相關(guān)性及miR-23b、miR-34a與IMT水平的關(guān)系；采用Logistic回歸分析ACI發(fā)生的影響因素。當(dāng)P＜0.05時，表示數(shù)據(jù)間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較

與對照組相比，ACI 組病人總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白水平升高（P＜0.05），高密度脂蛋白降低（P＜0.05）（見表2）。

表2 兩組一般資料比較(，n)

表2 兩組一般資料比較(，n)

images/BZ_31_257_2454_470_2561.pngimages/BZ_31_470_2454_712_2561.pngimages/BZ_31_712_2454_963_2561.pngimages/BZ_31_963_2454_1086_2561.pngPimages/BZ_31_257_2621_470_2682.pngimages/BZ_31_963_2621_1086_2682.pngimages/BZ_31_470_2621_712_2682.png58.95±5.71 22.63±2.38images/BZ_31_712_2621_963_2682.pngimages/BZ_31_257_2742_470_2849.pngimages/BZ_31_470_2742_712_2849.pngimages/BZ_31_712_2742_963_2849.png年齡（歲）BMI（kg/m2）三酰甘油（mmol/L）高密度脂蛋白（mmol/L）59.64±5.80 22.84±2.45images/BZ_31_963_2742_1086_2849.png1.105 0.802 0.270 0.805 0.423 0.000 1.26±0.361.70±0.479.7050.000images/BZ_31_257_2955_470_3061.pngimages/BZ_31_470_2955_712_3061.pngimages/BZ_31_712_2955_963_3061.pngimages/BZ_31_963_2955_1086_3061.png0.000 1.29±0.370.94±0.299.6930.000

2.2 兩組血清miR-23b、miR-34a表達水平及IMT水平比較

與對照組相比，ACI組病人血清miR-23b、miR-34a表達水平較高（P＜0.05），IMT增厚（P＜0.05）（見表3）。

2.3 兩組血清VCAM-1、TNF-α水平比較

與對照組相比，ACI 組病人血清VCAM-1、TNF-α水平較高（P＜0.05）（見表4）。

表3 兩組血清miR-23b、miR-34a表達水平及IMT水平比較()

表3 兩組血清miR-23b、miR-34a表達水平及IMT水平比較()

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表4 兩組血清VCAM-1、TNF-α水平比較()

表4 兩組血清VCAM-1、TNF-α水平比較()

nimages/BZ_31_1275_2132_1488_2193.png組別對照組images/BZ_31_1488_2132_1617_2193.png172images/BZ_31_1617_2132_1915_2193.pngimages/BZ_31_1275_2254_1488_2315.pngt images/BZ_31_1488_2254_1617_2315.pngimages/BZ_31_1617_2254_1915_2315.pngVCAM-1（μg/L）235.02±54.28 13.954 TNF-α（ng/mL）18.46±4.31 49.78±9.25 40.167 0.000

2.4 ACI 病人血清 miR-23b、miR-34a、IMT 水平與VCAM-1、TNF-α相關(guān)性分析

Pearson 法分析顯示，ACI 病人血清 miR-23b 與VCAM-1、TNF-α 水平均呈正相關(guān)（r=0.345、0.459，P均＜0.05）；ACI 病人血清miR-34a 與VCAM-1、TNF-α 水平均呈正相關(guān)（r=0.437、0.456，P均＜0.05）；ACI病人IMT 水平與VCAM-1、TNF-α 均呈正相關(guān)（r=0.539、0.308，P均＜0.05）（見表5）。

2.5 ACI 病人血清 miR-23b、miR-34a 水平與 IMT水平的關(guān)系

Pearson法相關(guān)性分析顯示，ACI病人血清miR-23b、miR-34a表達水平與IMT均呈正相關(guān)（r=0.412、0.443，P均＜0.05）（見圖1、2）。

表5 ACI病人血清miR-23b、miR-34a、IMT水平與VCAM-1、TNF-α的關(guān)系

圖1 ACI病人血清miR-23b表達水平與IMT的相關(guān)性

圖2 ACI病人血清miR-34a表達水平與IMT的相關(guān)性

2.6 影響ACI的Logistic回歸分析

以總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、miR-23b、miR-34a、IMT、VCAM-1、TNF-α為自變量，以是否發(fā)生ACI 為因變量，行Logistic 回歸分析，分析結(jié)果顯示低密度脂蛋白、miR-23b、miR-34a、IMT、VCAM-1、TNF-α 是影響ACI 發(fā)生的危險因素（P＜0.05）。

3 討論

ACI是臨床常見的腦部供血不足引發(fā)腦組織缺血、缺氧，從而出現(xiàn)腦組織神經(jīng)功能缺失、壞死癥狀的腦功能障礙疾病，其發(fā)病急，可引起腦水腫，具有高危性，對病人生命安全構(gòu)成直接威脅[7]。因此，必須尋找可早期評估、診治ACI的有效指標，改善大腦供血狀況，有效提高病人生存率和生活能力。

miRNA 廣泛分布于人體各組織、器官和外周血中，在個體生長代謝、信號傳導(dǎo)、炎癥反應(yīng)等生理病理過程發(fā)揮一定調(diào)節(jié)作用[8]。miRNA 參與腦水腫、腦外傷、動脈粥樣硬化、心肌梗死、腦梗死等心腦血管類疾病的病理過程[9]。miR-181a-5p 在冠心病中表達異常，在血管炎癥和動脈粥樣硬化形成中起重要調(diào)節(jié)作用，可延緩動脈粥樣硬化的進程，有望成為治療動脈粥樣硬化的新策略[10]。miR-499 在急性心肌梗死病人血漿中表達上調(diào)，其可作為治療急性心肌梗死的潛在靶標[11]。miR-124 在ACI 病人血清中呈異常表達，動態(tài)監(jiān)控miR-124 水平有助于防治缺血性中風(fēng)[12]。以上研究證實，miRNA 表達失調(diào)與缺血性血管疾病的發(fā)病進展有關(guān)。miR-23b在心肌梗死病人血清中呈高表達，可促進心肌細胞凋亡，有望作為心肌梗死診斷的有效生物標志物[13]。miR-23b-3p是miR-23b其中一員，其在缺血性卒中病人血清中表達上調(diào)，可作為缺血性卒中預(yù)測、評估標志物[14]。本研究中miR-23b 在ACI 組病人血清中表達明顯高于對照組，提示miR-23b 可能在ACI發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。miR-34a具有生物學(xué)調(diào)節(jié)作用，其在心肌梗死中上調(diào)，與心肌梗死后的重塑及缺血后心肌纖維化相關(guān)，有可能成為治療心肌梗死的靶標[15]。miR-34a-5p 是miR-34a 家族成員，在急性缺血性卒中病人中呈過表達，具有潛在調(diào)節(jié)作用，可作為卒中治療靶點和預(yù)后評估指標。本研究中miR-34a在ACI組病人血清中的表達水平明顯高于對照組，提示miR-34a 可能參與并影響ACI 疾病的發(fā)生發(fā)展過程。頸動脈IMT 水平升高是動脈粥樣硬化內(nèi)膜損傷評估的重要標志，其在ACI 病人中具有較高水平，與炎癥因子TNF-α 呈正相關(guān)，TNF-α可作為ACI病人腦動脈狹窄的標記物和危險因素，且動態(tài)監(jiān)控炎癥因子及IMT 水平，有利于評估病情程度和預(yù)后。本研究顯示ACI組病人IMT水平明顯高于對照組，提示頸動脈IMT 可能在ACI 發(fā)病過程中發(fā)揮一定作用。

研究顯示，VCAM-1、TNF-α 在ACI 病人中呈高水平，經(jīng)醒神通腑方聯(lián)合胞二磷膽堿注射液治療后，兩者水平顯著降低，兩者參與的炎癥反應(yīng)可進一步促進腦梗死的發(fā)生與發(fā)展。本研究中ACI組病人血清VCAM-1、TNF-α 水平明顯高于對照組，提示 VCAM-1、TNF-α 可能在 ACI 疾病發(fā)展進程中起到一定作用。本研究顯示，ACI 病人血清miR-23b、miR-34a、IMT 與 VCAM-1、TNF-α水平均呈正相關(guān)，提示miR-23b、miR-34a、IMT可能均與VCAM-1、TNF-α 相互作用共同影響ACI 發(fā)生與發(fā)展。進一步分析發(fā)現(xiàn)，ACI 病人血清miR-23b、miR-34a 表達水平與IMT 均呈正相關(guān)，提示miR-23b、miR-34a 可能與 IMT 相互影響，進而在 ACI 疾病發(fā)展中發(fā)揮重要作用。更進一步研究顯示，低密度脂蛋白、miR-23b、miR-34a、IMT、VCAM-1、TNF-α是影響ACI發(fā)生的危險因素，提示低密度脂蛋白、miR-23b、miR-34a、IMT、VCAM-1、TNF-α 水平升高，均可能增加ACI 發(fā)病風(fēng)險，及時動態(tài)監(jiān)測低密度脂蛋白、miR-23b、miR-34a、IMT、VCAM-1、TNF-α水平，有助于及早防治ACI。

綜上所述，ACI 病人血清 miR-23b、miR-34a 均表達上調(diào)，兩者均與頸動脈IMT 關(guān)系密切，兩者可能與頸動脈IMT 相互影響，共同參與ACI 發(fā)病進程。但本研究仍存在一些不足之處，即研究樣本量較少，可能引起結(jié)果發(fā)生一定偏差，后續(xù)研究將進一步擴大樣本量，進行更深入研究。