盧玉君 王孝先 趙偉進(jìn) 劉曉鳳 付彩青 何建清

摘要：該文以接種不同砂生槐根瘤內(nèi)生菌的黑青稞種子和不接種菌株的黑青稞種子為研究材料，采用培養(yǎng)皿作為基質(zhì)，觀察黑青稞種子萌發(fā)及幼苗生長情況，測定接種不同根瘤內(nèi)生菌后的黑青稞發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、株高、根長、須根數(shù)、根冠比、植株全株干/鮮重的生理性狀，并對各不同處理進(jìn)行隸屬函數(shù)綜合評價。結(jié)果表明：菌株R7和R17的發(fā)芽率均達(dá)到了100%，R17、R18及R19的發(fā)芽勢達(dá)到了90%，R17和R18的發(fā)芽指數(shù)變化量與CK1對比分別為45.38%和32.05%。在不同處理下，R21、R14與R7的平均根長與CK1對比呈抑制作用，其變化量分別為-50%、-34.28%及-28.99%;黑青稞幼苗植株高與CK1對比，僅有4株菌對株高產(chǎn)生促進(jìn)作用，分別是R5、R18、R22及R28;黑青稞幼苗須根數(shù)與CK1對比，除R15與R21呈抑制作用外，其余菌株均對幼苗須根數(shù)產(chǎn)生促進(jìn)作用，但R17、R18及R19處理下須根數(shù)無顯著差異（P>0.05）。與CK1對比，對植株全株鮮重產(chǎn)生促進(jìn)作用的僅有4株菌，分別為R2、R18、R22和R28;菌株R5、R6及R14的全株干重均低于對照CK1，其余與CK1對比差異顯著（P<0.05）。綜上結(jié)果顯示，不同砂生槐根瘤內(nèi)生菌菌株對黑青稞的種子萌發(fā)及幼苗生理性狀影響差異顯著（P<0.05）;接種不同根瘤內(nèi)生菌效應(yīng)的綜合評價結(jié)果顯示，接種R17、R18、R28、R20、R19菌株的黑青稞種子隸屬函數(shù)值為6.71、6.45、6.31、5.81、5.76，可初步選為優(yōu)良的促生菌株。

關(guān)鍵詞： 砂生槐， 根瘤內(nèi)生菌， 黑青稞， 種子萌發(fā)， 促生

中圖分類號：Q945

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：10003142（2021）02020610

Abstract：In order to study the effects of inoculating different sophora moorcroftiana nodule endophytes on the germination and physiological traits of black highland barley seeds， the endophytic bacteria of sophora moorcroftiana nodules which promoted the growth of black highland barley seedlings were screened. Black highland barley seeds inoculated with endophytic bacteria of different sophora moorcroftiana nodules and black highland barley seeds not inoculated with strains were used as research materials， and culture dishes were used as substrates to observe the seed germination and seedling growth of black highland barleys. The germination rate， germination potential， germination index， plant height， root length， root number， rootshoot ratio， physiological characteristics of plant dry/fresh weight of black highland barley after inoculation with different endophytic bacteria were determined， and the different treatments were subordinated. Comprehensive evaluation of functions. The results showed that the germination rates of strains R7 and R17 reached 100%， the germination potential of R17， R18 and R19 reached 90%， and the germination indexes of R17 and R18 were 45.38% and 32.05%， respectively. Under different treatments， the average root length of R21， R14 and R7 was inhibited by CK1， and the changes were -50%， -34.28% and -28.99%， respectively. The plant height of black highland barley seedlings was compared with CK1， and only four strains promoted plant height， which were R5， R18， R22 and R28. The number of roots of black highland barley seedlings was compared with CK1， Except that R15 and R21 inhibited， the other strains promoted the number of seedlings of seedlings， butthere was no significant difference in the number of roots under R17， R18 and R19 treatments （P>0.05）. Compared with CK1， there were only four strains that promoted the fresh weight of plants， which were R2， R18， R22 and R28. The dry weight of strains R5， R6 and R14 were lower than that of control CK1， and the others had significant differences compared with CK1 （P<0.05）. The results indicate that the different endophytic strains of different sophora moorcroftiana nodules have significant effects on the seed germination and seedling physiological traits of black highland barley （P<0.05）. The comprehensive evaluation results of inoculating different nodule endophytic effects showed that R17， R18， R28 and R20 were inoculated. The subfunction value of the black highland barley seed of R19 strain is 6.71， 6.45， 6.31， 5.81， 5.76， which can be initially selected as an excellent growthpromoting strain.

Key words： Sophora moorcroftiana， endophytic bacteria in root nodules， black highland barley， seed germination， promote growth

青稞（Hordeum vulgare var. coeleste）起源于西藏，不僅是藏族人民的主糧，而且還是西藏的第一大作物，在西藏的種植面積達(dá)14.18萬hm2（梁珠英，2014;朱丹等，2014;黃海蛟和李楊，2019）。青稞通常被分為白、黑、紫、墨綠青稞等類型，研究表明，青稞除了具有高蛋白、高纖維、高維生素、低脂肪以及低糖（三高兩低）的特點以外，還富含β葡聚糖、母育酚、黃酮、花青素、維生素、膳食纖維等功能性成分，其中黑青稞在營養(yǎng)品質(zhì)和抗氧化活性物質(zhì)含量方面優(yōu)于白青稞，在功能性保健產(chǎn)品開發(fā)方面有較高的利用價值，因此越來越受到消費者的歡迎（汪麗萍等，2012;朱睦元和張京，2015;徐菲等，2016;林津等，2016;張帥等，2017;杜道坤等，2017）。西藏耕種土壤養(yǎng)分氮素偏低，缺乏磷素，為了保證黑青稞產(chǎn)量長期施用氮磷鉀復(fù)混肥，但長期施肥會引起土壤污染問題，阻礙作物生長和降低農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量（鐘國輝等，2005;任順榮等，2005;周麗萍和戚瑞生，2017）。因此，發(fā)掘能夠替代化學(xué)肥料的微生物菌肥勢在必行。

植物內(nèi)生菌（Endophytes）是植物體內(nèi)微生物群體的主要成員，大多內(nèi)生菌對宿主植物產(chǎn)生有益生物學(xué)作用，如促生、抗病、固氮、溶磷、解鉀等，同時還是微生物肥料的重要菌源之一（何紅等，2004;高陽等，2017）。趙龍飛等（2016）研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)生菌DD132對小麥幼苗生長具有明顯的促生作用。周怡等（2009）從大豆種子中分離到的1株內(nèi)生芽孢桿菌SN10E1，其對豆芽長度增長41%，百株鮮重增長28%。研究表明干旱脅迫對植物種子萌發(fā)與幼苗生長會產(chǎn)生一定的影響（王霞等，2001;孫景寬等，2006），如Saravanakumar et al.（2011）接種P. fluorescens Pf1菌株的綠豆苗在干旱脅迫下的活力指數(shù)、干重與鮮重、CAT與POD活性，脯氨酸的積累量均高于對照，提高了植株的干旱脅迫能力。此外，經(jīng)產(chǎn)吲哚乙酸（IAA）內(nèi)生菌浸種處理后的玉米種子萌發(fā)率在適宜的PEG濃度下均有不同程度的提高，表明了產(chǎn)IAA內(nèi)生菌緩解玉米種子干旱脅迫的影響（高陽等，2017）。

本研究以西藏山南隆子黑青稞為原材料，采用分離自西藏特有物種“砂生槐”（Sophora moorcroftiana）的根瘤內(nèi)生細(xì)菌，研究砂生槐根瘤內(nèi)生細(xì)菌對非豆科植物黑青稞種子萌發(fā)和幼苗的促生作用，以期篩選出優(yōu)良的根瘤內(nèi)生細(xì)菌，為西藏青稞微生物菌肥研制提供科學(xué)合理的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試青稞種子黑青稞種子于2018年由西藏山南隆子縣農(nóng)牧局提供。

1.1.2 供試根瘤內(nèi)生菌菌株供試的28個菌株采集自西藏米林縣、朗縣、加查縣、林周縣、白朗縣、拉薩市、日喀則市、貢嘎縣、扎囊縣等地的盛花期和結(jié)莢期砂生槐根瘤樣品，分離篩選后保存在西藏農(nóng)牧學(xué)院生物技術(shù)中心真菌實驗室的冰箱中（何建清等，2019）。

1.1.3 供試培養(yǎng)基保存菌株的培養(yǎng)基使用LB培養(yǎng)基，LB固體培養(yǎng)基配方如下（張丹鳳等，2018）：蛋白胨10 g、酵母粉5 g、NaCl 10 g、瓊脂16～18 g，pH值為7.4～7.6。培養(yǎng)菌株的培養(yǎng)基使用蒙金娜有機(jī)磷液體培養(yǎng)基，蒙金娜有機(jī)磷液體培養(yǎng)基配方如下（李海云等，2018）：MnSO4·4H2O 0.03 g、FeSO4·7H2O 0.03 g、CaCO3 5.0 g、葡萄糖10.0 g、（NH4）2SO4 0.5 g、卵磷脂0.2 g、NaCl 0.3 g、KCl 0.3 g、酵母膏0.4 g、瓊脂20 g，pH 7.0～7.5。配制時用蒸餾水定容至1 000 mL，121 ℃滅菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 根瘤內(nèi)生菌株的培養(yǎng)將存放于冰箱中的菌株分別挑起單菌落接種到蒙金娜有機(jī)磷液體培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫、160 r·min1震蕩培養(yǎng)7 d（趙偉進(jìn)等，2018）。

1.2.2 有效磷含量及吲哚乙酸IAA含量的測定采用鉬銻抗比色法定量測定有機(jī)磷和無機(jī)磷細(xì)菌的有效磷含量（康慧穎等，2015），采用Salkowski比色法測定菌株IAA含量（Glickmann & Dessaux，1995）。

1.2.3 黑青稞種子處理挑選大小、飽滿度一致的黑青稞種子，先用2%的NaClO溶液將種子消毒20 min，再用70%乙醇消毒30 s，最后取出用無菌水沖洗3次后備用（羅巧芝等，2018）。將消毒后的黑青稞種子分別浸入菌液中，25 ℃吸附2 h，置于無菌操作臺上風(fēng)干后，各取10粒種子播種于直徑90 mm、墊有2層潤濕濾紙的無菌培養(yǎng)皿中，之后將培養(yǎng)皿置于光照培養(yǎng)箱中催芽，（25±1） ℃黑暗培養(yǎng)7 d，每個處理設(shè)3次重復(fù)（安海梅和姚曉華，2017）。以浸泡無菌水的黑青稞種子做陰性對照，以不接菌的蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)液做陽性對照。

1.2.4 樣品采集與測定在培養(yǎng)的過程中，每天記錄黑青稞的生長情況，培養(yǎng)結(jié)束后，選取長勢良好的黑青稞幼苗測量其株高、根長，計數(shù)須根數(shù)，分別稱其植株、須根及全株鮮重，烘干后，稱其干重，記錄重量。

發(fā)芽勢和發(fā)芽率觀察測定：每日觀察并記錄發(fā)芽種子數(shù)，種子發(fā)芽的判斷依據(jù)以種子露白為標(biāo)準(zhǔn)。每天觀察其發(fā)芽情況，缺水時補充無菌水，補充無菌水時要在無菌條件下補充，避免雜菌進(jìn)入感染。按照3 d發(fā)芽勢，7 d發(fā)芽率進(jìn)行發(fā)芽種子數(shù)統(tǒng)計，計算種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率（譚勇等，2019）。計算公式如下：

發(fā)芽勢（%）=（3 d內(nèi)發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子數(shù)）×100;發(fā)芽率（%）=（7 d內(nèi)發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子數(shù)）×100;發(fā)芽指數(shù)（GI）=∑Gt/Dt。

式中：Gt為在t日的發(fā)芽種子數(shù);Dt為表示對應(yīng)的天數(shù)（殷麗麗等，2019）。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

分別采用Excel 2019軟件和DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理。

2結(jié)果與分析

2.1 砂生槐根瘤內(nèi)生菌的初篩與復(fù)篩結(jié)果

由表1可知，菌株R2、R10、R24以及R26產(chǎn)有機(jī)磷菌較高，其中菌株R26產(chǎn)有機(jī)磷高達(dá)135.2 mg·L1，菌株R1、R5、R7、R10、R12以及R21產(chǎn)無機(jī)磷較高，均在100 mg·L1，其中菌株R1產(chǎn)無機(jī)磷高達(dá)128.71 mg·L1。菌株R17、R19、R20、R21、R22、R27產(chǎn)IAA較高，均在40 mg·L1以上，其中菌株R27產(chǎn)IAA最高，高達(dá)55.916 mg·L1。

2.2 不同根瘤菌內(nèi)生菌株對青稞種子萌發(fā)的影響

由表2可知，黑青稞在不同砂生槐根瘤內(nèi)生菌處理下，發(fā)芽率以菌株R7效果為最優(yōu)，菌株R15效果次之（表2）。菌株R4、R6、R7、R17、R18、R19、R20、R21以及R28的發(fā)芽率均達(dá)到了80%，其中R7較CK1（80%）差異顯著（P<0.05），R28較CK1無顯著差異（P>0.05），說明這幾株菌株均促進(jìn)了青稞種子的萌發(fā);菌株R4、R6、R17、R18、R19、R20以及R28的發(fā)芽勢和CK1（80%）相比，分別增加了6.67%、6.67%、20%、20%、20%、13.33%以及6.67%。菌株R4、R7、R17、R18、R21和R28的發(fā)芽指數(shù)均比CK1高，其中R17的發(fā)芽指數(shù)與發(fā)芽指數(shù)變化量最高，分別為9.45和45.38%，表明與CK1對比，經(jīng)這幾株不同菌株菌液處理之后提高了青稞種子活力。

2.3 不同根瘤內(nèi)生菌株對青稞幼苗生長的影響

由表3可知，黑青稞分別接菌不同砂生槐根瘤內(nèi)生菌后，R2、R4、R5、R6、R15、R17、R18、R19、R20、R22和R28處理下植株根長均高于CK1

（8.14 cm），說明在不同處理下促進(jìn)了植株根長，其中R6較CK1顯著高54.55%;R5、R18、R22和R28處理的植株高均高于CK1（11.28 cm），其中R18與CK1間差異顯著（P<0.05），R2、R4、R6、R7、R14、R15、R17、R19、R20和R21處理的株高均顯著低于CK1;14種不同砂生槐根瘤內(nèi)生菌處理下的植株平均須根數(shù)除R15和R21低于CK1（5.3根）外，其余均高于CK1，說明不同砂生槐根瘤內(nèi)生菌處理下促進(jìn)了植株須根的生長，增加了植株須根數(shù)。

2.4 不同根瘤內(nèi)生菌株浸種對青稞干重與鮮重的影響

由表4可知，經(jīng)不同菌株菌液處理對黑青稞全株干重/鮮重均有一定的影響，其中R2、R18、R22和R28的干重/鮮重與CK1（0.65 g/4.77 g）對比顯著差異（P<0.05）;但全株鮮重除R2、R18、R2和R28外均低于CK1（4.77 g），全株干重除R5、R6和R14外，均超過了CK1（0.65 g）。

2.5 接種不同根瘤菌效應(yīng)的綜合評價

將發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、株高、根長、須根數(shù)、根冠比、全株鮮重以及全株干重作為隸屬函數(shù)綜合評價指標(biāo)。表5評價結(jié)果表明，對黑青稞幼苗生長生理促進(jìn)效應(yīng)最為顯著的前5個菌株號為R17、R18、R28、R20、R19，可初步作為促進(jìn)黑青稞生長的優(yōu)良菌株。

3討論與結(jié)論

非豆科植物接種根瘤內(nèi)生菌后，植物幼苗生長生理促進(jìn)效應(yīng)顯著提高。其主要原因如下：（1）根瘤菌提高了非豆科植物對氮和磷等礦質(zhì)元素的吸收率（Kim， 1998; Yanni et al.， 2001）。氮、磷元素是植物重要的營養(yǎng)限制因子，氮、磷添加可以緩解青藏高原高寒草甸植物生長的營養(yǎng)限制，促進(jìn)植物地上部分的生長（楊曉霞等，2014）。（2）感染內(nèi)生菌的植物比未感染內(nèi)生菌的植物具有更強(qiáng)的抗干旱、鹽堿等脅迫能力（石晶盈等，2006）。已感染內(nèi)生菌的植株側(cè)重于根系的生長，而未經(jīng)感染的植株則偏重于地上部分的生長，植株有了發(fā)達(dá)的根系，抗旱能力則會隨之提高（王瑤瑤等，2008）。（3）內(nèi)生根瘤菌能產(chǎn)生調(diào)節(jié)植物生長的吲哚乙酸（IAA）和赤霉素植物激素，從而擴(kuò)大根對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收面積（李龔程等，2015），如草生歐文氏菌 （Erwinia herbicola）在產(chǎn)生生長素吲哚乙酸的同時還能產(chǎn)生細(xì)胞分裂素（cytokinin， CTK），在促進(jìn)細(xì)胞生長的同時也促進(jìn)細(xì)胞的分裂和發(fā)育（Hamayun et al.， 2009）。細(xì)胞分裂素是促進(jìn)植物細(xì)胞分裂的激素，它在根部合成后由根部向莖部運輸，由此調(diào)節(jié)植物地上部的生長（王三根，2000）。在本研究中，黑青稞種子經(jīng)過不同砂生槐根瘤內(nèi)生菌浸種后，黑青稞幼苗的發(fā)芽率、地上部分和地下部分等指標(biāo)與CK1對比均存在顯著差異（P<0.05），表明西藏砂生槐根瘤內(nèi)生細(xì)菌遺傳多樣性豐富，具有良好的促生能力（何建清等，2019）。

發(fā)芽率是評價田間出苗率的指標(biāo)之一，發(fā)芽勢直接影響幼苗出土后的整齊程度，而發(fā)芽指數(shù)反映的是發(fā)芽速率以及發(fā)芽的整齊度，它們都是評價種子萌發(fā)的重要指標(biāo)（白靖怡和劉冬云，2019）。已知內(nèi)生根瘤菌能產(chǎn)生調(diào)節(jié)植物生長的激素，激素能對植物的種子萌發(fā)有比較明顯的促進(jìn)作用，這主要是由于赤霉素的加入改變了種子內(nèi)的激素比例，使處于休眠狀態(tài)的種胚恢復(fù)伸長生長，當(dāng)種胚長度達(dá)到一定程度時，種皮破裂種子萌發(fā)（柴淳等，2010）。接菌后，部分黑青稞種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢與發(fā)芽指數(shù)均有不同程度的提高，說明這一部分砂生槐根瘤內(nèi)生菌對黑青稞種子萌發(fā)具有顯著的促進(jìn)作用。有學(xué)者指出，Kundson早在1922年將固氮細(xì)菌和根瘤桿菌混合接種到卡特蘭（Cattleya labiata）種子上，結(jié)果表明顯著促進(jìn)了種子的萌發(fā)（張萍和宋希強(qiáng)，2012），本研究與前人研究結(jié)果相似。菌株R2、R5、R14與R22對種子萌發(fā)呈抑制狀態(tài)，這也許是因為內(nèi)生菌在侵染宿主的初期或在長期的共存中，外界環(huán)境的改變以及非寄主生物的入侵產(chǎn)生了有毒物質(zhì)或溶解酶（方珍娟等，2012），從而抑制其生長。至于根瘤內(nèi)生菌對非豆科植物青稞的促生機(jī)制為何，有待進(jìn)一步研究。

根系是植物吸收水分和養(yǎng)分的主要器官，接種根瘤菌促進(jìn)了根系生長和根系對養(yǎng)分及水分的吸收利用（段如雁等，2018）。從本研究中可以看出，黑青稞種子經(jīng)過浸種處理后，大部分植株的根長明顯大于CK1，所以根的表面積和纖維結(jié)構(gòu)也就增大了，因此提高了根在土壤中，尤其是在貧瘠的土壤中對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。此外，前人研究發(fā)現(xiàn)，有許多根瘤菌在非豆科植物 （如水稻、油菜、小麥及棉花等） 的根圈和根際具有較強(qiáng)的定殖能力，并且對植物根系及地上部分的生長有良好的促進(jìn)作用 （張曉霞等，2003; Baset & Shamsuddin，2010;馬天瑞和藍(lán)祖慶，2010;王平等，2019）。內(nèi)生菌能夠產(chǎn)生或促進(jìn)宿主植物產(chǎn)生某些植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，包括植物生長素、赤霉素以及細(xì)胞激動素等，此類生長激素直接影響了侵染植株體內(nèi)的物質(zhì)代謝，與宿主植物互利共生，促進(jìn)了植株對礦物質(zhì)和其它營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，提高了植物的資源利用效率，因此能夠直接促進(jìn)植株的生長（宋薇薇等，2018）。本研究結(jié)果表明，接菌后，根瘤內(nèi)生菌對部分黑青稞植株的株高、根長與植株全株的干重/鮮重較CK1都具有顯著的促進(jìn)作用，這與陳明等（1999）的研究結(jié)果基本一致，經(jīng)A1501與A1513菌處理過的水稻植株，其株高及秸稈干重顯著高于CK1。

黑青稞與根瘤內(nèi)生菌共生關(guān)系的建立是菌株、宿主植物與環(huán)境三方相互作用的結(jié)果，而不僅僅是菌株與宿主植物之間的互作。在本研究中，相同條件下，分別使用不同砂生槐根瘤內(nèi)生菌浸泡黑青稞種子，雖然大部分黑青稞的生物量均有所增長，但是還有小部分黑青稞并未獲得同樣的接種效果，說明根瘤內(nèi)生菌與宿主植物之間的共生匹配關(guān)系存在差異。在根瘤菌-宿主植物共生固氮的體系中，不僅要選擇合適的菌株，還需要綜合考慮宿主菌株與環(huán)境的相互關(guān)系，這樣才有利于充分發(fā)揮共生固氮的作用，促進(jìn)宿主植物的生長。本研究所采集的砂生槐根瘤內(nèi)生菌均來自西藏，西藏地形地貌和氣候環(huán)境復(fù)雜，雖然寄主植物都是來自同一地區(qū)，但是不同區(qū)域的砂生槐根瘤內(nèi)生菌各自有其適合生長的環(huán)境條件，宿主植物需要與適應(yīng)當(dāng)?shù)丨h(huán)境的根瘤內(nèi)生菌種建立共生關(guān)系，才能表現(xiàn)出最佳效果。因此，即使在相同條件下接種根瘤內(nèi)生菌，產(chǎn)生的效果也會不一致。所以本研究中篩選出的高效根瘤內(nèi)生菌與黑青稞共生體系，不僅要做到適地適菌，而且要做到適苗適菌。此外，本研究采用培養(yǎng)基來作為種子萌發(fā)的基質(zhì)，黑青稞與砂生槐根瘤內(nèi)生菌的共生環(huán)境比較單一，所以篩選的5株優(yōu)良菌株在土壤基質(zhì)中對黑青稞是否能夠產(chǎn)生相同的促生效應(yīng)，有待于進(jìn)一步深入研究。

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（責(zé)任編輯蔣巧媛）