靳 燕,邱 瑩,董 志,邸琰茗,趙棟梁,郭逍宇*（.首都師范大學資源環(huán)境與旅游學院,北京 00048；.北京大學生命科學學院,北京 0087；.北京市北運河管理處,北京 000）

浮游細菌是水生生態(tài)系統(tǒng)的基本組成部分,具有極高的遺傳多樣性,并在生物地球化學循環(huán)中發(fā)揮重要作用[1].作為浮游細菌群落結(jié)構多樣性構建的兩個基本競爭過程,環(huán)境選擇和擴散過程對浮游細菌在空間變化的貢獻率隨研究尺度的變化,結(jié)論有所差異[2-6].受水流持續(xù)擴散和污染物源匯動力學同質(zhì)化效應影響,擴散作用在較小地理尺度下的自然流動河流中占主導.在高度人工化的水生態(tài)系統(tǒng)中,再生水通過補給口與上游來水匯流,形成小尺度地理空間上明顯的環(huán)境梯度,物種分類作用增強[7].再生水污水處理廠受納水體微生物群落和多樣性的空間變異已成為熱點研究主題[7-8].

環(huán)境選擇作用導致浮游細菌群落中復雜共存的物種間存在互惠、共生、競爭等關系[9-10],隨機擴散運動進一步影響物種對特有生境的占有頻率[11].二者綜合作用,群落中具有較高競爭能力、生態(tài)幅度較寬、適應多樣生境的物種成為共有核心微生物類群,而具有較強抗逆能力的物種則適應特定的生境類型,成為群落中的特有微生物類群[12-14].集合群落的提出為更好的理解區(qū)域尺度范圍內(nèi)的微生物群落組成及其結(jié)構動態(tài)變化提供了強有力的方法.Jack & Master生態(tài)策略假說認為:共有的核心微生物類群在脅迫環(huán)境和有利環(huán)境下都具有較強的表型可塑性,最終在區(qū)域和本底尺度下均表現(xiàn)為較高的豐度和頻度.Pandit等[12]發(fā)現(xiàn)巖石池中環(huán)核心微生物類群變異主要由擴散作用主導,而特有微生物類群變異則主要受環(huán)境選擇的作用.Sriswasdi等[15]研究顯示共有核心微生物類群物種形成率是特有微生物類群的19倍,在維持分類學多樣性和系統(tǒng)發(fā)育多樣性方面發(fā)揮著關鍵作用.Graham等[16]提出擴散和選擇作用在多樣性構建過程中的相對貢獻率對群落生物地化循環(huán)功能具有較大影響,高度的擴散速率增加與本地群落中不具有高度適應性的類群比例,從而導致本地群落生物地球化學功能多樣性降低.Chen等[17]研究表明在金沙江梯級水庫空間和環(huán)境因素共同支配著核心和特有分類群的組裝和生物地理學,環(huán)境因素對核心豐富群落解釋度更高.Cao等[18]發(fā)現(xiàn)環(huán)境因素和地理距離在控制兩個連通湖泊區(qū)的特有及核心亞群落中起著關鍵作用.但在環(huán)境主導的浮游微生物群落中,具有不同擴散能力和不同生物相互作用模式的共有核心微生物類群是否與特有微生物類群具有相同的環(huán)境選擇模式未受到關注.基于集合從群落分析再生水污水處理廠受納水體不同局域群落的空間變化機制尚未見報道.基于此,本文擬探討高度人工化的再生水補給河道核心浮游細菌類群和特有浮游細菌類群空間變異的環(huán)境解釋,為揭示高度人工化的再生水補給河道浮游細菌在污染脅迫下群落變化的機制提供科學依據(jù).

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域概況

北運河源于北京市昌平區(qū)及海淀區(qū)一帶,后向東南流入通州區(qū),流經(jīng)河北,在天津市匯入海河,全長 260km.流域總面積為 6166km2,其中,山區(qū)面積952km2,平原面積 5214km2.研究區(qū)多年平均降雨量 643mm,降雨主要集中在 6～9月,約占全年的84%[19].作為京杭大運河的重要組成部分,北運河主要流經(jīng)城市化水平高且人口、產(chǎn)業(yè)密集的北京、天津,是海河流域骨干行洪排澇河道之一[19].北運河流域土地利用類型和污染源差異導致河流地理空間尺度上存在潛在環(huán)境梯度,其次,上、中游密布71座再生水處理廠以排污口形式補給河道,形成小尺度環(huán)境梯度.其中,上游流經(jīng)北京城區(qū),93%的水源來源于城市人口消耗的經(jīng)處理廢水,4%是未經(jīng)處理的廢水;位于京津之間的中游地區(qū)主要流經(jīng)農(nóng)田,農(nóng)業(yè)化肥和農(nóng)藥污染是中游地區(qū)主要的污染物;下游地區(qū)進入天津地區(qū),接受來自天津經(jīng)處理和未處理的廢水[20].由于地處平原地區(qū),水流流速緩慢致使水流中裹挾的濁物逐步沉淀,最終導致河道淤積嚴重[21].

1.2 采樣點的布設和樣品采集

因非汛期北運河河道斷流頻繁,水體流通性較差,且汛期濕地植物水質(zhì)凈化特征和非點源污染特征均較為典型.因而,于2019年 9月 3～4日在北運河京津冀段結(jié)合周邊土地利用類型和均勻布點的基本原則設置樣點15個,如圖 1所示.每個采樣點采集平行的 2L混合均勻的水樣 2個,冰袋低溫保存并快運回實驗室.同時,通過全球定位系統(tǒng)（GPS,Garmin Legend,Garmin USA）定位每個樣點的坐標,并采用多參數(shù)水質(zhì)探測儀（AP-7000）測定 pH值、溶解性總固體（TDS）、溫度（T）、氧化還原電位（ORP）、電導率（EC）、濁度（Turbidity）.帶回室內(nèi)的水樣,定量1L水樣充分搖勻（0.25L）通過0.22mm混合纖維素膜過濾,濾膜密封于-80℃保存用于微生物測定.

圖1 北運河樣點分布Fig.1 Sampling locations in the North Canal River

1.3 水質(zhì)理化分析

帶回室內(nèi)的水質(zhì) 24h內(nèi)完成水質(zhì)理化分析.水中高錳酸鹽指數(shù)（CODMn）采用滴定法測定;氨氮（NH4+-N）采用納氏試劑分光光度法測定;硝酸鹽氮（NO3--N）采用紫外分光光度法測定;亞硝酸鹽氮（NO2--N）采用N-（1-萘基）-乙二胺分光光度法測定;總氮（TN）采用過硫酸鉀消解紫外分光光度法測定;總磷（TP）采用鉬酸鹽分光光度法測定;總有機碳（TOC）和總碳（TC）采用 TOC 測定儀測定,陰陽離子（Na+、NH4+、K+、Mg2+、Ca2+、Cl-、NO3-、SO42-）采用離子色譜儀測定.

1.4 微生物高通量測序

將已采集好的濾膜送至諾禾致源科技有限公司進行高通量測序分析.擴增引物采用（CCTAYGGGRBGCASCAG,GGACTACNNGGGTATCTAAT）,擴增16S rRNA基因V3-V4區(qū).

1.5 數(shù)據(jù)預處理與分析

將測序得到的分類操作單元（Operational Taxonomic Unit,OTU）序列按 97%的序列相似度對有效序列進行比對,對 OTU序列進行聚類,同時去除僅出現(xiàn)一次的 OTU以消除假陽性影響,樣點均出現(xiàn)的 OTU定義為核心 OTUs（538OTUs）,各樣點出現(xiàn)頻率＜40%的 OTU定義為特有 OTUs（439OTUs）.利用 Primer 5進行聚類分析和非度量多維尺度分析（NMDS）.基于 Galaxy微生物數(shù)據(jù)分析平臺計算α多樣性指數(shù)（Shannon指數(shù)、Chao指數(shù)、Simpson指數(shù)、Pielou指數(shù)）,利用Origin 2017繪制箱圖.利用 Canoco 5.0進行典范對應分析（CCA）.利用 SPSS 24進行非參數(shù)檢驗（Kruskal-Wallis test）和主成分分析（PCA）.

2 結(jié)果與討論

2.1 京津冀北運河水環(huán)境理化指標分析

2.1.1 水環(huán)境理化指標的統(tǒng)計特征分析 京津冀北運河段各采樣點水質(zhì)參數(shù)的描述統(tǒng)計見表1.將水質(zhì)理化指標與對應的地表水環(huán)境質(zhì)量標準對比后可知,北運河京津冀段 TN均值（3.82mg/L）高于地表水Ⅴ類標準 1.96倍,是北運河應重點加以控制的主要因子;其次,水質(zhì) pH值均值為 8.97,接近于地表水Ⅴ類標準 6～9的上限值,最高值高達 9.48,表明北運河京津冀段水質(zhì)呈現(xiàn)堿性,需重點加以監(jiān)測控制.結(jié)合各陽離子均值看,Na+＞Mg2+＞Ca2+＞K+,而陰離子均值則呈現(xiàn) Cl-＞SO42-＞NO3-,典型再生水消毒過程導致北運河河道水質(zhì)以 Na+和 Cl-污染為主,及其誘發(fā)的二次有機污染是再生水河道需要重點關注的另一關鍵因子.結(jié)合變異系數(shù)可知,NO3--N、SO42-和 Cl-變異系數(shù)分別高達 104.74%、111.52%和 110.36%,表明這三個指標具有極強的空間變異性,NH4+-N、NO2--N 和 K+變異系數(shù)均大于 75%,屬于強變異,表明其離散程度較高,空間分布不均勻.

表1 水質(zhì)指標的統(tǒng)計特征及水環(huán)境質(zhì)量標準Table 1 Summary statistics of measured parameters and the national standards for surface water quality

2.1.2 水環(huán)境理化指標的主成分分析 水質(zhì)理化指標的主成分分析共提取了 5個旋轉(zhuǎn)因子（VF）,累計解釋水質(zhì)變異 90.23%（表 2）.VF1（方差貢獻率為37.22%）與 TN、NO3--N、K+、Ca2+、Na+、Mg2+正相關,表征了再生水補給河道中具有典型再生水水質(zhì)特征的無機氮和鈣、鎂鹽離子污染.VF2（方差貢獻率為24.84%）與T、pH值、TDS、濁度、高錳酸鹽指數(shù)、TP、TOC、TC、Cl－、SO42-正相關,主要表征再生水補給口物理擾動對水文水質(zhì)的間接影響.再生水的匯入改變河道水溫和酸堿度,并通過再生水補給口水流擾動導致表層底泥懸浮,間接改變水體中濁度和溶解氧,進而改變水質(zhì)高錳酸鹽指數(shù)含量.VF3（方差貢獻率為 11.76%）和 VF4（方差貢獻率為 9.14%）分別與 NH4+-N、NO2--N正相關.再生水中NH4+-N和NO2--N不穩(wěn)定,短暫存在后轉(zhuǎn)化為較為穩(wěn)定的NO3--N.VF5（方差貢獻率為7.27%）與ORP正相關,再生水匯入引起溫度、pH值以及水力學變化,引起表層底泥擾動改變高錳酸鹽指數(shù),進而改變ORP.

表2 水質(zhì)指標主成分分析結(jié)果Table 2 Principal component analysis of water quality index

2.2 核心OTUs和特有OTUs局域群落空間變化模式

基于高通量測序的微生物數(shù)據(jù)經(jīng)過預處理之后,采用 Primer 進行聚類分析,聚類結(jié)果如圖 2所示.從圖可以看出,不同類型OTUs類型的局域群落結(jié)構在空間上均發(fā)生較明顯的變化,但其空間分布格局模式存在較大差異.以相似性為63%為標準,核心OTUs和特有OTUs局域群落均被劃分為兩大類.核心OTUs局域群落類型的第一類包含:樣點1～11,第二類包含:樣點 12～15,核心 OTUs的局域群落聚類結(jié)果與地理空間分布格局具有高度一致性.特有OTUs局域群落類型的第一類包含:樣點1,3,5,7,8,9,11,13,14,15;第二類包含:樣點 2,4,6,10,12;特有OTUs的局域群落聚類結(jié)果完全有別于地理空間距離模式.其次,以相似性為25%為標準對不同類型的 OTUs局域群落類型分類結(jié)構可以看出,特有OTUs局域群落具有更多的群落類型,即核心OTUs局域群落結(jié)構的相似性明顯高于特有 OTUs局域群落結(jié)構.

圖2 基于高通量測序的核心OTUs和特有OTUs局域群落結(jié)構聚類分析Fig.2 Dendrogram of hierarchical cluster analysis of bacterioplankton communities based on the high-throughput sequencing

由NMDS結(jié)果（圖3）可知,核心OTUs局域群落隨地理距離的變化,群落類型間存在明顯差異（Stress=0.11,Global R=0.887,P=0.001）.特有 OTUs局域群落分類模式與地理空間分布模式無關,基于聚類的不同類群間差異顯著（Stress=0.21,Global R=0.473,P=0.003）.其次,基于聚類的核心 OTUs排序圖中表現(xiàn)為類內(nèi)樣點間分布集中,類間樣點間具有清晰的分布界限和范圍,特有 OTUs排序圖中類內(nèi)樣點間具有更廣泛的分布格局和范圍,類間分布界線較弱的特點,從而進一步驗證了核心 OTUs局域群落結(jié)構的相似性明顯高于特有OTUs局域群落結(jié)構這一結(jié)論.

圖3 基于NMDS的核心OTUs和特有OTUs局域群落排序Fig.3 NMDS sequence diagram of the core OTUs and unique OTUs local community

圖4 基于核心OTUs和特有OTUs局域群落多樣性指數(shù)Fig.4 Boxplots of the core OTUs and unique OTUs local community alpha diversity indexes

本研究中高度人工化的北運河浮游集合群落中,核心OTUs和特有OTUs兩個局域群落物種個體遷移能力存在顯著差異是導致二者地理分布模式存在顯著差異的主要原因.一方面核心OTUs局域群落中 OTUs片段的豐度顯著高于特有 OTUs局域群落中的OTUs片段豐度,較高的片段豐度具有更高的個體擴散概率[11],從而使得核心OTUs局域群落具有顯著的地理空間分布模式.另一方面,核心 OTUs局域群落中較高擴散概率促進其具有更高的生境頻率[12,14,22],從而在污染物源匯動力學同質(zhì)化效應影響下進一步正反饋調(diào)節(jié)核心 OTUs局域群落較特有OTUs局域群落具有更高的生境頻率[7].反之,特有OTUs局域群落分類模式與地理空間分布模式無關,并表現(xiàn)為排污口尺度的變異規(guī)律,究其原因一方面與特有OTUs片段豐度較低,個體數(shù)不易擴散有關,另一方面,具有較低擴散能力的OTUs片段對源匯動力學同質(zhì)化效應敏感性較低,北運河河道人工閘壩的存在進一步限制了浮游細菌的擴散能力,尤其是限制特有OTUs局域群落的擴散.

2.3 核心OTUs和特有OTUs局域群落空間變化的環(huán)境解釋

北運河15個采樣點兩大類在CCA軸上得到了很好的分化（圖5）.基于核心OTUs聚類的第1類和第2類樣點沿x軸從左到右的變化趨勢.這種變化趨勢與北運河水系地理空間距離的變化趨勢一致,同時能夠很好地表征再生水補給對河道水的空間差異性的影響.與群落分布相關程度最高的環(huán)境因子是 TN、NO3--N、K+、Ca2+、Na+、Mg2+.已有大量文獻證明再生水中富含 Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cl-、TDS等鹽分離子和 TN、NO3--N等多形態(tài)無機氮[8,23-27].北運河北京段（上游和部分中游樣點）密布再生水補給口,在上、中游集中補給后隨徑流徑向漸變匯入下游海河（部分中游和下游樣點）的過程中水中浮游微生物對再生水的凈化主要體現(xiàn)在無機氮和鹽分離子的降解轉(zhuǎn)化.與群落分布具有較高相關程度的環(huán)境因子還包含了高錳酸鹽指數(shù)和濁度,表征再生水補給對河道水力學特征的空間差異性的影響.城市河道水流緩慢導致沉積物大量淤積,而污染物質(zhì)的沉降、吸附使得沉積物成為內(nèi)源污染源[28].再生水匯入影響河流水動力條件,引起流量、流速變化[8].上中游頻繁的再生水補給過程擾動河道底部含有大量污染物底泥,使表層污泥中的污染物向上覆水體釋放[29],引起河道水體濁度增加.同時,富含豐富有機成分的底泥顆粒使得上中游高錳酸鹽指數(shù)顯著高于下游.作為再生水水質(zhì)特性中的另外一類關鍵環(huán)境因子,氨氮與亞硝酸鹽氮受氧化還原環(huán)境的限制,在水中存在形態(tài)不穩(wěn)定[30-32],因而與群落分布相關程度較低,但與 x具有密切的關系.基于特有OTUs聚類的第1類和第2類樣點沿y軸主導的對角線方向上從左下到右上的變化趨勢.與 y軸相關性最高的環(huán)境因子為溫度、氧化還原電位.其次,pH值與對角線的變化趨勢較為一致.表明這三個環(huán)境因子與特有 OTUs群落分類具有密切的關系.取樣點2,4,6,10,12靠近再生水補給口是導致第二類群落樣點溫度顯著高于第一類群的直接原因,溫度對水體的氧化還原體系有較大影響[33-34],影響水中不穩(wěn)定變價元素進而進一步反饋促進氧化還原體系空間變異.再生水富含的無機氮磷和鹽分離子與 y軸負半軸具有較小的夾角,表征該類環(huán)境因僅影響第二類群群落內(nèi)部空間變異.

圖5 再生水補水河道采樣點核心OTUs和特有OTUs局域群落與環(huán)境因子的排序Fig.5 Sequence diagram of the sample point of the core OTUs and unique OTUs local community and environmental factors on Reclaimed water in river

進一步結(jié)合 Kruskal-Wallis檢驗分析核心OTUs和特有OTUs局域群落內(nèi)類間顯著差異性環(huán)境因子.核心OTUs局域群落篩選出TDS、Turbidity、高錳酸鹽指數(shù)、硝酸鹽氮、TN、TOC、TC、Na+、K+、Mg2+、Ca2+等 11個環(huán)境因子,這些因子在核心OTUs第1類和第2類樣點間具有顯著差異（P＜0.05）,并呈下降趨勢（表3）;特有OTUs局域群落篩選出T.類間顯著差異性環(huán)境因子篩選結(jié)果與 CCA排序結(jié)果一致,且CCA排序較Kruskal-Wallis檢驗對類間差異性更為敏感.

表3 Kruskal-Wallis檢驗具有顯著差異的水質(zhì)指標的統(tǒng)計特征Table 3 Kruskal-Wallis test of environmental variables

2.4 核心OTUs和特有OTUs局域群落環(huán)境選擇模式差異機制

與核心OTUs群落顯著的地理分布模式具有較高相關程度的環(huán)境因子分別是TN、NO3--N、K+、Ca2+、Na+、Mg2+,這些不同形態(tài)的氮素和鹽分離子不僅隨水流方向呈現(xiàn)顯著下降趨勢,同時與地理擴散距離表現(xiàn)出較強的協(xié)同變化規(guī)律.以 TN、NO3--N、K+、Ca2+、Na+、Mg2+主導的環(huán)境選擇和地理擴散共同作用形成核心OTUs局域群落典型地理空間分布模式.同時表征核心 OTUs局域群落中物種具為寬廣的生態(tài)幅度,是能適應北運河上、中、下游不同污染特征、不同水力學特征、不同生境特征條件下的具有較高生境頻度的廣布種.特有OTUs局域群落不具有顯著的地理空間分布模式,表明其空間分布格局主要受環(huán)境因素主導.主導特有OTUs群落空間變異的主要環(huán)境因子為 T,其次為 ORP和pH值.再生水處理廠較高水溫和 pH值出水對水體浮游細菌類群形成溫度選擇壓力,進而對浮游細菌群落產(chǎn)生強烈溫度和酸堿度選擇作用.其次,再生水補給口較強的水力學特征影響河道底泥顆粒物的二次沉降,顆粒物及其富含的有機物質(zhì)導致出水口氧化還原點位有別于其他樣點,進而對浮游細菌群落產(chǎn)生二次選擇作用.結(jié)合水環(huán)境因子主成分源解析表明 TN、NO3--N、K+、Ca2+、Na+、Mg2+與 T和pH值不具有相似的空間變化規(guī)律,表征這兩類環(huán)境因子不同源,從而間接證明了核心 OTUs局域群落和特有OTUs局域群落空間變化具有不同的環(huán)境驅(qū)動模式.

3 結(jié)論

3.1 基于水環(huán)境理化指標的主成分分析的污染源源解析結(jié)果表明再生水補給帶來的TN、NO3--N等無機氮和 K+、Ca2+、Na+、Mg2+鹽離子污染是主要污染源,同時再生水匯入引起溫度、pH值以及水力學變化,引起表層底泥擾動改變高錳酸鹽指數(shù),進而改變 ORP,是再生水補給口物理擾動對水文水質(zhì)產(chǎn)生間接影響形成的有機污染污染源.

3.2 核心OTUs局域群落和特有OTUs局域群落具有不同的空間變化規(guī)律.較高的片段豐度、豐富度和污染物源匯動力學同質(zhì)化效應共同作用促進核心OTUs具有較強擴散能力,并與地理空間分布格局高度一致.較低的片段豐度限制特有 OTUs擴散能力,從而導致特有OTUs局域群落空間分布模式表現(xiàn)為與距離排污口遠近有關的排污口尺度變異.

3.3 核心OTUs局域群落和特有OTUs局域群落空間變化具有不同的環(huán)境驅(qū)動模式.核心 OTUs局域群落空間分布相關程度最高的環(huán)境因子是 TN、NO3--N、K+、Ca2+、Na+、Mg2+,隨水流方向顯著下降并與地理擴散距離協(xié)同變化.特有 OTUs局域群落相關程度最高的環(huán)境因子為溫度、氧化還原電位和pH值.空間分布格局主要受再生水補給口水力學特征影響所致.