蔣 晨，李 霞，史康妍，趙保才，周子成，趙洪喜

(1.寧夏大學農(nóng)學院，寧夏銀川 750021)

環(huán)形泰勒蟲病(Annular theileriasis)，又稱為地中岸熱或者熱帶泰勒蟲病，是以蜱為媒介的頂復門、梨形蟲綱、泰勒蟲科、泰勒蟲屬的環(huán)形泰勒蟲(T.annulata)寄生于動物的單核巨噬系統(tǒng)細胞及紅細胞而引起的血液原蟲病[1]。本病的主要臨床癥狀和病理變化是高熱稽留、貧血、體表(全身性)淋巴結(jié)腫大、全身性出血、消瘦、發(fā)熱、血小板減少、白細胞減少、肺水腫和胸腔積液，腎臟外膜易剝離。第三胃內(nèi)容物干燥，第四胃黏膜腫脹，其邊緣隆起，中間凹，呈現(xiàn)灰色，潰瘍面積約占80%[2-3]。該病通常是由寄生蟲的子孢子在進食過程中從蜱的唾液腺中釋放出來，侵入并在牛淋巴細胞中建立感染[4]。在感染期間，白介素1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)mRNA的表達上調(diào)，一氧化氮(NO)的產(chǎn)生增加，從而導致牛單核細胞的分子和功能表型改變[5]。本病在世界范圍內(nèi)分布，全球每年大約有2.5億頭牛受到本病的威脅，造成的損失大約8億美元，被世界動物性組織(OIE)列為必須報告的動物疫病，我國將其列為二類動物疫病。目前對本病的治療沒有特效藥物，主要以預防為主，診斷方法包括顯微鏡觀察法、血清學和分子生物學診斷法，但是沒有一種方法可以準確地診斷和防治[6]。

目前正在研究的免疫抗原主要有子孢子表面抗原、裂殖子表面抗原、裂殖體表面抗原和熱休克蛋白等，這些表面抗原具有良好的免疫原性和生理功能，具有藥物和疫苗的開發(fā)潛力，可以作為藥物和疫苗的候選位點，為本病的防治提供新的方法和途徑。

1 子孢子表面抗原蛋白

子孢子表面抗原蛋白是環(huán)形泰勒蟲在子孢子階段分泌的一種膜蛋白，高度保守又具有良好的免疫原性，可以作為藥物和疫苗的候選抗原。對于子孢子表面蛋白SPAG-1和p67都具有很好的抗原性，SPAG-1的抗原性可能是發(fā)生在C端的16個殘基，這16個殘基可能需要一些表位來激活才具有抗原性，而p67的抗原部分可能包括SPAG-1 C端部分，所以單獨使用也可以產(chǎn)生保護力。Darghouth M等[7]用重組全長SPAG-1 His標簽蛋白和減毒的裂殖體去誘導同源和異源的子孢子攻擊，結(jié)果表明，兩者都可以提供部分保護，而且兩者組合使用可提供最佳保護作用，這可能是C端16個殘基不能被子孢子所識別，無法感染子孢子，所以SPAG-1和減毒細胞系都是潛在的亞單位疫苗。

Kaba S等[8]用p67的結(jié)構(gòu)域與綠色熒光蛋白(GFP)的羧基末端融合表達，融合表達的p67蛋白其穩(wěn)定性和表達能力都獲得了增強，單克隆抗體的表位也變得比較保守，使其更接近天然的p67蛋白構(gòu)象，對p67蛋白進行純化免疫可以產(chǎn)生部分保護力，推測這種保護力可能是p67部分區(qū)域發(fā)揮的作用，這和Tebaldi G等[9]研究結(jié)果相同，其在分別表達全長p67抗原和截短的p67抗原，發(fā)現(xiàn)這兩種形式的重組p67與抗p67分子發(fā)生單克隆反應，該抗體可以與天然的子孢子反應，在山羊和牛中具有免疫原性。Lacasta A等[10]發(fā)現(xiàn)p67(p67C)的C端部分與ISA206VG佐劑3種劑量在群體水平上的保護作用(46%)與單獨使用p67蛋白的保護作用相似，而且p67C體積小，蛋白質(zhì)穩(wěn)定，表達產(chǎn)量高，抗體效價高，可以刺激CD4+T細胞增殖，推測p67C是潛在的亞單位疫苗。Nyagwange J等[11]對篩選出來的4種潛在的疫苗候選者進行體外中和子孢子感染，發(fā)現(xiàn)p13的中和能力比gp34蛋白和p104蛋白都強，可以產(chǎn)生最強子孢子中和活性抗體，在宿主-寄生蟲中發(fā)揮作用，對這些抗原抗體進行測試，確認了其作為候選抗原疫苗的作用。子孢子表面抗原蛋白SPAG-1的C端和p67的結(jié)構(gòu)域都有較好的免疫原性，而且這兩種蛋白又具有同源性，氨基酸相似序列高達54%，與宿主細胞的識別和侵襲有關(guān)，推測其可能有相同的部分起到相同的保護作用，如Tebaldi G表達的p67蛋白可以刺激淋巴細胞增殖，間接提高機體的抵抗力，從而達到防護作用，為以后藥物和疫苗的研究提供基礎。

2 裂殖體表面蛋白

裂殖體表面蛋白是環(huán)形泰勒蟲在生長發(fā)育階段分泌的一種膜內(nèi)蛋白，具有良好的免疫原性，基因序列非常保守，適合用來診斷環(huán)形泰勒蟲病。這些抗原性的蛋白在被合成后應該在胞內(nèi)被其它物質(zhì)相互連接在一起激活具有蛋白活性后才能有更多抗原位點以至于有很好的抗原性。Silatsa B等[12]首次在沒有蜱媒介的喀麥隆使用p104 PCR從牛血液樣本中篩選出陽性，對p104進行基因分析，存在的Tp1 CD8表位與Muguga Cocktail ITM疫苗的Tp1 CD8表位相同，這可能是人為介導ITM活疫苗的動物運動導致的。Salih D等[13]證實了這一推測，在蘇丹的牛群中確定了CD8+T細胞識別的抗原Tp1和Tp2之間的序列多樣性，分別產(chǎn)生4和14個抗原變體，而這些抗原變體的多數(shù)等位基因與活疫苗混合物中Muguga成分相似，由此可見這確實是人為導致的結(jié)果。Svitek N等[14]研究CD8+T細胞識別的Tp1抗原的保護作用，發(fā)現(xiàn)Tp1可以刺激CD8+T細胞增殖和CTL產(chǎn)生特異性應答，抵御部分保護作用，這種保護作用可能是p104發(fā)揮的作用。Huber S等[15]用共免疫沉淀技術(shù)研究微管蛋白CLASP1與裂殖體膜蛋白p104的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)兩者是通過EB1間接鏈接的，CLASP1與EB1是通過崁入MT結(jié)合域中的兩個SxIP基序介導的，p104是與崁入富含脯氨酸的C末端結(jié)構(gòu)域中的SxIP模體與宿主細胞的EB1相互作用的，二者間接連接，共同定位到裂殖體邊表面，與蛋白質(zhì)的編碼和維持轉(zhuǎn)化表型有關(guān)。Huber S等[16]以CLASP1為誘餌，使用BioID、熒光顯微鏡和免疫共沉淀技術(shù)，鑒定了微管和SH3結(jié)構(gòu)域相互作用的蛋白TaMISHIP，該蛋白定位于裂殖體表面，包含2個EB1結(jié)合SxIP基序，3個推定的SH3結(jié)合Px(P/A)xPR基序，2個核定位和核輸出信號組成的區(qū)域，Px(P/A)xPA基序負責將CD2AP募集到裂殖體表面，使TaMISHIP蛋白和CD2AP發(fā)生特異性作用。CD2AP與CIN85序列和結(jié)構(gòu)相似，其結(jié)合配偶體參與胞質(zhì)分裂、信號轉(zhuǎn)導、小泡運輸?shù)?。CIN85可以將受體信號連接NF-κB途徑，使IκB和JNK1磷酸化水平降低，IKK復合物的體外激酶活性受損，從而導致NF-κB抑制劑的降解和NF-κB途徑的激活。CD2AP可以與抑癌蛋白p53結(jié)合，將信號分子募集到裂殖體表面來促進泰勒蟲誘導的轉(zhuǎn)化。

Alhosary A等[17]以Tams-1 PCR為對照來評估TASP蛋白商業(yè)ELISA試劑盒的可靠性，與PCR數(shù)據(jù)相比，試劑盒靈敏度為91.25%，特異性為78.4%，兩者的結(jié)果有良好的相關(guān)性，是檢測慢性和攜帶動物寄生蟲抗體的較好工具。Ulrike Ssitzer等研究發(fā)現(xiàn)，裂殖體表面蛋白TASP被3個膜結(jié)構(gòu)域分成大段、小段、N端和C端，大段中包含蛋白質(zhì)的多態(tài)性區(qū)域可以刺激宿主細胞產(chǎn)生TASP抗體，推測TASP有意義的抗原部分可能是在被切開的大段部分，就如Sadr N等[18]研究發(fā)現(xiàn)這部分多態(tài)性在種間和種內(nèi)都可以檢測到，Tasp基因序列有90%～94%的同一性和68%～94%的氨基酸同源性，而且不同特征的TASP蛋白有些區(qū)域相同，說明TASP多態(tài)性區(qū)域非常保守，在宿主細胞中可以產(chǎn)生很強的免疫應答，這部分免疫應答可能是由多態(tài)性區(qū)域或者某些相同區(qū)域翻譯的蛋白質(zhì)所刺激，我們可以通過重組這些區(qū)域蛋白刺激宿主產(chǎn)生抗體，有助于重組蛋白疫苗和診斷產(chǎn)品的開發(fā)。Bilgic H等[19]通過生物信息學鑒定了編碼預測抗原基因，挖掘出免疫顯性抗原基因，并且用TASP蛋白建立一種ELISA方法，結(jié)果表明TASP蛋白的表現(xiàn)最好。Aquil M等[20]以重組的TASP為抗原，用DOT-ELISA方法檢測樣品血清中的特異性抗體，結(jié)果表明TASP蛋白的敏感性和特異性為95.8%和80%，說明抗體滴度和免疫效價都非常高，免疫原性非常好，可成為檢測環(huán)形泰勒蟲病的一種方法。

糖基磷脂酰肌醇(GPI)抗體可以在寄生蟲入侵方面有保護作用，糖基磷脂酰肌醇(GPI)誘導的促炎性細胞因子TNF-α和IL-6可以促成疾病的發(fā)病機理，通過中和GPI的刺激活性來提供針對機體的保護。Mbengue B等[21]在攜帶高寄生蟲血癥的個體中測出高水平的GPI抗體，并且糖基磷脂酰肌醇的炎性細胞因子和體液反應與寄生蟲病免疫力和發(fā)病機理相關(guān)。Abbasnia A等[22]通過高效液相色譜從純化的裂殖體中分離出GPI，并通過ELISA測定抗GPI抗體，結(jié)果表明，自然感染和接種動物血清中存在高含量抗GPI抗體。GPI蛋白在寄生蟲-宿主細胞相互作用中起重要作用，有很好的免疫原性，可以誘導促炎性因子TNF-α的釋放和抗體反應，與宿主免疫應答的產(chǎn)生有關(guān)，可以用作開發(fā)疫苗和GPI療法。不過在用裂殖體制作減毒疫苗時，隨著長期傳代培養(yǎng)會導致基因型的喪失，降低寄生蟲的多樣性，從而達不到保護作用，所以需要增強多樣性來對當前疫苗進行修飾，加強保護作用[23-24]。

3 裂殖子表面蛋白

裂殖子表面蛋白是環(huán)形泰勒蟲在進入紅細胞時分泌的一種膜蛋白，具有很好的免疫原性，基因序列非常保守，Lempereur L等[25]對環(huán)形泰勒蟲具有傳輸阻斷反應的編碼抗原寄生蟲基因進行篩選，發(fā)現(xiàn)Tams1等位基因顯示有最高的dN / dS比，具有6個顯著的陽性選擇位點，表面抗原的不同表位具有高度依賴性并且蛋白質(zhì)穩(wěn)定，適合做疫苗的候選抗原。Abakeri A等[26]使用3種方法對蘇丹尼亞拉地區(qū)162頭奶牛進行環(huán)形泰勒蟲的檢測，發(fā)現(xiàn)Tams1聚合酶鏈反應陽性率最高，準確率高，與Tams1蛋白多陽性位點相對應。Roy S等[27]通過微衛(wèi)星標記基因分型，GBS分析和Tams1基因多態(tài)性分析，確定了泰勒蟲多種基因型的存在，揭示了寄生蟲和疫苗之間的遺傳和等位基因的多樣性，有助于確定新的疫苗目標和控制該疾病的政策。Katzer F等[28]研究表明，對DNA水平上44個多樣性等位基因Tams1進行克隆、測序和鑒別，對比出保守性、變異性和高變異區(qū)域，結(jié)果表明，序列的多樣性反映在抗原性中，在多肽性區(qū)域內(nèi)可變的糖基化位點和氨基酸表位的變化是蟲體適應外界環(huán)境所作出的改變，與蟲體入侵宿主細胞和免疫逃避有關(guān)，因此該基因疫苗應該注重多肽設計。

4 熱休克蛋白

從細菌到哺乳動物，熱休克蛋白廣泛存在于其體內(nèi)，發(fā)揮重要生理功能，主要負責調(diào)節(jié)細胞的應激能力。熱休克蛋白是伴侶蛋白，按照蛋白的分子大小分為5類，包括Hsp110、Hsp90、Hsp70、Hsp60和小分子熱休克蛋白。其中，最為重要的是Hsp70家族蛋白，Hsp70家族蛋白各分子量相近，序列具有高度保守性，在應激細胞中被高度誘導表達，具有保護機體和細胞的功能[32]。

環(huán)形泰勒蟲在入侵宿主時，蟲體因外界環(huán)境的改變發(fā)生應激反應，熱休克因子1(HSF1)和缺氧誘導因子1(HIF-1)協(xié)同誘導Hsp的高度表達，有助于蟲體在宿主內(nèi)更好的適應環(huán)境，使蟲體免疫逃逸宿主的檢測，Hsp和膜表面Hsp可以被抗原呈遞細胞表達的CD91+所識別，發(fā)揮免疫刺激作用，產(chǎn)生抗蟲體蛋白抗體，抵御環(huán)形泰勒蟲入侵[30]。Hsp70在每個生活階段都有表達，在裂殖體階段表達程度更高，蛋白合成后經(jīng)過加工具有活性。

另外，Hsp90蛋白在蟲體感染過程中發(fā)揮重大的作用。Sun H等[31]研究表明，Hsp90蛋白可以調(diào)節(jié)人紅細胞中的寄生蟲生長，維持寄生蟲的活力和增殖，在宿主細胞入侵以及生長和毒力中起重要的作用。Hsp90蛋白定位于表面，在寄生蟲中充當熱傳感器，可以增強寄生蟲的毒力，它的底物是激酶IKK，它可以降解轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的抑制劑，使轉(zhuǎn)錄因子NF-κB易位至細胞核，從而導致炎癥和細胞凋亡基因的激活[32]。Hsp90蛋白有4種亞型，每種亞型長度相差不大。Kinnarid J等[33]建立了系統(tǒng)發(fā)育樹，對感染環(huán)形泰勒蟲的轉(zhuǎn)化白細胞分析Hsp90亞型特征，確定了每種亞型的定位和格爾德霉素和衍生物17-AAG的作用，對17-AAG的抑制非常敏感。Guswanto A等[34]研究表明，格爾德霉素可以通過結(jié)合Hsp90降低寄生蟲的成活率，抑制泰勒蟲的正常繁殖，可以作為泰勒蟲的潛在藥物靶標。熱休克蛋白具有很好的抗原性，可以刺激宿主產(chǎn)生免疫應答，所以可作為治療和診斷本病的候選蛋白。

5 展望

目前，對于環(huán)形泰勒蟲免疫蛋白的研究已經(jīng)取得了良好進展，但是這些免疫蛋白用于檢測、診斷、治療和預防還處于起步階段。核酸和蛋白方面研究程度的加深，以及在結(jié)構(gòu)和功能上更加全面的了解，將為預防和治療環(huán)形泰勒蟲病提供新的途徑和方法。