葉俊賢，劉郁夫，馮夏寧，陳瑞愛*

(1.華農(nóng)(肇慶)生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院有限公司，肇慶 526238；2.華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院，廣州 510642；3.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學與技術(shù)廣東省實驗室肇慶分中心，肇慶 526238)

副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis，HPS)是一種呈短桿狀的革蘭氏陰性菌，屬于巴氏桿菌科嗜血桿菌屬成員，是引起豬革拉澤氏病(Glasser's disease)的病原。HPS寄生于健康豬的上呼吸道，正常情況下不發(fā)病，但在應激環(huán)境或與其他病毒性病原混合感染情況下，HPS可突破黏膜屏障，通過血液循環(huán)定植到其他內(nèi)臟器官，引起以呼吸道癥狀、胸腔和腹腔大量纖維素性物質(zhì)滲出、心包積液和關(guān)節(jié)炎為特征的呼吸道疾病[1]。HPS發(fā)病率高，病情嚴重時病死率可達50%，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失，是影響?zhàn)B豬業(yè)發(fā)展的重要細菌性病原之一。特別是在養(yǎng)殖業(yè)“減抗、禁抗”政策的大環(huán)境下，HPS引起的發(fā)病有上升趨勢[2]。

HPS的毒力因子眾多，致病機制復雜，針對毒力基因的作用和致病機制研究是熱點之一。已成功鑒定多個HPS毒力相關(guān)基因，并闡明其作用機制，如OMP P2蛋白、OMP P5蛋白、IgA蛋白酶、三聚體自轉(zhuǎn)運蛋白等[3-4]。近幾年，又陸續(xù)在HPS毒力相關(guān)的膜蛋白分子、毒力相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子以及致病機制研究方面取得新進展。本文擬對HPS毒力基因、病原與宿主之間相互作用等進行綜述，為HPS基礎(chǔ)研究、新型防控技術(shù)和新藥研發(fā)提供參考。

1 HPS毒力相關(guān)的膜蛋白分子

1.1 脂寡糖(lipooligosaccharide，LOS)

脂寡糖是HPS細菌外膜上的糖脂，與大腸埃希氏菌LPS的結(jié)構(gòu)和生物學功能相似，但缺失了O抗原亞基，因此稱為脂寡糖。HPS脂寡糖除了可誘導巨噬細胞產(chǎn)生炎性細胞因子，還在細菌吸附、侵入宿主細胞的過程中發(fā)揮重要作用[5]，LOS是HPS的重要毒力因子之一。

已經(jīng)證實，opsX、rfaF、waaQ和rfaE等4個庚酰轉(zhuǎn)移酶基因參與LOS的合成過程[6]。2016年Zhou Q等研究表明，HPS糖基轉(zhuǎn)移酶基因lgtB和lex-1的失活，均可引起HPS合成LOS的能力缺陷，并導致HPS的血清耐受能力和吸附豬上皮細胞的能力顯著低于親本株[7]。HPS ΔlgtF基因突變株導致形成截短型LOS，截短型LOS刺激巨噬細胞產(chǎn)生炎性細胞因子的mRNA水平顯著低于野生型LOS，進一步研究發(fā)現(xiàn)這種差異是兩種LOS對細胞NF-κB和MAPK信號通路的激活水平不同造成的[8]，也從側(cè)面驗證了HPS LOS可被宿主免疫細胞識別，在介導細胞炎性反應中發(fā)揮重要作用。Feng S等還從HPS基因組鑒定出一種磷酸葡萄糖變位酶(HAPS-0849)，該蛋白具有磷酸葡萄糖變位酶活性，該基因失活可能阻斷細菌合成1-磷酸葡萄糖，進而影響GalU的功能，導致LOS合成受阻[9]。

除了LOS合成相關(guān)的上游基因，翻譯后修飾過程也對LOS發(fā)揮完整的生物學功能至關(guān)重要。其中HPS α-2,3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因(lsgB)介導HPS LOS的唾液酸化過程，該基因突變可導致HPS吸附細胞的能力下降，對小鼠的致病力減弱。

1.2 莢膜

莢膜多糖是HPS一種重要的毒力因子，在吸附宿主細胞、逃逸宿主免疫反應方面起著關(guān)鍵作用。將參與合成莢膜多糖的基因capD缺失，可使HPS致病菌株SH0165對補體介導的殺傷作用更加敏感，且導致細菌毒力下降[10]。Eberle K C等將參與合成莢膜多糖的基因簇缺失，構(gòu)建HPS莢膜突變株，通過體內(nèi)外試驗證實，莢膜突變導致HPS抵抗豬肺泡巨噬細胞吞噬能力的顯著致弱，在豬鼻腔的定殖能力較親本株弱[11]。HS069Δcap僅能激起微弱的體液免疫反應，且不能保護強毒攻毒。

莢膜還是HPS重要的免疫原性組分，有人比較豬肺泡巨噬細胞對不同HPS菌株的識別能力，選擇血清5型HPS菌株制備莢膜粗提取物(crude capsular extract，cCE)。cCE除了具有與特異性抗體結(jié)合的能力，還可誘導機體產(chǎn)生較高的特異性抗體和促炎性細胞因子水平，具有成為新型亞單位疫苗的潛力[12]。

1.3 其他膜蛋白

OMP P2是HPS外膜表面成分最豐富的膜蛋白，在維持細胞膜完整性和通透性發(fā)揮重要作用，還可參與病原與宿主之間的相互作用，但OMP P2蛋白哪些表面環(huán)狀結(jié)構(gòu)是參與宿主識別過程的重要功能域仍然未知。Zhou Y等通過合成肽刺激巨噬細胞試驗結(jié)合HPS缺失株構(gòu)建，明確了OMP P2 L7和L8是主要刺激機體產(chǎn)生炎性細胞因子的表面環(huán)狀結(jié)構(gòu)，并證明該作用是通過激活NF-κB信號通路引起的[4]。

VacJ是一種細菌外膜上的脂蛋白，參與多種病原菌的致病過程。HPSvacJ基因突變使細菌的細胞完整性受到破壞，并伴隨著HPS細菌形態(tài)的改變以及HPS對SDS、滲透壓和氧化應激的敏感性增加，ΔvacJ對Balb/c小鼠的半數(shù)致死劑量較親本株上升15倍[13]。VacJ重組蛋白具有較強的免疫原性，能誘導免疫豬產(chǎn)生較高的抗體水平和提高產(chǎn)γ干擾素細胞的數(shù)量，但同樣也不能保護強毒攻毒[14]。

三聚體子轉(zhuǎn)運蛋白家族成員(virulence associated trimeric autotransporters，VtaA)在HPS細胞膜表面組成了細菌五型分泌系統(tǒng)，參與病原與宿主之間的互作，所有VtaA蛋白都具有與黏附素、血凝素和侵襲素結(jié)合的特殊結(jié)構(gòu)域。Costa H M等利用大腸埃希氏菌體外表達，并鑒定VtaA2的生物學功能，發(fā)現(xiàn)VtaA2有助于細菌對塑料、黏蛋白、BSA、纖維連接蛋白和膠原的吸附作用[15]，且中央膠原結(jié)構(gòu)域是其發(fā)揮功能的主要結(jié)構(gòu)域。

Jiang R等[16]系統(tǒng)分析了HPS生物被膜的成分以及形成的動態(tài)過程，通過轉(zhuǎn)錄組測序分析篩選出最可能與細菌定植和吸附相關(guān)的基因(artM、artQ、ssrS、pflA和HutX)，這些基因主要參與生物合成的二級代謝、ABC轉(zhuǎn)運系統(tǒng)、淀粉和蔗糖代謝等細菌生物學過程，為深入研究HPS調(diào)控生物被膜形成的機制提供基礎(chǔ)。

新型亞單位疫苗的研制是HPS疫苗研究的熱點，而針對HPS膜蛋白的研究將有助于充分認識這些膜蛋白的生物學功能將為疫苗研究提供參考。盡管大多數(shù)HPS膜蛋白具有較強的免疫原性，但攻毒保護試驗結(jié)果往往不理想，其中佐劑成分可能是影響HPS重組蛋白疫苗的效力關(guān)鍵組分[17]。

2 毒力相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控分子

二元調(diào)控系統(tǒng)CpxRA和CheY/QseC參與調(diào)節(jié)多種致病菌的環(huán)境適應性和細菌毒力。Cao Q等研究顯示，cpxR基因突變導致HPS對氧化應激、滲透壓應激、酸性環(huán)境和大環(huán)內(nèi)酯類藥物的敏感性改變，通過RT-PCR鑒定出2個編碼藥物外排泵基因的表達下調(diào)[18]。QseC是二元調(diào)控系統(tǒng)CheY/QseC的組氨酸蛋白激酶，在系統(tǒng)中負責將外界刺激信號轉(zhuǎn)導至胞內(nèi)，He L等構(gòu)建HPSΔqseC突變株同樣表現(xiàn)出對應激環(huán)境耐受能力、鐵離子攝取能力和生物被膜合成能力下降的表型[19]，但CpxR和QseC作用的機制和靶點仍需進一步研究。

OxyR屬于LysR樣蛋白家族成員，N段具有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，是介導細菌抵抗氧化應激作用的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，可直接激活銅綠假單胞菌過氧化物降解酶的表達[20]。HPSΔoxyR突變株的生長速度和生物被膜形成能力被顯著抑制。原核轉(zhuǎn)錄組測序顯示，ΔoxyR突變株466個差異表達基因主要參與氧化應激、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA復制與修復等生物學功能[21]，但對OxyR的直接作用機制尚未解析。

密度感應系統(tǒng)LuxS/AI-2是一種細菌間重要的信號交流方式，已證明在多種致病菌中參與影響毒力。HPSΔluxS突變株產(chǎn)生顯著低于親本株的AI-2信號分子水平，顯著影響HPS對氧化應激和熱應激環(huán)境的耐受能力，并導致HPS對小鼠的致病力下降10倍[22]。

cAMP受體蛋白(cAMP receptor protein，CRP)是一種重要的全局性調(diào)控子，在感染過程中調(diào)節(jié)細菌對環(huán)境的適應性。Jiang C等研究顯示，crp基因參與調(diào)節(jié)HPS對高滲透壓環(huán)境的適應能力、對血清抗性、鐵離子攝取能力和生物被膜合成能力，但crp基因與HPS細菌毒力之間的關(guān)系仍然未知[23]。

隨著基因組學數(shù)據(jù)不斷完善，通過同源基因的比對可不斷挖掘HPS毒力相關(guān)基因，針對HPS轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的研究也逐漸增多。Zhou Y Y等通過比較HPS強弱毒株之間的轉(zhuǎn)錄組差異表達基因，篩選出10個影響細菌磷酸化系統(tǒng)和ABC轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的基因可能參與HPS的致病過程[24]。

3 HPS與宿主的相互作用

3.1 HPS與天然免疫信號通路

HPS感染引起全身性炎癥反應，以胸腹腔滲出大量纖維素性物質(zhì)為主要特征。HPS感染可上調(diào)趨化因子RANTES的表達，并且這種上調(diào)作用依賴于NF-κB信號通路和JNK信號通路的激活[25]。通過流式細胞技術(shù)發(fā)現(xiàn)感染HPS豬表達TLR2、Siglecs和CD163細胞表面受體的外周血單核細胞數(shù)量顯著增加，表明機體在募集白細胞參與抗細菌感染過程中發(fā)揮積極作用[26]。研究表明，HPS多胺轉(zhuǎn)運蛋白PotD可通過激活TLR4信號通路，進而激活NF-κB和JNK信號通路以促進巨噬細胞分泌促炎性細胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達，并可通過相應的阻斷劑抑制促炎性細胞因子的上調(diào)作用[27]。這些研究說明，HPS感染對NF-κB和JNK信號通路有激活作用，并引起下游炎性細胞因子的表達。

HPS除了可激活細胞表面的病原相關(guān)模式識別受體，胞內(nèi)的模式受體(NOD1/2)也參與識別HPS。Ma B等研究發(fā)現(xiàn)，HPS感染可上調(diào)PK-15細胞NOD2的表達和RIP2的磷酸化水平，且HPS破碎上清、LPS和肽聚糖參與了該過程，繼而激活下游NF-κB信號通路的活化以及細胞因子CCL4、CCL5和IL-8的表達[28]。

3.2 HPS與細胞程序性死亡

在HPS感染豬氣管細胞的試驗中，觀察到豬氣管細胞以caspase-3依賴的方式引起細胞凋亡；在PK-15細胞和豬肺泡巨噬細胞發(fā)現(xiàn)，HPS細胞致死膨脹毒素CtdB引起細胞周期阻滯和p53依賴的細胞凋亡。但HPS其他成分是否可導致細胞凋亡仍然未知。

細胞自噬是指在自噬相關(guān)基因的調(diào)控下,利用溶酶體降解自身受損的細胞器及大分子物質(zhì)的過程。Shen Y等用不同毒力的HPS侵染豬肺泡巨噬細胞系3D4/21，發(fā)現(xiàn)HPS誘導細胞自噬水平與侵入細胞的活細菌數(shù)密切相關(guān)[29]。Yue C等也獲得類似的結(jié)果，通過激光共聚焦、Western blot和透射電鏡證明HPS感染可增強PK-15細胞自噬信號流表達，并利用自噬小體清除體內(nèi)侵入的細菌，抑制炎癥反應避免對機體的損傷[30]，提示細胞自噬是一種抑制細菌感染的機體防御機制。

3.3 HPS與Wnt/β-catenin信號通路

HPS感染宿主引起內(nèi)臟器官急性炎癥反應和廣泛性的纖維素性滲出物，但其分子致病機制尚未完全清楚。Wnt/β-catenin信號通路在調(diào)節(jié)動物胚胎的早期發(fā)育、器官形成、組織再生和其他生理過程中具有至關(guān)重要的作用[31]。Hua K等通過體內(nèi)外研究表明，HPS感染可激活Wnt/β-catenin信號通路，上調(diào)β-catenin的表達[32]，進而導致上皮細胞間隙間E-鈣黏蛋白降解，引起上皮細胞通透性的改變，造成纖維素性物質(zhì)從血管淋巴管中滲出。繼續(xù)對Wnt/β-catenin信號通路的上、下游調(diào)控網(wǎng)絡進行研究，證實P38-MAPK通路通過阻礙DKK-1(Wnt/β-catenin信號通路抑制劑)的表達，促進Wnt/β-catenin的活化[33]，而β-catenin則通過其靶基因(豬環(huán)氧合酶-2，COX-2)間接導致NF-κB活性的下降[34]。

4 展望

HPS毒力因子多且復雜，在篩選毒力相關(guān)蛋白的作用靶點時，只能依靠有限的文獻資料，并且常常得到陰性結(jié)果，因此針對HPS毒力基因的作用機制研究往往比較淺顯，大多只進行表型試驗，缺乏深入探討。近些年基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、代謝組等組學技術(shù)得到快速發(fā)展，應用這些新技術(shù)將極大推動HPS毒力因子研究的發(fā)展。并且隨著人們不斷拓寬在細胞信號轉(zhuǎn)導領(lǐng)域的認識，也將有助于進一步剖析HPS的分子致病機制，為將來HPS新型防控技術(shù)和新藥研發(fā)提供參考。

疫苗和藥物治療仍然是現(xiàn)階段防控HPS的主要手段。但使用的傳統(tǒng)滅活疫苗對不同血清型，甚至同一血清型不同菌株的野毒株保護效果不佳；新研制的由單個重組蛋白制備而成的HPS亞單位疫苗往往不足以提供足夠的免疫保護力。因此，篩選多個免疫原性強的抗原蛋白、優(yōu)化抗原蛋白生產(chǎn)的工藝和技術(shù)、篩選表現(xiàn)優(yōu)異的免疫佐劑將是未來HPS疫苗研究的重要方向。