詹經(jīng)緯 童津津* 熊本海 蔣林樹

(1.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，奶牛營養(yǎng)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

傳統(tǒng)檢測乳汁中病原體的方法是細(xì)菌培養(yǎng)，然而此方法對25%的臨床乳腺炎樣本和30%的隱型乳腺炎樣本檢測不出病原體[1]，因此奶牛乳腺炎的分子診斷技術(shù)越來越受到學(xué)者們的關(guān)注。近幾年，16S rRNA高通量測序分析為評估乳汁中微生物的多樣性和豐度提供了相對快速有效的方法，并有助于病原體的發(fā)現(xiàn)和鑒定[2]。研究發(fā)現(xiàn)健康奶牛常乳中存在核心菌群，并且泌乳階段和胎次不同的奶牛，其乳汁中核心菌群存在顯著差異[2-3]。據(jù)報(bào)道，影響乳汁微生物區(qū)系變化的因素有多種，包括奶牛的主要組織相容性復(fù)合物(BoLA)基因突變、亞急性瘤胃酸中毒導(dǎo)致的代謝紊亂、飼養(yǎng)方式不同及乳腺炎的發(fā)生均會導(dǎo)致乳汁中微生物區(qū)系改變[4-7]。值得注意的是，乳汁微生物區(qū)系有較強(qiáng)的自我調(diào)節(jié)能力，單一的外源性因素如抗生素的使用不會對乳汁中微生物區(qū)系造成顯著持久的影響[7-8]。本文將圍繞以上主題，結(jié)合近幾年國內(nèi)外研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 乳汁中微生物的來源

哺乳動(dòng)物的乳汁對幼仔意義重大，不僅是完整能量的來源，還包括一系列生物活性物質(zhì)，調(diào)節(jié)幼仔的免疫穩(wěn)態(tài)，為進(jìn)入充滿微生物的外部環(huán)境做準(zhǔn)備[9-10]。傳統(tǒng)上認(rèn)為健康乳區(qū)的乳汁是無菌的[11]，乳腺內(nèi)部物質(zhì)(尤其是乳汁)中微生物群落的定植是環(huán)境污染物通過乳頭管(teat canal，TC)導(dǎo)致的[12]，而且聯(lián)合國糧食組織及農(nóng)業(yè)組織在1990年也表明，分泌到奶牛乳腺中的乳汁是無菌的[13]。然而，這些結(jié)論源于細(xì)菌培養(yǎng)的方法，既耗時(shí)又無法真正檢測出代表性的微生物群落[1]。目前，基于16S rRNA高通量測序分析乳汁中微生物群落結(jié)構(gòu)的研究結(jié)果表明，乳汁中含有豐富的微生物群落[1,14-16]，而且乳腺內(nèi)良好的溫度條件和豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，十分有利于微生物的生長[10]。

雖然人們普遍認(rèn)為乳汁中的微生物來源于乳腺皮膚或者幼畜口腔，但一種新見解提出某些乳汁細(xì)菌能通過內(nèi)源性途徑到達(dá)乳腺[13,17-18]。對于人類和嚙齒動(dòng)物，機(jī)體中存在腸-乳腺途徑，可以將細(xì)菌從腸道轉(zhuǎn)移至乳腺[19]，這種假設(shè)表明腸-乳腺之間存在內(nèi)源性途徑，腸道樹突狀細(xì)胞(intestinal dendritic cells，DC)和巨噬細(xì)胞將活細(xì)菌內(nèi)化后，通過淋巴和外周血循環(huán)轉(zhuǎn)移到乳腺。盡管DC和巨噬細(xì)胞通常會在被吞噬的細(xì)菌降解之前遷移到淋巴樣組織(例如脾臟和淋巴結(jié))[20]。也有人提出，在母乳中有來自腸道相關(guān)淋巴組織中的樹突狀細(xì)胞，它們捕獲管腔微生物區(qū)系，然后將這些微生物輸送到乳腺[17]。但反芻動(dòng)物的泌乳生理不同，它們的乳腺免疫系統(tǒng)和腸道免疫系統(tǒng)之間的聯(lián)系較差，局部免疫的大多數(shù)淋巴細(xì)胞都來自外周淋巴結(jié)而不是黏膜部位(如腸道黏膜)[21]。某些病原體可通過血源性和淋巴轉(zhuǎn)移的內(nèi)源性途徑引起乳腺內(nèi)感染(intramammary infections，IMI)[22]。值得注意的是，同時(shí)檢測出乳汁、身體組織和淋巴結(jié)中的同一種病原體，不能完全證明這些病原體導(dǎo)致的IMI是由內(nèi)源性途徑引起的[22]。同樣，檢測出奶牛糞便、體細(xì)胞和血液白細(xì)胞中的某些腸道相關(guān)細(xì)菌，不能完全證實(shí)奶牛中腸道細(xì)菌遷移到乳腺的假設(shè)，但可以合理推測某些細(xì)菌可以通過循環(huán)中的白細(xì)胞進(jìn)入乳腺[13]。

2 不同類型乳汁微生物區(qū)系的特點(diǎn)

2.1 健康乳汁及乳腺炎乳汁

從“生態(tài)”的角度來看，哺乳動(dòng)物是一個(gè)由各種生態(tài)器官組成的復(fù)雜生態(tài)系統(tǒng)[23]，這些生態(tài)器官都具有獨(dú)特專一的微生物結(jié)構(gòu)，它們各自獨(dú)立卻又相互作用，共同協(xié)調(diào)機(jī)體的微生物定植[24]。通過對不同微生物區(qū)系特征的乳汁分析，共同的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與健康乳汁相比，乳腺炎發(fā)生時(shí)乳汁中的微生物菌群多樣性顯著降低[1-3,5，16]。Oikonomou等[2]發(fā)現(xiàn)，根據(jù)微生物區(qū)系特征很容易區(qū)分健康、隱性乳腺炎或臨床乳腺炎奶牛的生物學(xué)樣本，并且這3種乳汁樣本中都含有豐富的特有微生物群落。在所有健康牛乳中都檢測出了糞桿菌屬、毛螺菌科中的某種菌屬、丙酸菌屬和好氧芽孢桿菌屬。隨著體細(xì)胞數(shù)(SCC)升高，鞘氨醇菌屬(Sphingobacterium)和鏈球菌屬(Streptococcus)的豐度增加，而奴卡氏菌屬(Nocardiodes)和類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)的豐度降低；也有研究表明，健康乳汁中豐度較高的菌群為假單胞菌屬(Pseudomonas)、嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)和雷爾氏菌屬(Ralstonia)[25]。Tong等[16]的研究結(jié)果表明，乳腺炎奶牛的乳汁中微生物菌群與健康奶牛存在顯著差異，乳腺炎組鏈球菌屬(Streptococcus)的豐度顯著高于健康組，而變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)和酸桿菌門(Acidobacteria)豐度顯著低于健康組。Wang等[26]也檢測出隱性乳腺炎奶牛乳汁中放線菌門、擬桿菌門(Bacteroidetes)和螺旋體門(Spirochaetes)的豐度相對于健康組顯著升高，臨床乳腺炎奶牛乳汁中的厚壁菌門(Firmicutes)豐度顯著升高。

根據(jù)這些研究結(jié)果可以得出，健康乳汁中含有大量“核心菌群”，但沒有炎癥反應(yīng)和多形核中性粒細(xì)胞(PMN)趨化性的表現(xiàn)，說明乳腺的免疫細(xì)胞將這些細(xì)菌識別為“自我”。雖然乳房鏈球菌和金黃色葡萄球菌被認(rèn)為是導(dǎo)致乳腺炎的病原體，但在一些低、中SCC的牛乳中也有少量存在，因此可以假設(shè)這些細(xì)菌是乳腺正常菌群的一部分[27]。若這是2種細(xì)菌主導(dǎo)菌群引發(fā)的乳腺炎，可認(rèn)為是一種菌群失調(diào)，而不是簡單的原發(fā)感染[2]。此外，丙酸桿菌屬(Propionibacterium)和乳桿菌屬(Lactobacillus)是大多健康乳汁中最常見的菌，它可能在機(jī)體的先天免疫中發(fā)揮作用，抑制金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)等主要的乳腺炎病原體[3]。值得注意的是，研究發(fā)現(xiàn)隱型乳腺炎和臨床乳腺炎中最常見的細(xì)菌為鞘氨醇單胞桿菌，并且它的比例增加與SCC升高有強(qiáng)相關(guān)性[8]，因此推測鞘氨醇單胞桿菌是導(dǎo)致乳腺炎的一種潛在菌屬。綜上所述，健康奶牛乳汁中微生物多樣性豐富，既包含有益共生菌也包含少量致病菌。當(dāng)單一菌屬大量增殖“占領(lǐng)”乳腺，則標(biāo)志著乳腺炎的發(fā)生，伴隨著乳汁中微生物多樣性降低以及其他菌種豐度減少。

2.2 初乳及不同胎次乳汁

初乳在生命的初期發(fā)揮關(guān)鍵作用，支持新生兒的生長和健康。初乳不僅營養(yǎng)豐富，還含有生長因子和有益的微生物等，如被廣泛用作益生菌的雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)和乳桿菌屬(Lactobacillus)[28]。初乳轉(zhuǎn)變?yōu)槌Ｈ榈倪^程中伴隨著免疫成分和代謝物的變化，這可能導(dǎo)致乳汁中微生物區(qū)系的改變。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，初乳具有高度多樣化和豐富的微生物群落，最常見的6種菌門為厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、放線菌門、梭桿菌門和軟皮菌門，其中最豐富的菌屬為葡萄球菌屬(Staphylococci)[3]。健康奶牛初乳中軟皮菌門(Tenericutes)和梭桿菌門(Fusobacteria)以及梭桿菌屬(Fusobacterium)和支原體屬(Mycoplasma)豐度顯著高于乳腺炎奶牛初乳中的豐度，且菌群多樣性也更豐富[3]。此外，研究發(fā)現(xiàn)不同胎次的奶牛初乳菌群結(jié)構(gòu)存在顯著不同，初產(chǎn)牛比經(jīng)產(chǎn)牛初乳菌群更豐富，其中厚壁菌門豐度要高的多，而經(jīng)產(chǎn)奶牛初乳中的梭桿菌門豐度更高。并且發(fā)現(xiàn)最終發(fā)展為乳腺炎的初乳菌群多樣性，顯著低于產(chǎn)后30 d仍然健康的初乳[3]。這表明初乳中菌群多樣性的高低與乳腺炎的發(fā)生密切相關(guān)。據(jù)報(bào)道，奶牛對不同的非金黃色葡萄球菌(NAS)引起的乳腺內(nèi)感染(IMI)敏感性不同，并且與胎次和泌乳階段密切相關(guān)[29]。有學(xué)者對加拿大某牛群進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)色葡萄球菌(Staphylococcuschromogenes)和模仿葡萄球菌(Staphylococcussimulans)在初產(chǎn)奶牛中更常見，而表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)在經(jīng)產(chǎn)牛乳中更普遍[30]。初乳中微生物區(qū)系與常乳不同的原因可能是產(chǎn)前免疫球蛋白G(IgG)在乳汁中積累，產(chǎn)后乳汁中IgG含量快速下降，IgG可以通過結(jié)合特定表面位點(diǎn)和補(bǔ)體激活來滅活細(xì)菌抗原[5]，因此產(chǎn)后乳汁抑制病原菌的能力降低；并且一些代謝物如乳寡糖含量也顯著降低，它能與微生物競爭附著在上皮細(xì)胞的受體，進(jìn)一步影響微生物的定植[5]。但為何某些細(xì)菌在初產(chǎn)牛的乳汁中更為常見，它們定植的具體機(jī)理是什么，還需要進(jìn)一步的研究。

3 乳汁中微生物群落的影響因素

乳腺對微生物定植和防御機(jī)制受多種因素的調(diào)節(jié)，主要為奶牛的基因型，特別是編碼先天性和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)各個(gè)組成部分的基因[31]，奶牛代謝失衡[6,32]及抗生素的使用等[7-8,33-34]。上述每個(gè)因素在調(diào)節(jié)乳腺免疫穩(wěn)態(tài)和對IMI的抵抗中都起著重要作用，因此對乳汁微生物群的組成有直接或間接影響[5-8,32-34]。

3.1 基因型及環(huán)境因素

機(jī)體為各種微生物的生長提供了營養(yǎng)和生長環(huán)境，同時(shí)微生物群落也為機(jī)體執(zhí)行一些重要的生理功能[35]。然而，一些機(jī)會型病原菌在某些情況下影響微生物區(qū)系，擾亂機(jī)體的免疫動(dòng)態(tài)平衡，激活炎癥反應(yīng)[36]。為了應(yīng)對這種持續(xù)不斷的挑戰(zhàn)，維持促炎和抑炎之間的平衡，哺乳動(dòng)物的免疫系統(tǒng)已經(jīng)采用了特定的機(jī)制區(qū)分共生菌、機(jī)會型病原菌和絕對病原菌[5]。例如主要組織相容性復(fù)合體(MHC)基因Ⅱ類區(qū)域的多態(tài)性，在牛中也稱BoLA基因[37]。它的某些等位基因變異可以影響T淋巴細(xì)胞受體的多樣性，從而觸發(fā)其更廣泛的抗原免疫反應(yīng)的能力，而影響微生物的定植[38]。此外，有學(xué)者對BoLA基因變異的奶牛第1周乳汁進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)BoLA基因的多態(tài)性對第0天初乳的變化影響最大，此后逐漸消退，這與初乳到常乳過程中IgG的含量變化相一致；并且每個(gè)BoLA亞型的初乳中，通過分泌抗菌肽從而發(fā)揮定植抗性的細(xì)菌均富集[5]，提示BoLA基因多態(tài)性在調(diào)節(jié)奶牛初乳微生物區(qū)系組成方面具有潛在的作用。因此，確定這種基因型介導(dǎo)的乳汁中微生物區(qū)系的變化是由免疫系統(tǒng)直接調(diào)節(jié)的，還是由微生物衍生的定植抗性間接調(diào)節(jié)的，對未來防治乳腺炎具有重要的意義。

乳汁中微生物區(qū)系作為一個(gè)表型性狀，除了受基因控制，必定受到環(huán)境的影響。近幾年，由于生產(chǎn)的集約化，乳制品行業(yè)面臨微生物多樣性減少、細(xì)菌耐藥性等問題。為了恢復(fù)農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的自我調(diào)節(jié)能力，全球各地都大力推廣有機(jī)農(nóng)業(yè)。與傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)相比，有機(jī)農(nóng)業(yè)禁止使用人工肥料、殺蟲劑和除草劑，并限制抗生素的使用[29]。這是否會對牛乳中微生物區(qū)系造成影響？針對這一問題，Gomes等[4]研究表明，有機(jī)農(nóng)場與傳統(tǒng)農(nóng)場奶牛的乳汁中微生物區(qū)系的真菌差異顯著，特別是座囊菌綱(Dothideomycetes)、銀耳綱(Tremellomycetes)和格孢腔菌目(Pleosporales)。這可能是化學(xué)原料及抗生素的限制，從而導(dǎo)致奶牛乳汁微生物區(qū)系改變。此外，不同的飼養(yǎng)方式對乳汁微生物區(qū)系也會產(chǎn)生一定的影響，雖然對于室內(nèi)飼養(yǎng)的奶牛，擠奶前乳頭消毒對乳汁微生物區(qū)系沒有顯著影響，但在室外放牧季節(jié)，接受消毒處理的奶牛乳汁微生物區(qū)系比未消毒組更加豐富[39]；此外，在取樣前進(jìn)行乳頭消毒的奶牛，與室內(nèi)飼養(yǎng)相比，室外放牧的奶牛乳汁微生物區(qū)系存在較高比例的假單胞菌屬和不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)[39]。而在另一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)，與奶牛胎次和SCC等因素相比，臥床對乳汁微生物區(qū)系的影響最大。相對于沙子和鋪墊材料的臥床，使用秸稈墊料臥床的奶牛乳汁細(xì)菌豐度較低，且檢測出的變形桿菌豐度也更高。因此，飼養(yǎng)管理因素對奶牛乳汁中的微生物群落結(jié)構(gòu)起到重要作用[29]。

3.2 代謝失衡

熱應(yīng)激導(dǎo)致的代謝失衡、圍產(chǎn)期能量負(fù)平衡等都會造成奶牛血液中免疫指標(biāo)和代謝產(chǎn)物的變化，發(fā)生免疫抑制，代謝紊亂，導(dǎo)致機(jī)體清除病原菌的能力下降，這與乳汁中的微生物群落結(jié)構(gòu)變化具有直接聯(lián)系。例如，亞急性瘤胃酸中毒(SARA)是一種因長期飼喂高精料而引起的代謝紊亂，導(dǎo)致瘤胃和后腸中微生物群失調(diào)[40]。有研究表明，SARA與初產(chǎn)奶牛的初乳中機(jī)會型細(xì)菌的豐度增加呈正相關(guān)，包括嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)、副乳房鏈球菌(Streptococcusparauberis)和缺陷短波單胞菌(Brevundimonasdiminuta)[32]，說明SARA的奶牛患乳腺炎風(fēng)險(xiǎn)較高。胡曉宇[6]也發(fā)現(xiàn)，奶牛發(fā)生SARA后，乳汁和瘤胃中的微生物菌群更加相近，且兩者的寡氧單胞菌屬(Stenotrophomonas)豐度顯著上升。并且，與健康奶牛相比，SARA的奶牛感染金黃色葡萄球菌后乳成分變化更加明顯，乳汁中金黃色葡萄球菌豐度更高[6]，說明SARA弱化了奶牛乳腺組織對病原菌的清除能力。有研究表明，SARA期間菌群變化可能是由于機(jī)體調(diào)節(jié)免疫穩(wěn)態(tài)導(dǎo)致的，當(dāng)SARA發(fā)生后，胃腸道上皮屏障損壞導(dǎo)致游離的脂多糖(LPS)轉(zhuǎn)移到血液和淋巴系統(tǒng)，并與脂多糖結(jié)合蛋白(LPS-binding proteins，LBP)結(jié)合，形成LPS-LBP免疫調(diào)節(jié)復(fù)合物，復(fù)合物再通過血液或淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到乳腺等局部激活促炎反應(yīng)[41]。而且，SARA導(dǎo)致乳汁中炎性細(xì)胞因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和血清淀粉樣蛋白含量顯著升高，這表明血乳屏障受到損害，增加乳腺炎發(fā)生的概率[6]。但是，SARA期間是否存在細(xì)菌從胃腸道到乳腺的遷移，具體作用途徑還需要進(jìn)一步研究。

3.3 抗生素的使用

雖然大量研究已經(jīng)證實(shí)了各種抗生素在消除或控制主要乳腺炎病原體方面的有效性，但關(guān)于抗生素對乳腺微生物區(qū)系的影響相關(guān)報(bào)道較少[29]。Ganda等[7]通過對奶牛2個(gè)乳區(qū)內(nèi)注射大腸桿菌(Escherichiacoli)誘導(dǎo)奶牛發(fā)生乳腺炎，接著對一個(gè)感染乳區(qū)注射頭孢噻呋鈉進(jìn)行治療，對另一個(gè)感染乳區(qū)注射生理鹽水作為對照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)感染大腸桿菌后乳汁中主導(dǎo)菌群由反芻球菌科(Ruminococcaceae)轉(zhuǎn)變?yōu)槟c桿菌科(Enterobacteriaceae)，隨著時(shí)間推移，乳汁中腸桿菌科豐度減少，微生物多樣性恢復(fù)，且隨著乳腺炎癥狀的消退。而試驗(yàn)期間，抗生素并沒有加速腸桿菌科豐度，也沒有顯著恢復(fù)乳汁微生物的多樣性。另一個(gè)有趣的發(fā)現(xiàn)為，健康乳區(qū)長時(shí)間注射頭孢噻呋鈉并不會對乳汁微生物群產(chǎn)生持久的影響[7]。因此，學(xué)者們推測乳腺內(nèi)微生物群具有較強(qiáng)的自我調(diào)節(jié)能力，能夠在感染環(huán)境型病原體導(dǎo)致微生物區(qū)系劇烈變化后自我恢復(fù)；同時(shí)，在接受廣譜抗生素如第3代頭孢菌素注射后，微生物區(qū)系依然表現(xiàn)出多樣性和穩(wěn)定性，說明乳汁中微生物區(qū)系受到動(dòng)物機(jī)體嚴(yán)格的調(diào)控。

此外，干奶?？咕委?antimicrobial dry cow therapy，DCT)是控制乳腺炎的關(guān)鍵部分，旨在消除現(xiàn)有的IMI，并防止在泌乳期出現(xiàn)新的感染。研究發(fā)現(xiàn)，牛干奶期前和經(jīng)過DCT的初乳微生物區(qū)系有高度的共性，并且都有高比例的乳腺炎病原菌和機(jī)會型病原菌，如葡萄球菌屬、腸桿菌科和棒狀桿菌屬等[8]。Biscarini等[42]也表明，對干奶期奶牛不同乳區(qū)分別注射乳頭密封劑和抗生素，對照乳區(qū)不做任何處理。結(jié)果顯示產(chǎn)后5 d內(nèi)乳汁中變形桿菌門、厚壁菌門和放線桿菌門在所有乳區(qū)中都有較高豐度，對照組與試驗(yàn)組之間微生物區(qū)系的α和β多樣性指數(shù)沒有顯著差異，說明抗生素治療干奶期奶牛對乳汁微生物區(qū)系沒有顯著影響。這些結(jié)果一方面說明了干奶期抗生素治療對乳汁微生區(qū)系的改變有限，乳汁中微生物區(qū)系在長期接觸抗生素后具有較強(qiáng)的“彈性”[42]；另一方面說明乳汁中微生物區(qū)系受到機(jī)體嚴(yán)格的調(diào)控[7]。因此，在奶牛生產(chǎn)中應(yīng)有目的地使用抗生素，乳汁微生物區(qū)系有較強(qiáng)的自我調(diào)節(jié)能力[7]，某些病原菌主導(dǎo)菌群導(dǎo)致的乳腺炎可以自我清除，無需乳腺內(nèi)抗生素治療。

4 小 結(jié)

健康奶牛的乳汁及初乳中具有豐富的微生物多樣性和特殊的微生物區(qū)系，且初產(chǎn)牛的初乳中微生物多樣性更高。而乳腺炎奶牛的乳汁中微生物多樣性顯著降低，伴隨著某些菌屬的比例顯著變化。此外，奶?；蛐筒煌⒋x紊亂、飼養(yǎng)管理?xiàng)l件的差異均會導(dǎo)致乳汁中微生物區(qū)系的改變。然而這些變化的菌屬具體包括哪些菌種，它們在機(jī)體中發(fā)揮何種生物學(xué)功能，對乳腺健康發(fā)揮什么作用并不清楚。接下來的研究中，結(jié)合菌屬功能得到某些標(biāo)志性菌屬來指示乳腺健康，是一項(xiàng)很有研究意義的課題。此外，能否通過培育特定基因型奶牛、改變飼養(yǎng)方式等非治療性手段改善乳汁菌群結(jié)構(gòu)，從而提高奶牛乳腺健康也值得進(jìn)一步探索。